Universidade Estadual Paulista

Instituto de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Disciplina de Teoria e Métodos de Separação, Isolamento e Purificação
de Compostos Orgânicos

Trabalho Final

Meri Emili e Teresinha Aguiar

Araraquara, 2010.
 Fonte: Google imagens

Florotaninos
A cromatografia líquida de
extratos de algas
 Florotaninos 3

Levantamento bibliográfico
Artigos publicados 2000-2010
Técnicas de cromatografia Líquida
Florotaninos

Web of science
Scirus
Scienfinder
Google acadêmico (21 artigos e um capítulo de livro)
 Florotaninos 4

Florotaninos
Aspectos gerais Aspectos químicos
• São essencialmente produtos • São oligômeros e polímeros do
de origem vegetal; 1,3,4 triidroxibenzeno.
• Ocorrem em algas pardas e
são considerados equivalentes
funcionais de taninos
terrestre;
• Comumente, pode variar entre
5 e 15 % da massa de seca de
alga.
Aspectos biológicos

• São potenciais agentes antioxidantes atuando fortemente em reações

redox nas algas.

(KOIVIKKO, et. al., 2007)

oExtração
oCromatografia em camada delgada analítica
oCromatografia em coluna
oHPLC - Análise qualitativa
oHPLC – Análise Quantitativa
oHPLC - Preparativa
 Florotaninos 6

Extração
• São comumente extraídos do material vegetal com extratores hidroalcóolicos.

• Sendo a acetona à 70% mais eficiente .

A acetona inibe as
interações entre os
taninos e as proteínas
durante a extração ou
até mesmo quebram
as ligações de
hidrogênio.

(JULKAISUJA; TURKUENSIS, 2008)

 Florotaninos 7

Extração
• Phlorotaninos são propensos à oxidações rápidas.
• Redução da temperatura;
• Adição de ácido ascórbico atua como antioxidante. Cerca de
0.3% (m/v) tem garantido um aumento nas concentrações
finais de extração (KOIVIKKO, et. al., 2007).

• Quantidade de amostra.

(JULKAISUJA; TURKUENSIS, 2008)

 Florotaninos 8

Extração
• Repetições de extração

Large: 200mg
Small: 30-20 mg
CWB: Cell-wall-bound

(JULKAISUJA; TURKUENSIS, 2008)

 Florotaninos 9

Extração

Ressuspensão em água
 Florotaninos 10

Cromatografia em Camada delgada e

Cromatografia em coluna
Identificação e Isolamento de Florotaninos
 Florotaninos 11

Extrato de florotaninos Reveladores:

 Substancias antioxidante
FE: Silica Gel 60 F254, 0.25 mm, Merck
 Ativada: 120 °C 5 minutos antes do H2SO4 50% - oxidante forte
uso, Solução de paprica

F M: CHCl3-MeOH-H2O- CH3COOH  Polifenois

(65:25:4:3, v/v)

Vanilina-HCl -complexação
coloração vermelha

(a) floroglucinol; (b) extrato de florotaninos de E. bicyclis;

(c) extrato de florotaninos de E. cava; (d) extrato de E.
kurome
Shibata, T. et al., Journal of Applied Phycology 16, 291–296, 2004 .
 Florotaninos 12
Isolamento: Cromatografia em coluna

FE: Coluna Wakogel C-300 HG (1.5 cm x 150 cm) Amostras simples: 0,2 < Rf < 0,8

FM: CHCl3–MeOH–H2O (80:20:2, v/v)-isocrático

 Florotaninos 13
Isolamento: Cromatografia em coluna

FE: sílica 4x80 cm (70-230 mesh, 800 g)

FM: AcOEt / MeOH (50:1-5:1) gradiente

 FE : sílica 3x70cm (70-230 mesh, 250 g)

FM: n-hexano:AcOEt (1:1)

FE: RP-18
FM: (H2O: MeOH 20-100% purificação
gradiente) Sephadex LH-20 (MeOH).

