CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE PRODUTOS E PROCESSOS

Diversidade de Lactococcus lactis revelada pelo sequenciamento de Amplicon

direcionado do gene purR , comparações metabólicas e propriedades antimicrobianas
em uma cultura inicial mista indefinida usada para fabricação de queijo macio
Sabrina Saltaji , Olivier Rué, Valérie Sopena, Sophie Sablé, Fatoumata Tambadou, Sandrine Didelot, Romain Chevrot

DOCENTE: FERNANDA BADOTTI

D I S C E N T E : B R E N D A PA L H A R E S D O S R E I S V I E I R A
BELO HORIZONTE
2022
Sumário
• Artigo
• Introdução
• Objetivo
• Metodologia
• Resultados e discussão
• Conclusão
• Referências bibliográficas
Artigo

Fator de
impacto: 4,350
Introdução
Produção de queijos de pasta mole
Introdução
Bactérias de ácido láctico
As BAL que compõe o leite cru são:
• Lactococcus lactis,
• Leuconostoc mesenteroides,
• Streptococcus spp. e
• Lactobacillus spp.

As subespécies L. lactis subsp. lactis e L. lactis

subsp. cremoris.
Introdução
Tecnologias de sequenciamento
Introdução
Bactérias patógenas e deteriorantes
• Placa de ágar EMB semeada com Escherichia coli.
•Meio ágar Hektoen em sua coloração original (placa da esquerda); HE
semeado com cepa de Salmonella (placa ao centro). Note a presença de
pigmento negro. HE semeado com cepa de coliforme fecal (placa à
direita).
Objetivos
•Conhecer a diversidade microbiana CIMI;
•Criar um acervo a partir da CIMI;
• Realizar as associações genótipo-fenótipo;
• Determinar o perfil do metabolismo de carboidratos;
•Avaliar a atividades antimicrobiana.
Materiais e métodos
Coleta de Amostras
• Aplicado durante a adição do coalho,
algumas horas após o enriquecimento
do leite com fermentos acidificantes.
Extração de DNA
• O DNA foi extraído com o DNeasy
PowerFood Microbial Kit, 
• O DNA purificado foi armazenado a -
80°C
 Sequenciamento de genes (SG) da microbiota CIMI
O pipeline FROGS foi usado para
recuperar as unidades
SG e Análise de
taxonômicas operacionais (UTOs)
dados de 16S
Ampliação por PCR rRNA As sequências de referência de
cada UTO foram lançadas contra
o banco de dados SILVA
Sequenciamento
de genes

O pipeline DADA2 foi usado para

Sequenciamento pela
recuperar as sequências biológicas
plataforma Eurofins
Genomics usando SG PurR e Análise de leituras (erros).
uma tecnologia de Dados Comparada no banco de dados
Illumina ® MiSeq. NCBI usando o programa
BLAST.
 Isolamento de bactérias lácticas (BAL) e não-BAL
Atmosfera aeróbica Atmosfera microaerofílica Atmosfera aeróbica

• Temp.: 28°C • Temp.:28°C • Temp.:22°C

• Ágar BHI
• Ágar BHI • Ágar BHI
• Ágar MRS
• Ágar MRS • Temp.:37°C
• Ágar M17
• Ágar MRS + 2% NaCl • Ágar M17 • Ágar MRS
• Ágar MRS + 4% NaCl • Temp.:44°C
• Ágar MRS + 6,5% NaCl
• Ágar MRS
• Ágar BHI + 6,5% NaCl
 Identificação de Perfis Fenotípicos e Isolados de LAB
Perfil do Metabolismo de Carboidratos Bacterianos
• 2 bactérias isoladas aleatórias de cada condição (n=13).
• 49 testes bioquímicos com meio API 50 CHL.

MALDI-TOF MS Identificação Bacteriana

• Pela Eurofins Microbiologie Ouest (n=26).

