Citologia

Métodos de estudo em

Biologia Celular

Profa. Angélica Pataro Reis

Dimensões celulares e das
organelas
Microscopia

Microscópio óptico

1. Ocular
2. Objetivas e revólver
3. Platina
4. Charriot
5. Macrométrico
6. Micrométrico
7. Diafragma e condensador
8. Luz
9. Braço
10. Base
Microscopia

Microscópio óptico

 Condensador: concentra a luz para

projetá-la sobre a lâmina

 Diafragma: altera a quantidade de luz

que alcança o condensador (para aumento
do contraste da imagem).

 Objetiva: projeta a imagem aumentada

em direção a ocular

 Ocular: amplia novamente a imagem e

a projeta em direção a retina

Aumento= aumento da objetiva X

aumento da ocular
Microscopia

Microscópio óptico

Platina - onde é colocada a lâmina de microscopia.

Possui um porta lâminas com alavanca elástica.

Charriot - usado para mover a lâmina sobre a

platina.

Macrométrico - promove deslocamento da platina,

permitindo um foco grosseiro.

Micrométrico - promove deslocamento bem sutil

da platina, permitindo um ajuste perfeito do foco.
Microscopia

Microscópio óptico
controle da intensidade luminosa

 aumentar intensidade luminosa –abrir o diafragma (lâminas coradas).

 reduzir a intensidade luminosa –fechar o diafragma (exames a fresco –

lâminas não coradas).
Microscopia

Microscópio óptico
foco
Microscopia

Microscópio óptico
poder de resolução – limite de resolução (0,2m)

limite de resolução riqueza de detalhes objetiva

menor distância entre dois pontos para que eles apareçam individualizados
em um sistema óptico.

k (constante) = 0,61
LR = k x 
= comprimento de onda da luz luz branca = 550 nm
AN
AN = abertura numérica da objetiva tamanho do cone de luz
que entra nas lentes do microscópio após passar através da amostra
Microscopia

Microscópio óptico
limite de resolução
Microscopia

Microscópio de contraste de fase:

• A velocidade da luz ao atravessar um corpo
depende da quantidade de matéria presente,
isto é, da densidade do corpo
• As diversas estruturas celulares possuem
diversas quantidades de matéria e causam
atrasos diferentes na luz que as atravessa.
Isso causa diferenças de fase na luz
emergente
• O microscópio de contraste de fase é dotado
de um sistema óptico especial que transforma
diferenças de fase dos raios luminosos em
diferenças de intensidade, dando diferença
luminosa às quais a retina é sensível
• É empregado em especial para o estudo de
células vivas
Microscopia

Microscópio de fluorescência
• Um corante fluorescente é usado para
marcar a molécula de interesse dentro de
células fixadas ou vivas

• Corantes fluorescentes absorvem luz em

um comprimento de onda e emite luz em
outro comprimento de onda

• Semelhante a um microscópio ótico

comum, porém a luz que ilumina passa por
um conjunto de filtros

• O primeiro filtra a luz antes que ela

alcance o espécime, passando apenas os
comprimentos de onda que excitam o
agente fluorescente

• O segundo repreende essa luz e passa

apenas aqueles comprimentos de onda
emitidos quando o agente fluorescente
emite fluorescência.
Microscopia

Microscópio confocal

• O microscópio confocal é um microscópio de fluorescência com um laser como

fonte de iluminação

• A fluorescência emitida é coletada por um detector com uma câmera de vídeo

• O raio laser é focado sobre um único ponto a uma profundidade específica da

amostra

• Um orifício de abertura no detector permite que apenas a fluorescência emitida a

partir do ponto exato do foco seja incluída na imagem

• A varredura do feixe de laser através da amostra gera uma imagem

bidimensional bem definida do plano de foco

• Uma série de seccões ópticas a diferentes profundidades permite que uma

imagem tridimensional seja construída
Microscopia

Microscópio confocal
Microscopia

Microscópio eletrônico
limite de resolução (0,2nm)

LR = k x 
AN

k (constante) = 0,61
= comprimento de onda
AN = abertura numérica da objetiva
feixe de elétrons = 0,005nm

 de transmissão: imagem plana

 de varredura: imagem 3D
Microscopia

Microscópio eletrônico de transmissão

• Similar a um microscópico óptico, porém
utiliza um feixe de elétrons em vez de um
feixe de luz, e lentes magnéticas para focar
o feixe, em vez das lentes de vidro

• O espécime, que é colocado no vácuo, deve

ser muito fino

• As amostras são fixadas e coradas com

metais pesados eletrodensos, que absorvem
ou espalham localmente os elétrons

• Elétrons que encontram um íon de metal

pesado quando passam através da amostra
são defletidos e não contribuem para a
imagem final Microscópio eletrônico de transmissão
906E

