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ricerca di base
WESTERN BLOT
E’ una tecnica che permette di evidenziare la presenza di una
proteina in una linea cellulare o tessuto, utilizzando un sistema di
rivelazione che prevede l’utilizzo di anticorpi
Cellule fissate
METODI IMMUNOCHIMICI INDIRETTI
Cellule fissate
IMMUNOISTOCHIMICA
(immunocitochimica)
IMMUNOFLUORESCENZA
Materiale occorrente:
•2 Primers gene specifici: sequenze di 17-35 basi
complementari alla sequenza nucleotidica del gene (parte
di esso) di interesse, uno all’inizio, l’altro alla fine.
Vengono riconosciuti dall’enzima polimerasi
•L’enzima POLIMERASI (DNA polimerasi DNA-
dipendente)
•Un termociclizzatore
Ogni ciclo avviene a tre diverse temperature, ad ognuna delle
quali corrisponde un evento:
Promotore regolabile
(inducibile)
cDNA
5’ 3’
MCS
P
PROMOTORE P
REGOLABILE
Proteina di fusione
Ai batteri in crescita in terreno di coltura viene
aggiunto l’induttore (IPTG)…….
g e n e d a n o i in s e rito
G ST
T R A D U Z IO N E
G ST
P ro te in a c o d ific a ta d a l
g e n e d a n o i in s e rito
G S T (p ro te in a )
….. I batteri vengono poi lisati mediante l’uso di ultrasuoni
(SONICAZIONE).
Per separare le proteine di fusione da tutte le altre proteine
batteriche che non ci interessano sfruttiamo la capacità della
GST di legare il suo substrato naturale, ossia il glutatione.
Quest’ultimo viene fornito anche legato covalentemente a
palline di Sefarosio (Glutatione Sefarosio 4B).
La proteina “fusa” può servire a purificare la proteina ricombinante:
Promotore
“inducibile”
GST GST
Proteina di fusione
Proteina di interesse
pMAL
cDNA
di interesse
-
Sefarosio
con legato
glutatione
Eluizione
G L U T A T IO N E
S E FA R O S IO 4B
M o le c o la d i g lu ta tio n e
n o n le g a te a s e fa ro s io
M o le c o la d i g lu ta tio n e
G L U T A T IO N E
S E FA R O S IO 4B
L e m o le c o le d i g lu ta tio n e lib e re c o m p e to n o
c o n q u e lle le g a te a l s e fa ro s io p e r il le g a m e c o n
le p ro te in e d i fu s io n e , d e te rm in a n d o n e il
p ro g re s s iv o d is ta c c a m e n to .
P R O T E IN A D I F U S IO N E
Gel di proteine colorato con
Blu di Comassie
Risposta
Il sangue viene centrifugato
TEST ELISA