Extração de DNA, Procedimento de PCR de Rotina e Sequenciamento de Gene de

rRNA 16S de Comprimento Completo
• Pela Eurofins Microbiologie Ouest.
• Comparada no banco de dados NCBI usando o programa BLAST.
Sequenciamento do Genoma e Análise de Dados
Extração de DNA de cultura pura
• 6 BAL isolados de L. lactis  para associações genótipo-fenótipo. 
• Extração: kit de sangue e tecido DNeasy
• Quantificação: NanoDrop ND-1000

Sequenciamento de genoma completo e anotação de genes

• Tecnologia de sequenciamento PacBio ® RS II e Illumina ® iSeq .
• As informações das vias relacionadas ao metabolismo de carboidratos foram identificadas a
partir daquelas descritas na Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (EGGK). 
• Mineração dos clusters do genes da produção de peptídeos antimicrobianos foi realizada usando
BAGEL4.
Atividade antimicrobiana
Cepas bacterianas e
Número(s) de
condições de
Adesão
crescimento
• Os dados do amplicon 16S e purR foram
• Cultivado duas vezes.
depositados em DDBJ/ENA/GenBank sob
o número BioProject PRJNA615620.  • Condições de crescimento específicas para
• O projeto de genoma completo foi cada cepa indicadora. 
depositado no DDBJ/ENA/GenBank sob o
número BioProject PRJNA615395.
 Atividade antimicrobiana
•Bacillus cereus
•Bacillus subtilis
•Brochothrix thermosphacta
•Carnobacterium maltaromaticum
•Cronobacter sakazakii
•Escherichia coli
•Enterococcus faecalis
•Leuconostoc mesenteroides
•Listeria innocua
•Listeria ivanovii
•Listeria monocytogenes
•Listeria monocytogenes
•Mucor circinelloides
•Mucor racemosus
•Penicillium solitum
•Pseudomonas aeruginosa
•Pseudomonas fluorescens
•Staphylococcus aureus
•Staphylococcus aureus
•Salmonela ser. Enteritidis
•Salmonela ser. Typhimurium
•Yarrowia lipolytica
•Yersinia enterocolitica subsp. enterocolitica
Determinação das Propriedades Inibitórias de Isolados de LAB
contra Bactérias Patogênicas Transmitidas por Alimentos e
Bactérias de Deterioração
Preparações de Sobrenadante Livre de
Teste de mancha de ágar
Células (CFS) e CFS Neutralizado (NCFS)
• 5 microlitros de uma cultura de BAL em • Amostra coletada em intervalos de
placas de ágar BHI, deixa secar por 20 min; crescimento;
• Cobre com 10 mL de ágar mole com • Os CFSs foram obtidos por centrifugação;. 
10 6 UFC/mL da cepa indicadora; • Os NCFs :pH do CFS ajustado para 7,0
• Incubação à noite; para excluir o efeito antimicrobiano dos
• Verificar os halos de inibição.  ácidos orgânicos;
• Controle positivo: Lactobacillus sakei  • Aquecimento a 100°C por 10 min para
inibir a atividade da enzima.
Determinação das Propriedades Inibitórias de Isolados de LAB
contra Bactérias Patogênicas Transmitidas por Alimentos e
Bactérias de Deterioração
Ensaio de Difusão em Poços de Agar.
• O ágar BHI foi semeado com 10 6 UFC/mL de cepas indicadoras e vertido em
placas de Petri. 
• Alíquotas de CFS ou NCFS não diluídas preenchem os poços de vidros nas placas
• Incubação a noite. 
• Registro: Halos de inibição.

Efeito inibitório durante o co-cultivo

• Lote 1: co-inoculação de S. aureus + BAL isolado selecionado;
• Lote 2: co-inoculação de S. ser. Typhimurium + BAL isolado selecionado. 
• As atividades antimicrobianas: ensaio de difusão em poço de ágar. 
 Resultados e discussão
Análise da diversidade microbiana das CIMI

Análise de sequências Análise de

Análise de sequências
de fragmentos de genes sequenciamento de
de genes purR
de rRNA 16S genoma completo

Um gênero dominante, Lactococcus sp.,

abrangendo 99,9% de abundância relativa,
foi identificado para cada região do gene
16S rRNA
Análise de Sequência de Genes PurR
Contagem de matriz de variantes de sequência de amplicon (ASVs) (%)
determinada com análise do gene purR .

Abundância (%)
ASV_1 99,86
ASV_2 0,13
ASV_3 0,005
ASV_4 0,005
ASV_5 0,002
 A

Análise de
Sequência de
Genes PurR
Dendrogramas mostrando
semelhanças de sequência de
cepas de L. lactis com base B
em uma análise de
agrupamento das variantes
de nucleotídeos de amplicon
purR (A) ou variantes de
aminoácidos (B).
Análise de sequenciamento de genoma completo
.

