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DIAGNÓSTICO MOLECULAR

DE PATOLOGÍAS VIRALES Y
BACTERIANAS

PROF. DR. MARCELO BUSTAMANTE, Ph. D.


FACULTAD DE MEDICINA, UCSC.
mbustamante@ucsc.cl
Desarrollo de la Ingeniería Genética
­ 1953 James Watson y Francis Crick, doble hélice DNA

­ 1982 Insulina humana recombinante

­ 1985 Kary Mullis, creador de la técnica de PCR 

1993 Nobel de Química

­ 1985 Alec Jeffreys (U. de Leicester, UK) huella génica

­ 1990 Inicio proyecto Genoma Humano

            Proyecto genoma patógenos humanos, animales y plantas

­ 1997 Secuencia completa bacteria E. coli

Ian Wilmut­oveja Dolly

­ 2000 Primer borrador Genoma Humano (85%)

Bancos de Datos­Internet­Acceso libre

­2003 Mapa completado en un 99% con 99% de precisión


-Costo: US$ 2700 Mi
-Intituciones participantes (18): USA, UK, Francia, Alemania, Japón y
China.
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Transcription
Código Genético
PROYECTO
GENOMA
Diagnóstico Molecular
• Diagnóstico basado en información
molecular
• Información genética de los individuos
(virus, procariontes y eucariontes)
• ADN
• ARN
Detección de Virus
• Indicado para:
– Detección de virus ADN
– Detección de virus ARN (retrovirus)
– Epidemiología: Identificación de cepas
– Taxonomía: Identificación de especies
• Ejemplos:
– Herpes (Subtipos) Papiloma (Subtipos)
– Citomegalovirus VIH (Carga Viral)
– SARS Hepatitis A, B, C
– Enterovirus Influenza aviar
– Virus Sincicial Rotavirus
Detección de Bacterias
• Indicado para:
– Detección de bacterias de difícil cultivo: Chlamidia,
Mycoplasma
– Detección de bacterias de crecimiento lento: MTB
– Detección de resistencias: β-lactamasas, Rifampicina
– Epidemiología: Identificación de cepas
– Taxonomía: Identificación de especies
• Ejemplos:
– M. tuberculosis complex M. Avium (Subesp. ParaTBC)
– Treponema palidum Chlamidia
– Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila
– Helicobacter pylori Leptospira sp
– Bordetella pertussis
Detección de Parásitos
• Indicado para:
– Detección de parásitos de difícil cultivo
– Detección de parásitos de crecimiento lento
– Detección de resistencias a antiparasitarios
– Epidemiología: Identificación de cepas
– Taxonomía: Identificación de especies
• Ejemplos:
– Protozoos: Entamoeba sp
– Helmintos: Nematelmintos (Enterobius, Trichinella)
» Platelmintos: Céstodes: Hymenoleptis, Tenias
» Tremátodes: Distoma
Parásitos sánguíneos: Tripanosoma
Mutación del Gen de la protrombina
Mutación del Factor V de Leyden
Optimización del PCR
• Oligonucleótidos iniciadores
– Secuencia: Tm, especificidad
– Tamaño: Tm
– Gen que se detecta: nº de copias iniciales
• Temperatura de hibridación
– Mayor temperatura = mayor especificidad =
menor rendimiento
• Condiciones de reacción
– Concentración de Mg++
– Concentración de Taq polimerasa
• Extracción del DNA
• Elección del método de detección y análisis
Proceso de análisis

Toma de Muestra Extracción ADN

Detección amplificado Amplificación ADN


SYBR GREEN I
Micrografía de Célula infectada por virus Herpes
Micrografía de fase final de infección por virus Herpes
Virus Herpes Simplex
Subtipos de Virus Herpes
Mapa genético de Virus Herpes 1
Método de Detección de Virus Herpes 1 y 2
•Técnica: LightCycler® - HSV 1/2 Detection Kit
•Flexible: Permite la detección de 2 subtipos de
virus Herpes simultáneamente
•Sensibilidad: 10 copias/muestra
•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados
•Seguridad: Control interno para minimizar la
posibilidad de falsos negativos y Control
positivo para verificar efectividad del PCR
Peaks de Melting para la
diferenciación de Virus Herpes 1 y 2

