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Objetivo

Definio, base gentica, princpios genticos dos marcadores moleculares, tcnicas que revelam a variabilidade nas sequncias de oligonucleotdeos que compem a fita de DNA. Comparar os diferentes tipos de marcadores e suas vantagens e limitaes. Por ltimo a aplicao dos marcadores no melhoramento de plantas e na agropecuria moderna.

Introduo
Cromossomos contm unidades informacionais transferidas de uma gerao para a outra. Idia proposta ainda no sculo XIX. Cada cromossomo contm uma longa e nica molcula de DNA, alm de protenas que atuam no empacotamento desta molcula. As tecnologias de anlise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referncia nos cromossomos, tecnicamente denominados marcadores moleculares

Definio
Em gentica, um marcador molecular (marcador gentico) um fragmento de sequencia de DNA que est associado a uma parte do genoma. Os marcadores moleculares so usados em biologia molecular e biotecnologia em experimentos em que eles usam para identificar uma determinada sequncia de DNA. Como as sequncias de DNA so altamente especficas, podem ser identificados com a ajuda de marcadores moleculares conhecidos que podem encontrar uma sequncia particular de DNA em um grupo de marcadores desconhecidos .

Marcadores moleculares denominam singularidades dentro de determinada sequncia de bases (taxa molecular), que promovem a "impresso digital" molecular. Temos uma seqncia de bases (ACGT, ou Rna: ACGU) totalmente misturada, e uma parte dela analisada, delimitando os pares de bases a serem analisados, determinando a sequncia.

Tipos de marcadores moleculares


Os distintos tipos de marcadores moleculares hoje disponveis diferenciam-se pela tecnologia utilizada para revelar variabilidade a nvel de DNA, e assim variam quanto habilidade de detectar diferenas entre indivduos, custo, facilidade de uso, consistncia e repetibilidade. Os principais tipos de marcadores moleculares podem ser classificados em dois grupos, conforme a metodologia utilizada para identific-los: hibridizao ou amplificao de DNA.

Entre os identificados por hibridizao(pareamento de fitas complementares de DNA):


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RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism; Bostein et al; 1980 ) Minissatlites ou locos VNRT (Variable Number of Tandem Repeats; Jeffreys et al; 1985). RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA: Willians et al; 1990); SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions); STS (Sequence Tagged Sites; Paran & Michelmore ; 1993) Microssatlite (Litt & Lutty; 1989); AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism; Vos et al; 1995).

Por amplificao incluem os marcadores do tipo:


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PCR
PCR, PolimeraseChainReaction, ocorre a amplificao do DNA atravs de duplicaes exponencialmente para extrao com o uso dos primers (nucleotdeos usados para transcrio, responsveis pelo incio do PCR), facultativo o uso do splicing (tcnica para clonar a sequncia codificada: os xons, e eliminando as no-codificadas: os ntrons seja l de onde for DNAr, mtDNA, RNAr, RNAm, RNAt ...) de clulas eucariticas A partir dos primers h a delimitao das seqncias, as sequncias retiradas e comparadas so as sequnciasalvo, com a anlise das mesmas.

Anlise gnica

A figura acima mostra anlise de uma reao em PCR de 48 sequencias de um genoma de DNA procarionte.

Um dos aspectos mais fundamentais da revoluo causada pela PCR foi a possibilidade de se gerar grandes quantidades de DNA de segmentos especficos do genoma. DNA em grande quantidade pode ser facilmente detectado a olho nu diretamente em gel de eletroforese atravs de corantes especficos para DNA (ex. brometo de etdio).

Entretanto, a tcnica de PCR apresentava uma limitao significativa na obteno de marcadores moleculares annimos distribudos pelo genoma. A construo de primers para a amplificao via PCR dependia essencialmente do conhecimento prvio das sequncias de nucleotdeos que flanqueiam a sequncia de DNA de interesse. Para se conhecer estas sequncias necessria a clonagem e sequenciamento da regio.

RAPD
RAPD Random Amplified Polymorphic DNA basicamente uma variao do protocolo de PCR, com duas caractersticas distintivas: Utiliza um "primer" nico ao invs de um par de "primers"; O primer nico tem sequncia arbitrria, e portanto sua sequncia alvo desconhecida.