O valor ANI é usado para estimar a distância genética entre isolados..

A subespécie cremoris possui um valor de ANI abaixo de 95%.

A identidade ANI foi >99,8% para todos os genomas de L. lactis,

Sugerindo que todos pertencem ao grupo de subespécies de lactis .

MALDI-TOF MS e Análise de Sequenciamento Genético
de rRNA 16S de Comprimento Completo
• Foram 4 identificações de espécies:
• Lactococcus lactis (L) ( n = 18/26),
• Lactococcus raffinolactis (R) ( n = 1/26),
• Enterococcus faecalis (E) ( n = 5/26) e
• Staphylococcus warneri (S) ( n= 2/26).
• A análise dependente de cultura mostrou semelhanças na diversidade da CIMI e
concordou com estudos independentes de cultura para a identificação de L. lactis
Carboidrato A Grupo ( n = 13) a Grupo B ( n = 2) b Grupo C ( n = 2) c Grupo D ( n = 1) d ATCC 19435 e ATCC 19257 f IL1403h _
Origem da cepa Leite cru Leite cru Leite cru Leite cru Leite Creme Laticínios
Ao controle - - - - - - -
D-ribose + + + + + - +
L-arabinose - - - - - - -
D-xilose + - + + + - -
D-galactose + + + + + - +
D-glicose + + + + + + +
D-frutose + + + + + + +
D-manose + + + + wg _ + +
D-manitol - + - + - - -
D-sorbitol - + - - - - -
Arbutina + + + + + - +
Salicina + + + + + - +
D-celobiose + + + + + - +
D-maltose + + + + + - +
D-lactose + + + + + + W
D-melibiose - - - - - - -
D-sacarose - + + + - - -
D-trealose + + + + + - +
D-rafinose - - - - - - -
Amido - - - - - - -
D-tagatose - + - - - - -
 Características Metabólicas e Funcionais
das Cepas CIMI
Grupo (A)
Grupos fenotípicos de L.

L1 a L6, L10 a L13 e L15 a Grupo A (L1, L2, L3), Consumo da D-xilose
L17 ( n = 13)

Grupo (B) Consumo da D-tagatose, D-

Grupo B (L8),
L7 e L8 (n = 2) sorbitol* e D-sacarose*
lactis 

Grupo(C) Consumo da D-xilose e D-

Grupo C (L14) e
L14 e L18 ( n = 2) sacarose*

Consumo da D-xilose e D-
Grupo (D)
Grupo D (L9). sacarose*
L9 ( n = 1)
Resultados e discussão
• O metabolismo celular dos Lactococcus resumem em duas possíveis vias
catabólicas para a utilização da lactose:
• (i) hidrólise da lactose para dar α-D-glicose e D-galactose realizada por uma β-
galactosidase , e
• (ii) a conversão em lactose 6-fosfato (Lac-6P) por uma lactose fosfotransferase.
•Todos os genomas analisados ​possuíam uma enzima chave para a degradação da L-
arabinose, embora os perfis fenotípicos mostrassem uma incapacidade de crescer
em arabinose.
•A porcentagem de carboidratos utilizada pelas bactérias isoladas foi ligeiramente
maior (33% a 45%) em comparação com cepas do tipo L. lactis (29%).
Resultados e discussão
•O processo de pseudogenização progressiva (inativação de genes) ligado à sua
especificação de nicho atual.
• A L. lactis isolados vieram de um ambiente de fazenda antes de serem
introduzidos no leite cru e depois no UMSC
• As bactérias isoladas da CIMI foram progressivamente domesticadas, uma vez
que não podiam mais crescer em uma variedade de carboidratos derivados de
plantas devido à pseudogenização ou inserções de transposons em genes.
Atividades antimicrobianas
A atividade
R.: Os isolados 14 e 15.
antimicrobiana do
N= 34 bactérias isolado 14 de L.
Para as 5 cepas indicadoras
isoladas
( S. ser. Typhimurium CIP lactis foi estudada em
Ensaios apresentou ensaios de co-cultivo
(n = atividade 104115, S. aureus DSMZ
1616) antimicrobiana 13661, S. aureus CIP contra as duas cepas
contra até 5 cepas 76.25, E. faecalis CIP indicadoras: S.
indicadoras 103.015 e L. innocua CIP aureus DSMZ 13.661
80.11).
ou S. ser. Typhimuriu
m CIP 104115
Atividades antimicrobianas
S. ser. Typhimuri Lactobacillus S. aureus DSMZ L. inócua
CFS testado L. lactis IL1403 d
um CIP 104115 Sakei CIP 104494 13661 CIP 80.11
L. lactis isolado
8,0 ± 0,7 a 12,0 ± 0,7 8,0 ± 0,0 24,0 ± 0,7 13,0 ± 1,4
14
S. ser. Typhimuri
um / b / / / /
CIP 104115
Isolado 14
+ S. ser. Typhimur 11,0 ± 0,0 14,0 ± 1,4 ND c 22,0 ± 1,4 15,0 ± 2,12
ium CIP 104115
S. aureus DSMZ / 10,0 ± 2,12 / / /
13661
Isolado 14 + S.
aureus DSMZ ND 11,0 ± 1,4 14,0 ± 0,0 18,0 ± 0,7 17,0 ± 0,7
13661
Atividades antimicrobianas
A ferramenta baseada na web BAGEL4 foi usada para minerar agrupamentos de genes de
metabólitos secundários dentro de todo o genoma L. lactis L3 (isolado 14).
O gene é conhecido por estar envolvido na produção da bacteriocina lactococina B (LcnB).

