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Universidade de So Paulo Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto Departamento de Cincias Farmacuticas Disciplina Mtodos in vitro Alternativos para

a Avaliao da Segurana de Cosmtico Prof. Dr. Lorena Rigo Gaspar Cordeiro

HET CAM

Hens egg test chorioallantoic membrane (Teste em membrana corion-alantide de ovo embrionado de galinha)

Bruna Juliana Moreira Danielle de Macedo Mano

HET CAM mtodo alternativo para o teste de Draize

pages.cthome.net/pageone/revlonad.jpg

Controle de Qualidade Sade Humana Grupo de defesa animal

Mtodos alternativos Reprodutibilidade

Questes ticas

Reduo de custos

Confiabilidade

(Conrado, 2007)

Mtodos Validados

EpiSkin TM; Rat TER; Epi-dermeTM testes de corrosividade; 3T3-NRU - teste de fototoxicidade; Teste in vitro para absoro

percutnea; Ensaio do linfonodo local murino (LLNA); Testes de Elisa para avaliao da potncia das vacinas anti-erisipela; Testes de Elisa para avaliao da potncia das vacinas anti-ttano; Teste da inibio da ligao de toxina

Testes Recomendados para a Irritao Ocular in vitro (EPA)


Teste

no olho isolado da galinha

(ICE) Teste no olho isolado do coelho (IRE) HET-CAM Opacidade e permeabilidade na crnea bovina (BCOP)

Anlise semi-quantitativa do potencial irritante de um produto (produtos solveis, emulses, gis e leos), sobre a membrana Crio-Alantide (CAM) do ovo embrionado de galinha.

HET-CAM

Fonte:http://www.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.zet.or.at/spool/gfx/1201014590HetCamInfo.jpg&imgrefurl=http://www.zet.or.at/subnode,2,129,en,HET_CAM_Test,lifescience.php&usg=__LIQdD8nXqxHGMDTBGv4iGRSd2cE=&h=450&w=564&sz=182&hl=ptBR&start=0&zoom=1&tbnid=Sp1Me7Jt6N9dVM:&tbnh=156&tbnw=196&prev=/images%3Fq%3DHET%2BCAM%26hl%3Dpt-BR%26client%3Dfirefox-a%26sa%3DG%26rls%3Dorg.mozilla:ptBR:official%26biw%3D1280%26bih%3D619%26gbv%3D2%26tbs%3Disch:1&itbs=1&iact=hc&vpx=169&vpy=93&dur=471&hovh=156&hovw=196&tx=125&ty=110&ei=nciLTOjHsP48AbktdGeCg&oei=nciLTOj-HsP48AbktdGeCg&esq=1&page=1&ndsp=16&ved=1t:429,r:0,s:0

Efeitos Avaliados
Efeitos

irreversveis Efeitos corrosivos Potencial de irritao severa

Substncias Avaliadas
Produtos Componentes Compostos

qumicos individuais

(CONRADO, 2007).

Caractersticas da CAM
Fuso

do crion com a alantide Membrana transparente Vasos sanguneos similar ao dos tecidos da mucosa ocular, com eritrcitos e leuccitos

Metodologia

http://www.schrader-institute.de/htm_engl/creachem_tox_ver.htm

(Cazedey, 2009)

Sinais de Irritao Observados


Hiperemia:

aumento do nmero de vasos ou da intensidade de cor dos j existentes Efeitos nos vasos Hemorragia sanguneos: preditores
da toxicidade e dano na conjuntiva ocular

Denaturao proteica um indicador dos Coagulao


efeitos nas clulas epiteliais, ou seja, relacionados s primeiras camadas e a crnea.