Microssatlites
Microssatlites tm sido observados em diversos organismos como em seres humanos, baleias, Drosophila, camundongos, bovinos e caprinos, entre outros. Em plantas, uma busca em bancos de dados de sequncia de DNA publicadas revelou que os stios de microssatlites so largamente distribudos com uma frequncia de uma a cada 50 mil pares de bases. Sua presena foi constatada em 34 espcies vegetais, sendo que o elemento repetido mais comum foi o di-nucleotdeo AT.

O microssatlite no locus consiste em pequenas seqncias renovadas (usualmente di, tri ou tetranucleotdeos, ou seja, 2, 3 a 4 pares de bases) que esto em seguimento num local particular do cromossomo com uma variao no nmero de cpias, frequentemente com um desperdcio por superabundncia de distinguveis alelos dentro de uma populao.

Cada ilha microssatlite, independente do elemento repetido (CA, TG, ATG, etc.)constitui um loco gentico altamente varivel, multiallico, de grande contedo informativo. Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco.

A deteco de sequncias SSR via PCR feita em gel de eletroforese utilizando-se poliacrilamida ou agarose especial de alta resoluo, uma vez que necessrio um gel adequado para a separao de segmentos que diferem por poucos pares de bases, dependendo do nmero de nucleotdeos do elemento repetido no microssatlite. A visualizao das bandas no gel pode ser feita diretamente por colorao com brometo de etdio, nitrato de prata ou atravs de autoradiografia

O Uso de Marcadores Moleculares no Melhoramento Animal


Um exemplo do uso de marcadores moleculares pode ser citado no caso da sndrome do estresse de sunosPSS. A sndrome do estresse em sunos (porcine stress syndrome, PSS) ou hipertemia maligna responsvel por perdas considerveis na suinocultura, tais como altas taxas de mortalidade dos animais e baixa qualidade da carne. Animais portadores da PSS apresentam uma maior incidncia de carne plida, mole e exsudativa (pale, soft and exsudative, PSE), causando rejeio pelo consumidor e perdas para os frigorficos (peloso, 1994 e Bakstrom e Kaufman, 1995 )

A PSS resultado de um mudana de uma nica base no receptor de rianodina. A mutao a substituio de C por T na posio 1843 na sequncia do gene do RYR1. Esta alterao de base resulta na modificao do cdon e promove substituio de uma arginina por uma cistena. Esta mesma mutao foi encontrada em animais de vrias raas, sugerindo a existncia de um ancestral comum. A existncia de outras mutaes no mesmo gene, confirmam esta hiptese (Fujji et al; 1991).

O teste de DNA desenvolvido para detectar a PSS utiliza-se de reao em cadeia da polimerase (PCR) para amplificao especfica de um fragmento do gene RYR que flanqueie a posio 1843. Em animais heterozigotos, apenas metade do produto amplificado digerido, e isto resulta na visualizao de 3 bandas no gel. Se homozigoto recessiva, a sequncia de DNA amplificada no possui o stio de restrio e no ocorre a digesto do produto amplificado.

Em animais heterozigotos, apenas metade do produto amplificado digerido, e isto resulta na visualizao de 3 bandas no gel.

Concluso
Diversas tcnicas de biologia molecular esto hoje disponveis para deteco de variabilidade gentica ao nvel de sequncia de DNA, ou seja, para a deteco de polimorfismo gentico. Estas tcnicas permitem a obteno de um nmero virtualmente ilimitado de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo. Tais marcadores podem ser utilizados para as mais diversas aplicaes, tanto no estudo de gentica como na prtica de melhoramentos nos animais.

Bibliografia
Ferreira, Mrcio Elias; Grahapoglia, Dario. Introduo ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica. Editora Embrapa, 3a Edio, pg. 40-53. Informe Agropecurio. Belo Horizonte, vol. 21, n 204, pg. 67-78. Backstrom, L. and Kauffman, R., 1995, The porcine stress syndrome a review of genetics, environmental factors, and animal well-being implications, agri-practice. pg. 16-24. Coutinho, L.L. and Regitano, L.C.A., 1995. O uso de marcadores moleculares na indstria animal. Anais do Dcimo-primeiro Congresso Brasileiro de Reproduo Animal, pg. 195-205.