O LcnB afeta a permeabilidade da membrana, dissipando seu potencial e seu gradiente de pH

causado pelo vazamento de íons. Em cepas de L. lactis que carregam a proteína de imunidade, o
LcnB é inativo 

O isolado 14 inibiu o crescimento de L. lactis IL1403, uma cepa livre de plasmídeo sensível à
bacteriocina. Esses resultados sugeriram que o isolado 14 poderia produzir um peptídeo
antimicrobiano próximo ao LcnB. 
Conclusão
•Cinco variantes de L. lactis foram identificadas e cinco perfis de metabolismo de carboidratos foram
destacados no gênero Lactococcus.
• Essas cepas de Lactococcus diferem em suas propriedades fenotípicas das cepas comumente usadas
como iniciadores industriais.
• Além disso, algumas L. lactis isolados apresentaram atividade antimicrobiana detectada por métodos
culturais.
•Essas bactérias poderiam atuar como agente de biocontrole quando combinadas com outros
procedimentos da chamada tecnologia de barreiras.
•Além disso, considerando as características da cultura e sua relação com a qualidade do produto,
estudos adicionais podem ser úteis para determinar seus efeitos na aptidão tecnológica e nas
propriedades sensoriais do queijo.
Referências bibliográficas
https://omelhordeparis.com.br/confira-5-queijos-tipicamente-franceses/
https://pt.dreamstime.com/desenhos-animados-infographics-da-produ%C3%A7%C3%A3o-de-qu
eijo-image101748586
https://www.google.com/imgres?imgurl=https%3A%2F%2Fwww.milkpoint.com.br%2Fimg
%2Fartigo%2F73129%2F%3Fw%3D1200%26vs%3D20112019092814&imgrefurl=https%3A
%2F%2Fwww.milkpoint.com.br%2Fcolunas%2Fclaucia-fernanda-souza%2Fbacterias-
acidolacticas-e-sua-contribuicao-na-formacao-de-sabor-e-aroma-
217005%2F&tbnid=eC1IfPyKbZegTM&vet=12ahUKEwiex83X1Jr4AhWsDrkGHSyFDIsQMy
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https://neobio.com.br/blog/o-sequenciamento-de-dna-a-revolucao
Referências bibliográficas
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2011/10/reacao-em-cadeia-da-polimerase-pcr.html
https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/24343/5/Manual%20de%20bacteriologia%20e
%20de%20enteroparasitos.pdf
https://pt.dreamstime.com/imagens-de-stock-ilustra%C3%A7%C3%A3o-da-f%C3%
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SALTAJI, S. et al. Lactococcus lactis Diversity Revealed by Targeted Amplicon Sequencing of purR Gene,
Metabolic Comparisons and Antimicrobial Properties in an Undefined Mixed Starter Culture Used for Soft-
Cheese Manufacture. Foods, v. 9, n. 5, 1 maio 2020.
http://biologiemarine.com/___fiches/APIpdf/API%2050%20CHL%20Medium-_07486_-_G_-_50410.pdf
https://www.scielo.br/j/eins/a/B5YjmWMZs8TrYqYDP7dnJsJ/?lang=pt&format=pdf
Obrigada!