Histrico HET CAM


Mtodo

desenvolvido por Luepke

(1985)

Luepke e Kemper (1986)

(Luepke, 1985)

(Luepke, 1985)

Parmetros do Mtodo
Umidade

relativa Volume de amostra aplicado Nmero de replicatas Uso de controles positivos e negativos

Mtodo HET-CAM: principais autores


Luepke 1985/ Kalweit et Balls et al., Balls et al., e Kemper al. 1990 1995 1995 1986 Veculos, dye, classes shampoos/ qumicas Subst e form. Leghorn branca Leghorn branca ECETOC opacos

Steiling, 1999

Subst. testadas Raa da galinha

ECETOC Subst. transparentes utilizadas em cosm. Leghorn branca Peso de 50 g

Seleo do Peso entre 50ovo 60g T (C) Umrel. (%) 37,5 + 0,5 62,5 + 7,5 38 60

37,5 + 0,5 55 + 7 Anlise no 10 dia 9 dias 9 dias 10 dias 0,3 mL 100%

Viabilidade Anlise no 5 Anlise no do ovo dia e aps 9 dia Incubao 10 dias 9 dias 0,3 mL 1% e 10% Vol. de aa 0,2 mL ou 0,1 g aplicado / 0,2-0,3mL []da subst. 0,1-100%

Luepke 1985/ Kalweit et Balls et Balls et Steiling, 1999 e Kemper al. 1990 al., 1995 al., 1995 1986 Apli. da aa Direta/ na CAM Sol. da aa 3 min 25% da CAM Subst transp. - 30 s At 5 min Texapon AV (5%) 6 ovos At 5 min Texapon ASV 6 ovos

Contato com Aps 20 s lavar a aa c/ 5 mL de H2O t anlise Controles Replicatas Mtodo analtico 0,5; 2 e 5 min. At 5 min. veculo 4 ovos 6 ovos

A partir de 30s Texapon AV (5%) 6 ovos

O score dado Usa a frm.: S score Q score Q score com por um valor (301max de com subst base em subst nico (at 21). sH)/300*5+( 18 ref. ref. Q 1. E S 301score sL)/300*7=( 301-sC)*9

Vantagens
Ensaios in vitro: sistemas mais simples e mais facilmente controlveis, geralmente so mais sensveis, reprodutveis, rpidos, econmicos, produzem uma quantidade menor de resduos alguns so passveis de automao. HET-CAM: um teste econmico fcil implantao no laboratrio (no requer grande espao fsico), no requer equipamentos especializados, tem durao mdia curta

(Conrado, 2007)

Necessidade

de tcnico treinado Subjetividade na anlise dos resultados No possvel analisar caractersticas morfolgicas e fisiolgicas A resposta irritativa limitada devido a imaturidade do sistema imune do embrio No avalia efeitos txicos de longo prazo Materiais insolveis, slidos ou viscosos podem apresentar problemas de reprodutibilidade Corantes e pigmentos interferem na colorao da membrana Variaes relacionadas ao ovo tambm devem ser consideradas: gentica da

Desvantagens

(ICCVAM, 2006)

Aplicao da Amostra

(Hagino, 1999)

Mtodo HET-CAM: Gettings et al., surfactantesHagino et Rougier et al., De Silva et al., al., 1991 1992 1992 1996
Raa da galinha Seleo do ovo T incubao Um. rel. (%) Vol. aplicado []da subst. testada Aplicao t de contato t anlise At 5 min 38 + 0,5C 60 + 5 0,3 mL 3[]: uso, 10%, 100% Solubilizao 37,6 C 70 0,2 mL 10% Solubilizao 20s - gua 0,5; 2 e 5 0,5; 2 e 5 Lohmanns selected leghorn branca Leghorn branca Leghorn branca Peso entre 50 a Peso entre 50 a 60g 60 g 37,5+0,5C 38C 62,5 0,3 mL 60 + 5 0,3 mL 10% da testada in vivo Direta/ na CAM 20s sol. salina 0,5; 2 e 5

Uso de Controles
Controles

positivos :

NaOH 0,1M Soluo de dodecil sulfato de sdio a 10% Lauril sulfato de sdio 1%
Controles

negativos :

soluo tampo pH 7,4 soro fisiolgico NaCl 0,9%

(Vinardell, 1994)

German HET-CAM Validation Study: Restrospective Analysis of Positive Controls (1% SLS and 0,1N NaOH), concurrently tested with coded test chemicals GENSCHOW et al., 2005

12 labs em 2 grupos Endpoint Subst. Tempo Anlise dos 3 endpoints Nenhuma diferena significativa Hemorragia 0,1N NaOH 9,16 foi encontrada intra e 8,74 interlaboratorial.
1% SLS 15,16 14,12 Coagulao 0,1N NaOH 51,02 44,76 1% SLS 0 0,35 Lise 0,1N NaOH 37,99

