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Manipulao de Fungos Micorrzicos Arbusculais I:

Colorao das razes e


Quantificao de colonizao

Fernanda Covacevich

Fungos Micorrzicos Arbusculais = FMA


Presentes em solos de todos os ambientes
Colonizan internamente as razes das plantas Forman arbusculos

A simbiose e mutualista (P C)
So simbiontes obligados

Dificultades nel estudo dos FMA

A simbiosis (colonizao e potencial micorrcico) afetada pelo clima, planta hospedera, tipo de solo, practicas de manejo: fertilizao
Dificultades experimentais: simbiontes obligados. Cultivo e inculos deben conter planta hospedera. Crescimento em sustrato similar ao solo. Dificultad na esterilizao do sustrato. Tino (colorao) e observao por mtodos estndares no diferemcian tecido fngico vivo e no vivo. Identificacin taxonmica, em constante mudana.

Microscpica: laboriosa, caracteres taxonmicos de esporas no permanentes.


Molecular: cara (reagentes, equipamento), as veces os resultados no coinciden com a identificao taxonmica.

Por onde comear?

Observao da colonizao pelas metodologias clssicas: Extrao e Colorao das razes

As estruturas produzidas por FMA so invisveis em razes frescas porque as estruturas internas so obscurecidas pelos pigmentos naturais e contedos da clula dentro das razes.

Aps lavagem das razes, o primeiro passo e o procedimento de clareado onde se usam agentes qumicos como lcali quente (KOH) para remover contedos e pigmentos da parede da clula

As estruturas fungicas em tecidos das planta podem ser observadas pela presena de estruturas de cor formadas pela unio do corantes com as paredes das hifas fungicas que contrasta bem sobre ou material da raiz que fica clareado. Corantes como Azul Trypan, Azul de Metilo, Chlorazol E preto (CBE) em lactoglycerol, ou tinta de caneta em vinagre usado para colorir estruturas de FMA (Bevege 1968, Phillips & Hayman 1970, Kormanik & McGraw 1982, Brundrett et al. 1984, Vierheilig et al. 1998).

Passos bsicos a seguir para colorao das razes pelo mtodos tradicionais (no vitais):
Equipamentos Estufa ou banho a 90 C, ou autoclave Pia para lavar solo e razes com torneira com gua Peneiras (ou colador 100 m) Tubos plsticos ou vidros para 90 C Pinas Soportes- Canetas Rotulos

Reagentes
80 % ethanol ou methanol (v/v) para preservar razes
10 % KOH (w/v potassium hydroxide) disuelto em agua. Esta uma reao exotermica: usar um container resistente ao calor!

HCl ,1 N
Lactoglycerol (1:1:1 V/V/V acido lactico, glycerol e agua). Reagente corante (variable, depende do disponivel no lab) disueltos em lactoglycerol
Azul tripan (trypan blue), 0.05 % w/v (provabel carcinogeno!) Azul de metilo, 0.05 % w/v Chlorazol black E (CBE), 0.03 % w/v, primeiro disolver em agua e depois adicionar iguais cantidades de acido lactico e glycerol (provabel carcinogeno!) 5 % Ink in vinegar

Lactoglycerol ou soluo glycerol-agua (50% v/v) para armacenar as raices coloreadas

Lavar bem as razes para tirar todo o solo. Separar parte area. Si a colorao no se vai fazer na hora, armazenar razes em alcohol 80 % Cortar as razes em segmentos 2-3 cm e homogeneizar a amostra Si presena de razes finas e grossas bem diferentes, conveniente separar as razes e trabalhar com dois sub-amostras (fina-grossa)

Colocar as razes em KOH a 90 C 30-40 min, ou a temperatura ambiente toda a noite (o tempo pode ser maior si as razes so velhas e pretas). O recipiente e quantidade de reagente deve permitir as razes ficar bem molhadas Lavar 4-5 vezes em gua. Acidificar com HCl 0,1 N 5 min

Colocar as razes em lactoglycerol com corante a 90 C 5 min, ou a temperatura ambiente toda a noite O recipiente e quantidade de reagente deve permitir as razes ficar bem molhadas Lavar 4-5 vezes em gua.

