Microbiologa General

Seminario Nro. 1 Esterilizacin y Bioseguridad

Algunos conceptos bsicos...

Esterilizacin: eliminacin o muerte de microorganismos que contiene un objeto o sustancia. todos los

Bactericida: Agentes que destruyen y matan a las bacterias Bacteriosttico: Agentes que inhiben el crecimiento de las bacterias Desinfectante: agente que elimina la carga microbiana total en superficies inanimadas tales como mesadas de trabajo. Antisptico: agente que controla y reduce la presencia de microorganismos potencialmente patgenos sobre piel y/o mucosas

Esterilizacin

Criterio de muerte para un microorganismo

Perdida irreversible de su capacidad de reproduccin

Cintica de Muerte de un MO
La muerte de microorganismos como consecuencia de un tratamiento a altas temperaturas sigue una cintica exponencial.

N ufc

dN dt

= - KN

tiempo

Cintica de Muerte de un MO

VALOR D : Tiempo de reduccin decimal

Se define el valor D como el tiempo necesario para que el nmero de supervivientes caiga al 10% del valor inicial (o, lo que es lo mismo, para que el logaritmo del nmero de supervivientes se reduzca en una unidad).

El tiempo (D) vara para cada temperatura (de ah el subndice t) de forma que a mayores temperaturas el valor de D es menor, es diferente para distintos microorganismos, distintos entornos y diferentes condiciones fisiolgicas.

VALOR D : Tiempo de reduccin decimal

Efecto de la Temperatura

log n m.o. viables

100 10
70 C

50 C A que temperatura es menor el valor de D? 60 C

tiempo

D es un parmetro de la sensibilidad de un Microorganismo determinado al efecto de la temperatura

log n MO viables

100 10

B C

Cul es el MO ms sensible al tratamiento?

tiempo

VALOR Z
Si aumentamos la temperatura de tratamiento, el valor de D disminuye de forma logartmica. De manera anloga a como el valor D indicaba el tiempo necesario para lograr que el nmero de supervivientes se redujera al 10% de la poblacin inicial, el valor z indica el incremento en la temperatura (medida en nmero de grados) necesario para que el valor D se reduzca a la dcima parte del inicial.

donde T es el incremento de temperatura, y DT1 y DT2 los valores de D a las dos temperaturas estudiadas.

Efecto de la Temperatura sobre caractersticas de los alimentos

Efecto de la carga inicial (No)

8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 Tiempo (min) 60 80

log N sobrevivientes

Esterilizacin en Microbiologa de Alimentos

Desde el punto de vista de la salud alimentaria, se suele requerir un

tratamiento 12D de los productos susceptibles de ser portadores de

grmenes patgenos (o que puedan dar lugar a intoxicaciones). Este tratamiento reduce en 12 rdenes de magnitud el nmero de supervivientes o bien, visto de otra forma, reduce en un factor de 10-12 la probabilidad de supervivencia de un microorganismo dado. Si consideramos que un solo microorganismo contaminaba una unidad (una lata, por ejemplo) del alimento inicial, despus de un tratamiento 12D la probabilidad de encontrar una lata contaminada se reduce hasta 10-12.

Clostridium botulinum
D121 = 0.20 min
3.5 x 10 15 ufc/ lata No = 3.5 x 10 5 ufc/lata Tiempo de tratamiento a 121C = 2 min NF = ?