Mtodo HET-CAM: pesticidas Budai et al., Budai e Varnagy, Balls et al., 1995
Raa da galinha T(C) incubao Umidade rel. (%) Incubao Vol. aplicado 1997 Leghorn branca 37 60-70% 10 dias 0,3 mL 2000 37 60-70% 10 dias 0,3 mL 9 dias Leghorn branca Leghorn branca

[]da subst. testada 1%, 10%, 100% Aplicao da aa Tempo de contato t anlise Controles At 5 min + 1% SDS e 0,1M NaOH,- 0,9% NaCl 4 ovos IS score at 21 At 5 min + 1% SDS e 0,1M NaOH, - 0,9% NaCl 4 ovos IS score at 21 Solubilizao Solubilizao Lavar aps 3 min A partir de 30 s Texapon AV 5%

Replicatas Mtodo analtico

6 ovos S score

Perodo de Incubao
4

Caractersticas da CAM

e 10 dia: aumento da alantide

dia: fuso da alantide com a coride Formao da CAM

At

9 dia: crescimento da rea superficial. 11-14 dia: desenvolvimento das fibras

Mtodo HET-CAM: subst. Spielmann quim. 1997 Hagino et CEC 1991 Kalweit et al., 1993 al., 1987 et al.,
T (C) Um. rel. (%) Incubao vol. aplicado []da subst. testada 10% 37,6 70 10 dias 37,5 + 0,5 62,5 10 dias 38 60 9 dias 0,3 mL 0,05 - 100% (w/v)

Van Erp et al., 1990

10 dias 0,2 mL

0,2 mL ou 2 0,3 mL ou g 0,1 g 100% 0,1-100%

Aplicao Solubilizao DiretamenteDiretamente Solubilizao t de contato controles Replicata Mtodo de 3 ovos IS e ITC 4 ovos 6 ovos frmula 5 min p/ insolveis 20 s 20 s Tolueno e acetona 4 ovos IS 21 pontos IS 21 pontos IS 21 pontos

HET-CAM x Teste in vivo em Coelho


CAM x olho de mamferos
Conjuntiva

mucosas funcional CAM muito fina e mais primitiva do que a conjuntiva Resposta da crnea no muito avaliada. No avalia efeitos sistmicos ou tardios Resposta imune imatura: morte celular

similar: membranas com sistema vascular

Mtodo HET-CAM: exemplos Gettings et Gettings et Luepke Lnnroth Djabari et al.,


al., 1994 al. 1991 1985 et al., 1999 2002 Subst. Emulso O/A Form. testadas hidroalcolica Raa da galinha Leghorn branca Lohmanns selected leghorn branca Shampoo Produtos Sintticos ou dentais biotecnolgicos

Leghorn branca

Leghorn branca

Seleo do ovo T (C) de incubao Umidade rel. (%) Incubao Vol. de aa 38

Peso entre 50 a 60 g 37,5+0,5

Peso entre 50 a 65g 38 37,8

60 9 dias 0,3 mL 10 dias 10 dias 0,2 mL ou 9 dias 0,1-0,2 mL 10 dias

Gettings et Gettings et al. 1991 al., 1994 Aplicao da Solubilizao amostra da amostra Tempo de contato com a aa t anlise Controles At 5 min

Luepke 1985

Lnnroth et Djabari et al., 1999 al., 2002

Diretamente Solubilizao Solubiliza na CAM da aa o da aa Aps 20 s lavar com 5 mL de gua 0,5; 2 ; 5 min At 4 min. Veculo +0,1 NNaOH; - 0,9% NaCl Hemorragia, coagulao e lise 3 ovos At 5 min

End points

Hemorragia, Hemorragia, coagulao e coagulao e lise lise 3 ovos 4 ovos

Replicatas Mtodo analtico

O score at O score at O score at 21 21 21 Classificao No irr. 0-0,9; No irr. 0-0,9;

Mtodos Analticos
IS

Irritation Score A e B Q score S score mtc value ITC method

Irritation Score (IS)