Kang, H. S. et al., Arch Pharm. Res. 27, 94-98, 2004

 Florotaninos 14

Alta Eficiência (HPLC)

Método Analítico
• Preparação da amostra de florotaninos:
Extrator, condições de extração, prevenção
contra oxidações.
 Florotaninos 15

Preparação da amostra
3x de Hexano, centrifugado

Acetona: água 7:3 + ácido ascórbico 0.3%.

Liofilizado e redissolvido em 1 mL de água

Filtradas em PTFE 0,45 µm

 Florotaninos 16

HPLC: Método Analítico

RP or NP?
• Fases estacionárias Quais eluentes?
• Fases móveis
 Florotaninos 17

Método Analítico
• Fases reversa em diferentes eluentes

Água: ACN: 0–5 min, 100% A; 5–60 min;0–30% B ; 60–70 min, 30–60% B; 70–80 min, 60% B;
80–90 min, 60–0% B. UV 280 nm, 20 μL, 1ml/min
(KOIVIKKO, et. al., 2007).
 Florotaninos 18

Método Analítico
• Fases Normal
.

Solventes: A) DCM, MeOH, água e ác. Acético(82:14:2:2, v/v)

(B) MeOH, água e ác. acético (96:2:2, v/v). 1mL/min, 1 μL, UV. 280 nm
(KOIVIKKO, et. al., 2007).
 Florotaninos 19

Método Analítico
• Modificadores de fase móvel

(KOIVIKKO, et. al., 2007).

 Florotaninos 20

HPLC: Método Analítico

• Tipos de colunas
• Superspher 100 coluna C-18 (250 × 4 mm; 4 μm) (KOIVIKKO, et. al., 2007).
• Develosil coluna ODS (250 x 4,6 mm) (SUGIURA, et.al., 2007).
• LiChrospher Si 60 (250 × 4 mm; 5 μm) (KOIVIKKO, et. al., 2007).

• Eluentes
• Fase reversa: Gradiente não linear de Água:ACN
• Fase normal: Gradiente não linear de MeOH: Água
 Florotaninos 21

HPLC: Método Analítico

• Detecção em Ultravioleta.

Dos comprimentos de onda testados (240-360 nm), 270-

280 nm foram os mais adequados para medições de
florotaninos.

(KOIVIKKO, et. al., 2007).

 Florotaninos 22

Método Analítico_ Quantificação

• Desenvolvimento de método em HPLC-RP para separação dos três

principais florotaninos apropriadamente validado e aplicado à extratos
EtOH e AcOEt de Ecklonia stolonifera.

Alta Eficiência (HPLC)
Método Analítico_Validação
• Preparação da amostra
3x de Hex.
EtOH + ácido ascórbico 0.3%.
0.1 mL DMSO e 4,9 mL de MeOH.
Florotaninos 23
• Condições otimizadas
Coluna Gold C-18 (250 × 4.6 mm, 5 μm), pré-
coluna Gemini C-18 (30 × 4.6mm, 5 μm,
Phenomenex)
Água (A) + 0.1 % ácido fórmico
ACN (B) + 0.1 % ácido fórmico
Gradiente: 0-17 min, 13-15% B; 17-30 min, 15-
27% B; 30-40 min, 27% B; 40-45 min, 27-
60% B; 45-48 min, 60% B; 48-50 min, 60-
13% B; 50-60 min, 13% B.
Fluxo: 1.0 mL/min, 20 μL UV 254 nm.
(GOO; CHOI; NA., 2010).
 Florotaninos 24

Alta Eficiência (HPLC) 1

Método Analítico_Validação

3 2
 Florotaninos 25

Alta Eficiência (HPLC)

Método Analítico_Validação
• Validação do Método
 Florotaninos 26

Alta Eficiência (HPLC)

Método Analítico_Validação
• Validação do Método
 Florotaninos 27

HPLC preparativo
Purificação de Florotaninos
 Florotaninos 28

Identificação de florotaninos, Preparo da amostra

(Purificação parcial)

