Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tpicos
1. DNA 2. PCR
Alvos Denaturao Primers Anelamento Ciclos Requerimentos

DNA
DNA um cido nuclico composto de duas cadeias antiparalelas complementares. Os nucleotdeos so compostos de um grupo fosfato, uma pentose e uma base nitrogenada

DNA
Accar do DNA
cido Desoxirribonucleico

Acar do RNA
cido Ribonucleico

DNA
O DNA tem quatro bases nitrogenadas. Duas so chamadas purinas
Adenina ( A ), Guanina ( G )

Duas so pirimidinas
Citosina ( C ), Timina ( T )

DNA
Essas quatro bases so ligadas em um padro repetitivo por pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas A ligao de duas cadeias complementares chamada de HIBRIDIZAO.

DNA
Uma purina sempre se liga a uma pirimidina para manter a estrutura do DNA. Adenina ( A ) se liga a timina ( T ), atravs de duas pontes de hidrognio. Guanina ( G ) se liga a citosina ( C ), atravs de trs pontes de hidrognio.

DNA
Examplo de padro de ligao. Padro primrio CCGAATGGGATGC GGCTTACCCTACG Padro complementar

DNA Molecule
Adenina Timina Guanina Citosina

PCR
PCR (Reao em Cadeia da Polimerase) uma tcnica que amplifica uma sequncia especfica de DNA, como objetivo de tornla abundante e disponvel para diversas tcnicas de biologia molecular.

OS Alvos do PCR
Os alvos a serem considerados no PCR so as regies que flanqueiam a sequncia especfica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma regio pequena.

PCR Targets
O nmero de bases nos alvos pode variar. TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA O . . . . Representa o meio da sequncia de DNA, e no h problemas em no conhecla para poder amplific-la.

PCR - Desnaturao
A desnaturao o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA so separadas atravs de aquecimento a 95C.

PCR Primers
Os primers so sequncias de 15 a 30 nucleotdeos, fita nica, que so usadas para flanquearem as extremidades da regio a ser amplificada. Marcam o incio e o fim da seuqncia-alvo.

PCR Primers
Um primer para cada extremidade da sua sequncia alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direes.

PCR Primers
TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT AATTGCCGGAATT . . . . . . . . . .> e <. . . . . . . . . . AAATTTGGCCAA TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT

PCR Primers
OS primers so colocados em excesso na reao de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invs das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.

PCR - Anelamento
O anelamento o processo atravs do qual duas sequencias de nucleotdeos so ligadas atravs da formao de pontes de hidrognio. Na reao de PCR, o anelamento se d atravs da ligao dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55C.

PCR Taq DNA Polimerase

O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual uma bactria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

PCR Taq DNA Polimerase

Essa bactria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presena de MG, a altas temperaturas.

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Cycles

PCR Ciclos
Desnaturao: 94- 95C Anelamento: 55- 65C Extenso: 72 Nmero de ciclos: 25-40

PCR Ciclos

PCR Ciclos

PCR Ciclos
Nmero de cpias da Regio alvo de DNA A = 2n n = nmero de ciclos

PCR Requerimentos
Cloreto de Magnsio: .5-2.5mM Tampo: pH 8.3-8.8 dNTPs: 20-200M Primers: 0.1-0.5M DNA Polimerase: 1-2.5 units DNA Alvo: e 1 g

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado de No remover a faixa de clulas brancas.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Extrair cuidadosamente 200ul da regio de clulas brancas E separar em tubos identificados

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Adicionar Protease a Cada tubo Adicionar Tampo de Lise em cada tubo

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Realizar Homogeneizao Criteriosa do material

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Incubar os tubos A 56C por pelo Menos 10min.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Centrifugar os tubos para retirar quaisquer grumos Adicionar etanol para lavagem e centrifugar de novo.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Adicionar as maostras em colunas de afinidade e centrifugar .

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Tubo com coluna
A coluna vai ser retirada e adaptada em outro tubo no qual ser feita a eluio Coluna.

Esse eluato (flow through) ser Descartado.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

A coluna ser colocada em um novo tubo, aonde ser Lavada mais duas vezes com tampo, para retirar quaisquer Molculas que no estejam ligadas fortemente a coluna.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

A coluna com o tubo ento centrifugada Mais uma vez, para remover excesso de Tampo de Lavagem. O prximo passo adicionar Tampo de Eluio Incuba-se por 30 minutos a 25C O eluato da coluna ento guardado, pois agora esse contm o DNA Alvo.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Ento pode-se preparar o mix de PCR. Mix de PCR 10x Buffer - 10 l MgCl - 6 l dNTPs- 0.8 l

Primer forward - 2 l Primer reverse - 2 l Taq polimerase - 0.5 l H2O estril - 73.7 l

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos Especficos e colocar em termociclador.

Extrao de DNA de clulas sanguneas

Anlise do produto de PCR.

Bibliografia
Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science. 1998. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://www.accessexcellence.org/AB/GG/ forensci_PCR.htm.l Brown, John C. What The Heck Is PCR? 1995. Online. Internet. 18 Jan. 2001. Available http://falcon.cc.ukans.edu/~jbrown/pcr.html Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and Tom Wiggers.

Bibliografia
Ronald H. Holton, Ph.D.:
Molecular Diagnostics in the Clinical Laboratory Molecular Biology in the Clinical Laboratory Molecular Pathology: Basic Methodologies and Clinical Applications Expanding applications of PCR, by Peter Gwynne and Guy Page