IS

O endpoint tempo dependente. Score de 0 a 21

IS

Cada endpoint somado para obter um valor global da amostra analisada


Fenmeno t<30s Hiperemia Hemorragia Coagulao 5 7 9 Tempo (t) 30s<t<2 min 2 min<t<5min 3 5 7 1 3 5

Usa uma frmula para obter o valor global

Irritation Score (IS)


Classificao das formulaes quanto ao grau de irritao de acordo com a pontuao atribuda (P) para os sinais de irritao segundo o teste de irritao in vitro em modelo organotpico HETCAM Pontuao atribuda Classificao quanto ao grau amostra P<1 1<P<5 5<P<9 P>9 de irritao Praticamente no irritante Ligeiramente irritante Moderadamente irritante Irritante

Q - Score
Compara

a substncia teste com uma referncia. Determina o IS das duas substncias e calcula uma proporo (teste/referncia)
Q- Score (Balls, 1995) < 1,5 1,5 < Q < 2 >2 Q Score (Brantom et al., 1997) < 0,8 0,8< Q < 1,2 1,2 < Q < 2 >2 Categoria de Irritao No irritante Leve Moderado Irritante Severo

S - Score

Maior pontuao total para um endpoint utilizado o ponto mais sensvel O score para cada parmetro (0-3) somado para todos os ovos (normalmente 6 ovos) Mximo de 18 com replicata de 6 Parmetro analisado varivel de uma substncia para a outra Q Score (Brantom et al., 1997) <6 6 < S < 12 12 < S < 16 >16 Categoria de Irritao No irritante Leve Moderado Irritante Severo

Q- Score (Balls, 1995) <6 6 < S < 15 >15

ITC
Menor

concentrao necessria para desenvolver uma reao fraca na CAM


ITC (% [ ]) >10 >10 < 10 < 10 < 2,5 1 < ITC < 2,5 <1 IS 10 < 16 >16 < 16 >16 < 16 >16 Categoria de Irritao No irritante / leve Moderado Moderado Irritante Irritante Severo Severo

Mtodo HET-CAM: subst. e Luepke form. ; Spielmann De Silva et Doucet et Bagley et al. et al., al. 1992 al., 1999 1992 Kemper
1986 Seleo do ovo T (C) Um. rel. Incubao Manipula o da CAM []da subst. 0,1%, -100% testada Aplicao t de contato controles Diretamente 20 s gua Solubiliz. 10 dias 37,8 55% 9 dias 1997 Peso entre 50 a 60 g 38 60 + 5% 10 dias Peso entre 50 a 60g 37,5 + 1 60 + 5% 10 dias Aplicar 5 mL de 0,9% NaCl 10% da Surf. 3%; l. testada in 10%,emulso vivo 100% Diretamente 20 s 20 s - sol. Salina; + 0,3% SDS 10% da testada in vivo Solubilizao 20 s veculo 37,5 62,5% 10 dias

Comparao Estatstica entre os Mtodos Analticos


Mtodo Preciso Sensibilida Especifici Falso Falso Subst Analtico de dade Positivo Negativo Analisada IS (A) -10 IS (A) 100 48-50% 85% 24-25% 100% 68-70% 87-93% 100% 36-44% 100% 83% 64-67% 40-47% 43-46% 60-67% 0% 17% 33-36% 52-59% 54-57% 33-40% 75-76% 0% 30-32% 6-13% 0% 56-64% surfactant e Form O/A lcool lcool lcool e ster cido carboxilico

IS (B) 10 65-68% IS (B) 100 51-57% Q Score S - Score 61-64% 44-50%

Sensibilidade do mtodo

(Hagino, 1999)

Algumas Substncias Substncia Classe Testadas Uso [ ]intestada Forma Qumica vitro fsica
trietoanola mina EDTA amina Amina; Intermedirio, cido aditivo carboxilco Cosmticos 10% 100% soluo slido

IS

Class

10,75 0

Severa No irritante

Formulao hidroalclic a 2-10% Formulao hidroalclic a 10-90% Emulso O/A HZC Polietilenogl icol 400 TA no inico

100%

soluo

4,6

Moderada

Cosmticos

100%

soluo

13,6

Severa

Emoliente Polmero/ TA

100% 100%

soluo lquido

0,283 14,68

No irritante Severa

Validao
Variaes

nos protocolos de

realizao Variaes no mtodo de anlise Variaes quanto ao material utilizado e as condies de incubao Nenhum dos mtodos amplamente aceito