Conservar as raizes em lactoglycerol ou glicerol-agua

Quantificao microscpica da colonizao

Consideraes adicionais
O procedimento de clareado requere amostras de raiz no maiores que 1-2 g por container. Si a quantidade e maior as razes podem ser clareadas insuficientemente, talvez devido a baixas temperaturas, tempos curtos, ou diluo do reagente.

Razes que so clareadas insuficientemente ainda tero contedos de clula (estruturas obscuras) e as estruturas micorrzicas no podero ser bem observadas, enquanto aps uma clareao demais as razes podem desintegrar, perdendo as clulas corticais e no se podero fazer as observaes.

A clarificao mais rpida em um autoclave que prov os meios eficientes de processar amostras. Um ciclo de lquidos de autoclave de 15-20 minutos s 121 C normalmente suficiente. Amostras que contm razes velhas, razes com abundantes fenis, ou amostras de razes de campo (floresta) podem requerer tempo adicional (25-60 minutos). Use recipientes resistentes ao autoclave.

Cheia menos que um-tero do container com as razes para evitar transbordamento no autoclave.

As razes tambm podem ser clareadas em um banho de gua ou estufa aquecendo o KOH a 8090 C. O tempo requerido com este mtodo varia amplamente - razes de plantas jovens normalmente requerero s 30-40 minutos, mas amostras de coletadas no campo ou razes velhas e pretas podem exigir clarear mais tempo (de 5 horas a vrios dias).

Uma hora de clarear a 60 C aproximadamente equivalente a 5 minutos em um autoclave a 121 C.

Uma mais baixa concentrao de KOH (2.5%) pode ser usado para reduzir o risco de dano (Koske & Gemma 1989), mas pode no ser efetivo com razes que so duras clarear.

Alguns laboratrios no fazem a acidificao com HCL, com bons resultados

As razes podem ser coradas


a) Aquecendo durante 15 minutos a 90 C, b) Em um autoclave 15 minutos, um ciclo a 121 C, ou c) Deixando a soluo corante a temperatura ambiente durante um ou mais dias.

A soluo corante pode ser usada de novo vrias vezes filtrada por tecido de algodo dobrado ou tela de fibra sinttica boa depois de cada uso (para remover fragmentos de raiz), at que fica translcido.

As razes podem ser coradas Azul Trypan (Bevege 1968, Phillips & Hayman 1970, Kormanik & McGraw 1982). Uma concentrao de 0.05% w/v em lactoglycerol usada freqentemente para corar razes clareadas como descrito acima.
As imagens coradas com Trypan tm mais baixo contraste que as coradas com CBE (Brundrett et al. 1984). Mais o trypan adequado para avaliao de nveis de colonizao onde o contraste de cor pode ser benfico.

Outra proporo que pode ser usada para o azul tripan

em lactoglycerol (Segundo Amy Burton)

1 L glycerol 950 ml distilled water 50 ml acetic acid 0.2 g trypan blue

A Fuchsina cida, azul de metilo e azul algodo tambm podem ser usados para corar FMAs em razes, mas o cor solta rapidamente e produz imagens de baixo-contraste (Brundrett et al. 1984).

Um mtodo de colorao recentemente desenvolvido usa tinta e vinagre (Vierheilig et al. 1998, 2005). esta soluo manchando consiste em uma tinta (pode ser de caneta, 5%) diluda em vinagre (5% cido actico).

Casos especiais... Mais moito frequentes

Trabalhando com razes muito pigmentadas ou velhas


A clarificao com KOH dever ser mais prolongada. Isso remover mais fenis das razes. Mas isso pode no ser apropriado se amostras de raiz tendem a desintegrar, ou pode conter metabolitos secundrios nas paredes que so resistente a clarear.