Herpes 1 (53,9°C)

Herpes 2 (67,1°C)
Mycoplasma pneumoniae
Método de Detección de Mycoplasma pneumoniae
•Técnica: LightMix® for the Detection of
Mycoplasma pneumoniae
•Flexible: Permite la detección de Mycoplasma
pneumoniae específicamente (fragmento de
PCR de 342 bp)
•Sensibilidad: 10 copias/muestra (Detección
linear entre 10 y 107 copias)
•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados
•Seguridad: Control interno para minimizar la
posibilidad de falsos negativos y Control
positivo para verificar efectividad del PCR
Resultados del PCR Light Cycler para Mycoplasma pneumoniae
Bordetella pertussis
Mecanismo de patogenicidad de B. pertussis
Método de Detección de Bordetella pertussis
•Técnica: LightMix® for the Detection of
Bordetella pertussis
•Flexible: Permite la detección de Bordetella
pertussis específicamente (fragmento de PCR
de 181 bp correspondiente a IS 481)
•Sensibilidad: 1-10 copias/muestra (Detección
linear entre 10 y 107 copias)
•Rapidez: 3 horas para entrega de resultados
•Seguridad: Control interno para minimizar la
posibilidad de falsos negativos y Control
positivo para verificar efectividad del PCR
Tabla 1: Lista maestra de SeptiFast (SML)

Gram (-) Gram (+)


Escherichia coli Staphylococcus aureus
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) SCoN1
Serratia marcescens Streptococcus pneumoniae
Enterobacter (cloacae/aerogenes) Streptococcus spp.
Proteus mirabilis Enterococcus faecium
Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis
Acinetobacter baumannii 3
Stenotrophomonas maltophilia
Hongos
Candida albicans
Candida tropicalis
Candida parapsilosis
Candida glabrata
Candida krusei
Aspergillus fumigatus
Ilustración 1: RC G-, CH 610
Gráfico 1 Gráfico 2

Gráfico 3 Gráfico 4
Termociclador Labnet (PCR convencional)
PCR de tiempo real (Light CyclerTM)
Identificación genómica de patógenos Método
Laboratorio de Diagnóstico Molecular Mycobacterium spp. Real-Time PCR (LC)
Universidad Católica de la Santísima Concepción
Lista de Prestaciones-Mayo 2007 Mycobacterium tuberculosis complex Real-Time PCR (LC)

Helicobacter pylori Real-Time PCR (LC)

Virus Hepatitis C (HCV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Hepatitis B (HBV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus hepatitis A (HAV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Papilloma Virus Humano (PVH) Real-Time PCR (LC-Roche)

Genotipificación PVH oncogénicos Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Herpes Simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) Real-Time PCR (LC-Roche)

Mycoplasma pneumoniae Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Varizella-Zoster (VZV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Citomegalovirus Humano (HCMV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Virus Epstein-Barr (EBV) Real-Time PCR (LC-Roche)

Herpes virus Humano tipo 6 (HHV6) NESTED - PCR

Bordetella pertussis Real-Time PCR (LC-Roche)

Septifast Real-Time PCR (LC-Roche)

Enterovirus Real-Time PCR (LC-Roche)

Determinación de Carga Viral

Virus de la Hepatitis B (HBV) PCR-ELISA (Amplicor-Roche)

Virus de la Hepatitis C (HCV) PCR-ELISA (Amplicor-Roche)

Virus Inmunodeficiencia Humana ( VIH) NASBA BIOMERIEUX

Detección de Mutaciones Genéticas Humanas

Gen Factor V de Leiden (G→ A) posición 1691 Real-Time PCR (LC-Roche)

Gen Protrombina (G→ A) posición 20210 Real-Time PCR (LC-Roche)

Prestaciones varias área Biología Molecular

Inmunotipificación subpoblaciones leucocitarias Citometría de Flujo-FACS Scan


CD3/CD4/CD8
Inmunotipificación subpoblaciones linfocitarias Citometría de Flujo-FACS Scan
CD3/CD4/CD8/CD14

Inmunotipificación subpoblaciones linfocitarias Citometría de Flujo-FACS Scan


MUCHAS GRACIAS