Substncias analisadas por diferentes laboratrios Classificao Referncia Substncia [] testada Caract fsicoScore
qum Q score acetona 100% lquido 18,36 13,53 0,8 Captan 90 100% slido 0 0 6 Ciclohexanol 100% lquido 4,48 5,20 6,69 Hidrxido de Sdio 1% soluo 6,34 6,17 4,80 Severo Severo No irritante No irritante No irritante Moderado Severo Severo Severo Severo Severo Severo Balls et al. 1995

Balls et al. 1995

Balls et al., 1995

Balls et al., 1995

(McNamee, 2009)

Concluses
Mtodo com aplicao diversas reas qumicas
Cosmticos

em

Alcois

Solventes

Aminas

Materiais de limpeza

Ac. Carboxlicos

Heterocclicos Surfactantes (Kishore, 2008)

Concluses
No

substitui completamente o Draize No avaliar irritantes a longo prazo nem a reversibilidade de efeitos. Reduz o nmero de animais utilizados. Seleciona irritantes severos Pode ser utilizado como CAMTrypanBlueStain

Estratgia de Teste para Irritao Ocular - GHS


Nenhum efeito severo

Sem propriedades irritantes

No corrosivo

Nenhum dano srio

No provoca irritao ocular

Referncias Bibliogrficas

BRASIL, MINISTRIO DA SADE. Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Guia para avaliao de segurana de produtos cosmticos. Braslia, 2003. Disponvel em <www.anvisa.gov.br> Acesso em 09/2010. CAZEDEY, E.C.L. et.al. Corrositex, BCOP and HET-CAM as alternative methods to animal experimentation. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. v. 45, n. 4, p. 759-766, 2009. CONRADO, M.C. Uso do mtodo het-cam como modelo alternativo ao teste de irritao da mucosa oral em hamsters na avaliao do potencial txico de dentifrcios. Dissertao (Mestrado) Fundao Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2007. COMISSO TCNICA DE COSMTICOS DO CRQ-IV, Manual de Cosmetovigilncia, So Paulo, 2008. Disponvel em <http://www.crq4.org.br/default.php?p=informativo_mat.php&id=130> Acesso em 09/2010. HAGINO, S.et.al. Interlaboratory Validation of In Vitro Eye Irritation Tests for Cosmetic Ingredients. (2) Chorioallantoic Membrane (CAM) Test. Toxicology in Vitro, v.13, p. 99-113, 1999. ICCVAM Current status of in vitro test methods for identifying ocular corrosives and severe irritants: Hens Egg Test Chorioallantoic Membrane Test Method. U.S., 2006. Disponvel em <http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocudocs/ocu_brd.htm#hetcam> Acesso em 09/2010.

Referncias Bibliogrficas

GRATIERI, T. Sistemas de liberao ocular contendo fluconazol: obteno, caracterizao e liberao passiva e iontofortica in vitro e in vivo. Tese (Doutorado) Faculdade de Cincias Farmacuticas de Ribeiro Preto, Ribeiro Preto, 2010. KISHORE, A.S. et. al. Hen egg chorioallantoic membrane bioassay: an in vitro alternative to Draize eye irritation test for pesticide screening. International Journal of Toxicology, v. 27, p. 449453, 2008. LUEPKE, N.P. Hen's egg chorioallantoic membrane test for irritation potential. Food and Chemical Toxicology, v. 23, n. 2. p. 287-291, 1985. LUEPKE, N.P. et. al. The het-cam test: an alternative to the Draize eye test. Food and Chemical Toxicology, v. 24, n. 6/7, p. 495-496, 1986. McNAMEE, P. et.al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology, v. 54, p.197209, 2009. VINARDELL, M.P. et. al. Comparative study of the het-cam test and the Draize eye test for assessment of irritancy potential. Toxicology in Vitro, v. 8, n. 3, p. 467-470, 1994. http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/ Acesso em 09/2010 www.pages.cthome.net/pageone/revlonad.jpg Acesso em 09/2010 http://www.schrader-institute.de/htm_engl/creachem_tox_ver.htm Acesso em 09/2010.