• Áreas coradas da amostra aparecem escuras

Microscopia

Microscópio eletrônico
de transmissão

Esquema: microscópio eletrônico de transmissão

Microscopia

Microscópio eletrônico
de transmissão

 Alguns elétrons interagem com átomos do tecido e outros não

 Forma imagem preto-e-branco (áreas escuras: elétro-densas / áreas claras: elétro-

transparente)
Microscopia

Microscópio eletrônico de varredura

• É usada para dar uma imagem

tridimensional das células, mostrando
somente a visão de superfície

• O feixe de elétrons não passa através da

amostra. Em vez disso, a superfície da célula
é coberta com um metal pesado, e um feixe
de elétrons é usado para varrer a superfície
da amostra

• Os elétrons que incidem sobre a superfície

da amostra são capturados por um detector e
transmitidos a amplificadores

• O sinal é projetado em um monitor,

formando uma imagem em preto e branco
Cílios
Microscopia

Preparo de amostras para estudo nos microscópios óptico e eletrônico

Embora seja possível o estudo microscópico de células vivas, muitas vezes há

vantagens em obter um preparado permanente, no qual as células ficam preservadas,
isto é fixadas e coradas, para melhor demonstração dos seus componentes

 As amostras são preservadas para manter a composição molecular e

estrutural;

 Tecidos são fatiados em cortes histológicos muito finos;

 São corados e, posteriormente, montados em lâminas de vidro para a

análise ao microscópico.
Microscopia

Preparo de amostras
fixação: primeira etapa para a obtenção de um preparado permanente

 evitar autólise,
 impedir atividade e proliferação de bactérias,
 “endurecer” a célula,
 aumentar afinidade pelos corantes e aumentar o contraste

agentes fixadores

 formol, mecanismo de ação pouco conhecido – reação

com grupamento amino das proteínas
 glutaraldeído,

 tetróxido de ósmio,
 sais de urânio e chumbo

contraste na M.E.
Microscopia

Preparo de amostras: inclusão e microtomia

Microtomia: corte do tecido em fatias finas para exame no microscópio

utilizando-se um micrótomo.
Para ser cortado, o fragmento de tecido fixado é geralmente protegido por um
material que o envolve e nele penetra

 Inclusão em resinas plásticas ou

parafina

 Facilitar o processo de corte no

micrótomo – aumenta a rigidez tecidual

 Os tecidos a serem estudados em

microscópio eletrônico devem ser
incluídos em resinas mais duras, como
as do tipo epóxi
Microscopia

Preparo de amostras
inclusão e microtonia

 Amostras são “cortadas” - espessura varia de 1 a 6 µm para M.O. e 0,02 a 0,1

µm para M.E.
Microscopia

Preparo de amostras
Coloração

 Estruturas celulares transparentes e incolores

métodos de coloração para diferenciar

componentes celulares e teciduais

 Corantes: ácidos ou básicos

Afinidade por
componentes ácidos

Afinidade por
componentes básicos
Microscopia

Preparo de amostras
coloração

Corantes Ácidos Corantes Básicos

Orange G Azul de Toluidina

Fucsina Ácida Azul de Metileno
Eosina Hematoxilina

Afinidade por componentes

básicos(mitocôndrias, grânulos de Afinidade por componentes ácidos (ácidos
secreção, proteínas citoplasmáticas) nucléicos, glicoproteínas ácidas)
Microscopia

Preparo de amostras
coloração

 Corante mais comumente utilizado: hematoxilina e eosina

 Hematoxilina: cora em azul ou violeta o núcleo celular e outras estruturas ácidas

 Eosina: Cora o citoplasma e o colágeno em cor-de-rosa
Microscopia

Preparo de amostras
citoquímica : técnicas diversas para identificação e localização das
moléculas que constituem as células

 Utilização de substâncias com afinidade para a molécula alvo

• reação de Feulgen – DNA

- ácido clorídrico
- reativo de Schiff

• formaldeído – catecolaminas – composto fluorescente

• técnica de Millon – detecta especificamente o aminoácido tirosina

• técnica de Sakaguchi – detecta especificamente o aminoácido arginina

• PAS (periodic acid Schiff)- glicogênio

Microscopia

Preparo de amostras
imunocitoquímica

 Baseado na reação antígeno-anticorpo

 Anticorpo marcado

substâncias fluorescentes (microscopia de fluorescência)

átomos radioativos (radioautografia)
Microscopia

 imunocitoquímica direta

 imunocitoquímica indireta
Microscopia

Preparo de amostras
radioautografia

 Fornecimento de moléculas radioativas às células (precursores) =>

ácidos nucléicos, proteínas, etc

 Cortes do tecido: banhados com cristais de brometo de prata =>

detectores de radioatividade

 Revelação da lâmina: cristais de brometo de prata atingidos pela

radiação originam grânulos pretos => molécula radioativas são cobertos
por este grânulo
 Radioautograma de tecido de rato injetado com timidina radioativa,
marcada com trício H3

Muitas células epiteliais em divisão no epitélio

intestinal