Re-extração

Partição
Com H2O
Eisenia arborea Metanol
aquoso
Extração Dietil eter

Re-dissolvido
MeOH
diluido H2O
SUGIURA, Y. et al., Food Sci. Technol. Res., 31, 54-60, 2007
 Florotaninos 29

Cromatografia analitica

 FE: RP- ODS-5 (4.6 mm x 250 mm)

 FM: 0,1 % TFA (A) e ACN contendo TFA
(0,1%) (B) Gradiente a 30 min
 fluxo: 0,5 mL / min)

Cromatografia HPLC Preparativa:

 FE: ODS-5 (10 mm x 250 mm)

 FM
 fluxo: 1 mL / min Três condições:

 1: gradiente A e B
 0 -30% B por 120 min, mantendo B por 30 min
 30-100% B por 30 min
 2: isocrática com 18 % B
 3: isocrática com metanol 47% contendo 0,1% TFA.
 Monitorados com UV-280nm
 Florotaninos 30
Separação de substâncias suficientes para teste anti –alérgico -RP -HPLC

(A) 0,1 % TFA 1

(B) ACN contendo TFA (0,1%) 11,3 mg 2
4,1 mg
isocrática com 18 % B
gradiente A e B
*0 -30% B por 120 min,
mantendo B por 30 min
*30-100% B por 30 min

5 phlorofucofuroeckol-B
3
isocrática MeOH 47%
com0,1% TFA.
3,3 mg

6 4
5,3 mg 5 22,3 mg
3,3 mg
 Florotaninos
Isolamento de phorotaninos biomonitorado DPPH 31
2. CCD:
FE: (250 μm, silica gel GF Fração acetato 1. CC
 FM:CH2Cl2:MeOH:H2O 314,7 g  FE: silica gel (100 cm x 10
CH2Cl2 cm) ,70-230 mesh
(65:35:10, v/v/v)
 FM: CH2CL2:MeOH (6:1, 5:2,
17 Frações 4:3, 3:4, 2:5, 1:6, v/v)
3. CC agrupadas
FE: sílica gel (100 cm x 5 Por CCD
cm)
FM:CH2Cl2:MeOH (6:1, 5:2, Frações 7-9 (CH2CL2) 4 . HPLC prep- exclusão -
4:3, 3:4, 2:5, 1:6, v /v, Fr.1-9 (25g) detector arranjo de diodo

FE: GS-310 (500 mm x 20

5 SubFr mm
Fracão FM:MeOH fluxo 5.0 mL/min
4 GS1-5
monitorada a 245nm
5 HPLC prep
GS3
FE: RP- ODS (5 μm, 100 A °, 250x 20mm) 1,1 g
6 Purificação:
FE: RP-18 ,5 μLm,
FM: bomba binária, 35 ° C
0,1% ácido fórmico em água (sol.A)
8 frações 250 mm x 10 mm, Phenomenex
FM: solvente igual HPLC prep
0,1% ácido fórmico em acetonitrila (sol. B). ODS1-8 fluxo: 3,0 mL / min

Gradiente linear :
20-100% B (40 min) e re-equilíbrio da coluna ODS1 ODS3 ODS7
com 20% B (10 min)
Fluxo: 7,0 mL / min
Detecção: UV 245 nm KIM et al., J. Agric. Food Chem., 57, 3483–3489, 2009.
 Florotaninos 32

Phlorotaninos isolados

ODS1

ODS3

ODS7

KIM et al., J. Agric. Food Chem., 57, 3483–3489, 2009.

 Florotaninos 33

HPLC semi-preparativo
Purificação de Florotaninos
 Florotaninos 34
.

Separação de três florotaninos por HPLC semipreparativa

Parys, S. Phytochemistry, 71, 221–229, 2010

 Florotaninos 35

Cromatograma de HPLC extrato( A) fração (B)

Tr 14,5 min

Tr 17 min

Tr 18 min
Florotaninos 36