SOUTHERN

BLOT
DISCENTES: ALANA CARVALHO; ANA PAULA GONÇALVES; EMELLY THIZA SOUZA
MARQUES; EVANDRO MOTA; ÉVYLLA LETÍCIA COSTA SILVA; FELLIPE PINTO PINHEIRO;
MARCELLO MARTINS MORAIS; RONILDO REIS; TAINARA CRISTINA CASTRO
REIS;WELLINA DO NASCIMENTO BASTOS.

DOCENTE: SUELLEN FERREIRA

 EDWIN SOUTHERN

Edwin Mellor Southern é um

biólogo e bioquímico britânico.
Especializado em biologia
molecular, é o inventor do teste de
DNA Southern Blot (1975), pelo
qual recebeu o Prêmio Lasker de
2005.
 A TÉCNICA
 O Southern blot é um método que serve para verificar se
uma determinada sequência de DNA está ou não presente
em uma amostra de DNA analisada;
 Baseia-se na hibridização entre moléculas de DNA, fixas
em um suporte, com sondas (moléculas de DNA ou RNA)
marcadas, visando à localização de sequências específicas
de DNA.
 É uma combinação de eletroforese em gel do DNA (este é
frequentemente fragmentado por enzimas de restrição
antes de fazer o Southern), transferência deste para uma
membrana e hibridização com uma sonda marcada
(radioativa ou fluorescente).
 Ampliando o conhecimento ...
ELETROFORESE

 A eletroforese em gel é uma das principais ferramentas

de trabalho em Biologia Molecular.
 PROCEDIMENTOS

 No método de Southern blot o DNA é o alvo, podendo ser

hibridizado com outra molécula de DNA ou RNA. Abaixo
descreveremos as etapas do procedimento:
1. O DNA a ser analisado é digerido com uma ou mais enzimas
de restrição e, em seguida, os fragmentos de DNA são
separado por eletroforese em gel de agarose;
2. O DNA que se encontra na malha do gel é desnaturado na
presença de uma solução de hidróxido de sódio (alcalina –
pH alto), consequentemente, as cadeias do DNA se separam
gerando assim moléculas de DNA fita simples.
3. A característica fundamental desta técnica, introduzida
por Southern, é a transferência dos fragmentos de DNA fita
simples do gel para um suporte que normalmente é uma
membrana de nylon ou nitrocelulose. A desnaturação do
DNA pode ocorrer antes ou durante a transferência. O DNA
migra para a membrana por capilaridade na presença de
uma solução com alta concentração de s al. Como a
migração do DNA ocorre apenas na direção gel –
membrana, a membrana passa a ser uma cópia do gel. O
DNA, em seguida, é imobilizado na membrana pela ação de
luz ultravioleta ou calor;
4. Identificação do DNA de interesse. Nesta etapa, utiliza-se
uma sonda de ácido nucleico que pode ser DNA fita
simples ou RNA marcado radioativamente pela adição de
um átomo radioativo ou pode ser marcada pela adição de
uma molécula fluorescente ou cromogênica. Essa sonda
contém uma sequência específica que permite identificar
o gene de interesse após a hibridização entre as
moléculas. A membrana será incubada com uma solução
contendo a sonda para favorecer a hibridização com o
fragmento de DNA que contenha a sequência de
nucleotídeo complementar a sequência da sonda. As
moléculas da sonda que não hibridizaram são retiradas
com lavagens;
5. Identificação da hibridização. Por exemplo, sondas radioativas
são identificadas com a exposição da membrana a um filme
fotográfico. Após a revelação do filme, as bandas escuras indicam
a posição do fragmento de DNA, que pode ser comparado com o
gel.

Figura adaptada do site: <http://blog-images.microscopesblog.com/uploaded_images/southern-blot-702630.gif>, retirada em 17/9/2011.