Aps a clarificao com KOH colocar as razes com perxido de hidrognio alcalino (0.5% NH4OH e 0.5% v/v de H2O2 em gua) ou perxido de hidrognio s. O perxido efetivamente remove qualquer combinao de fenis das razes clareadas (Bevege 1968, Kormanik & McGraw 1982). O tempo requerido para razes a descolorar nesta soluo varia entre amostras. Este procedimento as vezes pode reduzir a eficincia da posterior corao com azul

Mtodos alternativos Corao que revela a presena dos tecidos fungicos vivos
Succinato dehidrogenasa (SDH) Podem ser usados procedimentos de corao vitais que medem atividade de succinato dehydrogenase (enzima das mitocndrias) para confirmar aquela hifa de fungo que metabolicamente ativa (Vierheilig et al. 2005). Porm, a avaliao de nveis de colonizao prov informao semelhante com as de colorao com azul (no vital).

Protocolo SDH
Clarificar as raizes 2h at temperatura ambiente em :
20ml 0.05 M Tris/citric acid pH 9.2 50mg/ml sorbitol 15 units/ml cellulase (from A. niger) 15 units/ml pectinase (from A. niger).

Lavar as raizes . Adicionar 20ml solution: Incubar as raizes overnight a temperatura ambente Lavar com agua destilada Colocar as raizes em soluo hypochlorite sodium (containing 3% and 1% active chlorine separately) 5min, Lavar com agua destilada Observao microscopio

Tris/HCl (pH 7.4) 0.2 mol, MgCl 25 mmol, Nitro-blue Tetrazonium 4 mg/ml, H2O 6Na-succinate 2.5 mol.

Fosfatasa Alcalina (ALP)


E um procedimento descrito por Tisserant et al. (1993), que evidncia as enzimas fosfatasas alcalinas que esto presentes nas vacuolas dos tecido fungicos A observao mais dificil que a tino com azul.

Os resultados de colonizao so menores que com azul mais em geral os padres so os mesmos

Protocolo ALP
Clarificar as raizes 2h at temperatura ambiente em :
20ml 0.05 M Tris/citric acid pH 9.2 50mg/ml sorbitol 15 units/ml cellulase (from A. niger) 15 units/ml pectinase (from A. niger).

Lavar as raizes . Adicionar 20ml solution:


Tris/citric acid (pH 9.2) 0.05 mol, a -naphthyl acid phosphate 1mg/ml, Fast Blue RR salt 1 mg/ml, MgCl 20.5 mg/ml, MnCl2. 4H2O 0.8 mg/ml

Incubar as raizes overnight a temperatura ambente Lavar com agua destilada Colocar as raizes em soluo hypochlorite sodium (containing 3% and 1% active chlorine separately) 5min, Lavar com agua destilada Observao microscopio

RAIZ SIN COLONIZACION MA

INICIO DE LA INFECCION. APRESORIO

FORMACION DE ARBUSCULOS

FORMACIN DE VESCULAS

Bibliografia

Amy Burton, Penn State University Laboratory web site, ALB425 @ psu.edu
Brundrett M, Bougher N, Dell B, Grove T, Malajczuk N. 1996. Working with Mycorrhizas in Forestry and Agriculture (Chapter 4.2, pp. 179-183). Phillips, J., Hayman, D., 1970. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transaction of the British Mycological Society 55, 158-161. Tisserant, B., Gianninazzi-Pearson, V., Gianinazzi, S., Gollote, A., 1993. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections. Mycological Research 97, 245-250. Vierheilig H, Coughlan Ap, Wyss U, Y Piche. 1998. Ink and Vinegar, a Simple Staining Technique for Arbuscular-Mycorrhizal Fungi. Applied And Environmental Microbiology, Vol. 64, No. 1250045007 Vierheilig et al. (2005)

70

S upe rfo s fa to

0 -P 1 5 -S F 3 0 -S F 6 0 -S F

70

R o c a fo s fa to

60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30
-1

Inte ns idad de micorrizacin (% )

Inte ns idad de micorrizacin (% )

60 50 40 30 20 10 0

Es ti m a da

M (% )= 4 6 ,8 - 2 ,2 * P s i P < 1 8 ,3 M (% )= 6 ,9 s i P > 1 8 ,3 r = 0 ,4 8 F (2 ,6 1 ) 2 8
2

40

50

10

20

30
-1

40

50

P B ra y (mg k g )

P B ra y (mg k g )

Figura. Intensidad de micorrizacion en agropiro y festuca en funcin de la disponibilidad de P en el suelo. Datos de ocho muestreos estacionales durante dos aos.