 Sendo assim, Após a hibridização, a membrana é lavada para
remover sonda não ligada a DNA e obtém-se uma imagem
através de autorradiografia ou autofluorescência. A imagem
obtida dá a(s) localização(ões) do DNA que liga a sonda, com
a intensidade do sinal dando uma medida relativa da
quantidade de DNA que hibridiza.
 APLICAÇÕES DA TÉCNICA
Na agricultura:
 Auxiliar na seleção de plantas superiores em um programa de
melhoramento;
 manejo de pragas; controle biológico; beneficiamento de
culturas (seleção de genótipos com determinada
característica);
 Produção de plantas transgênicas.

Fonte:<http://oargronomico.iac.sp.gov.br/?p=986> em 05/04/2019
 Na pecuária:
 Estudo genéticos e moleculares dos principais patógenos dos
diversos rebanhos;
 Auxiliar em programas de melhoramento genético animal de
forma a selecionar características gênicas específicas contidas
em raças, em uma progênie, ou relacionadas e doenças
genéticas
Para atingir esses objetivos são necessários estudos preliminares de
caracterização, assim como a utilização de outras técnicas.

Fonte:<http://webquestfacil.com.br/webquest.php?pg=introducao> em 05/04/2019
 VANTAGENS & DESVANTAGENS

 Modo efetivo de detectar uma sequência de DNA específica em

uma amostra grande e complexa de DNA.
 Pode ser usado para quantificar a quantidade do presente DNA.
 Mais barato do que o sequenciamento de DNA.
 Complexo e trabalho intensivo.
 Muito demorado e pesado.
ARTIGO

http://www.scielo.br/pdf/rbpv/v18s1/a01v18s
1.pdf
 OBJETIVO DO ARTIGO
 Foi verificar se a técnica de Southern Blot/Hibridização (SB) em associação
à reação de polimerização em cadeia (PCR) aumenta a sensibilidade na
detecção de DNA de hemoplasmas em gatos domésticos (Felis catus). O
sangue total foi coletado em tubos contendo o anticoagulante ácido
etilenodiamino tetra-acético, o DNA extraído a partir de 149 animais e a
PCR realizada com o uso de sequências iniciadoras espécie-específicas,
para amplificar subunidade 16S do RNA ribossomal de Mycoplasma
haemofelis e ‘Candidatus M. haemominutum’ dessas amostras. Para a
hibridização, foram utilizadas sondas específicas quimicamente marcadas,
e os resultados visualizados por meio da adição de substrato
quimiluminescente seguida de autoradiografia. Dezoito (12,1%) das 149
amostras testadas apresentaram resultado PCR-positivo para o DNA de
hemoplasmas. A técnica de SB mostrou que 24/149 (16,1%) amostras
apresentaram resultado positivo para hemoplasmas, confirmando os 18
resultados PCR-positivos, além de revelar seis outros adicionais (p < 0,001).
O método de SB com sondas específicas mostrou-se mais sensível do que a
PCR realizada isoladamente, sendo complementar para o diagnóstico das
infecções causadas pelos hemoplasmas felinos.
 REFERÊNCIAS
 Biologia Molecular do Gene, 7ed. WATSON,James D.; BAKER,Tania A.; Stephen
P.; GANN, Alexander. LEVINE,Michael; LOSICK, Richa
 Biologia Molecular da Célula, 5ed.ALBERTS,Bruces; JOHSON, Alexander;
LEWIS, Julian; ROBERTS, Keith; WALTER, Peter; RAFF, Martin
 Técnicas de biologia molecular e clonagem. Disponível em:
htps://www.paszseidireto.com/arquivo/21760682/técnicas-de-biologia-
molecular-e-clonagem. Acesso em 04 de abril de 2019.
 Uso da técnica de Southern Blot/Hibridização associada à reação em cadeia
da polimerase para aumentar a sensibilidade no diagnóstico das infecções por
hemoplasmas em gatos domésticos. Disponível em:
http://www.scielo.br/pdf/rbpv/v18s1/a01v18s1.pdf. Acesso em 06 de abril
de 2019.