Log 10 Recuento de viables

6 5 4

Valor D=1 minuto

105 B A
0 1 2 3 4 5 6 7

3
2 1 0

Tiempo (min)

1 2 3 4 5 6

Log 10

Probabilidad de sobrevivientes

Log 10 Recuento de viables

12 10 8

6
4 2 0 1 2 3 4 5 6 7

MO A D=1 min a 121 C

0 2

MO B D=0.5 min a 121 C

Tiempo (min)

4
6 8 10

12

Log 10

Probabilidad de sobrevivientes

Ejercicios
Si se ha determinado que para esporas de Clostridium botulinum suspendidas en buffer fosfato el D121 = 0.204 min, Cunto tiempo llevara reducir una poblacin de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 121C? Para el mismo sistema se sabe que el valor Z= 10C. Cunto tiempo llevara reducir una poblacin de 1012 esporas de C. botulinum en buffer fosfato a 1 espora a 111C? La leche cruda a la entrada de la planta de procesamiento tiene una carga bacteriana de 4x105ufc/ml. La leche se va a procesar a 79C por 21 segundos. Si el valor D promedio para la poblacin bacteriana a 65C es de 21 segundos y el valor Z es de 7C, cuntos microorganismos quedarn luego del tratamiento a 79C?Cunto tiempo se requerira para lograr el mismo grado de letalidad a 65C?Cunto tiempo llevara reducir la concentracin a 1ufc/100ml con un tratamiento a 65C?

Agentes Fsicos
CALOR

RADIACIONES

FILTRACIN

Calor
Calor hmedo
Ambos pueden ser utilizados en procesos de esterilizacin

Calor seco

Calor hmedo
PROCESOS

Esterilizacin: Vapor saturado a presiones mayores que la atmosfrica Tindalizacin (fraccionada por vapor) Pasteurizacin UHT
MECANISMOS DE ACCIN Desnaturalizacin de protenas Destruccin de cidos nucleicos

Pasteurizacin
LHT (low temperature holding) 30 minutos a 62.8C HTST (high temperature short time) 15 segundos a 71.6C Solo destruye patgenos (Coxiella burnetti, Mycobacterium
Louis Pasteur

tuberculosis, etc.) y reduce flora de deterioro.

NO ES UN PROCESO DE ESTERILIZACIN Usos: leche, lcteos, jugos de fruta

UHT (Ultra high temperature)

140C-150C durante pocos segundos
Proceso continuo Necesita envasado asptico Si es un proceso de esterilizacin

Tindalizacin
100 C 30 min, 3 das sucesivos

Proceso discontinuo con perodos de incubacin intercalados

Usos: esterilizacin de productos de baja resistencia

trmica, cuando no existe otra opcin

John Tyndall

Vapor saturado a presiones mayores que la atmosfrica

Condiciones: Vapor saturado a temperaturas mayores de 100C (PRECAUCIN: eliminacin total del aire) Equipo: Autoclave
Alcance: Se puede conseguir esterilizacin

Usos: Esterilizacin de materiales y productos termoestables ( salvo productos oleosos y polvos). Descontaminacin de desechos biolgicos.

Autoclave

Autoclave
Condiciones :

121C durante 15 minutos, con cargas iniciales bajas

121C durante 30 minutos, con cargas iniciales altas

Indicadores:

Fsicos: Temperatura y/o presin

Qumicos Indicador biolgico: Geobacillus stearotermophilus (D 121C=1.5 minutos) Tamao del inculo: 104 esporas

Perfil de temperatura de un proceso de esterilizacin por calor hmedo

Temperatura C

120

110
100

3
Tiempo (min.)

15
Etapa de calentamiento Etapa de Etapa de enfriamiento mantenimiento

Calor Seco
Mecanismo de accin: Procesos de oxidacin Controles de proceso de esterilizacin Indicadores fsicos y qumicos Indicador biolgico esporas de Bacillus subtilis var. niger (D 160C = 0.3 a 1.8 min, Z=20C, tamao del inculo: 105 esporas)

Calor Seco
Aire caliente: Equipo:Hornos elctricos Alcance: Se consigue esterilizacin (170C, 60 minutos o 160C, 120 minutos) Usos:

a) Esterilizacin de:
Materiales resistentes al calor Sustancias no miscibles en agua (inyectables oleosos, siliconas, vaselina lquida) Polvos b) Despirogenizacion (250C 45 minutos o 180C 4hs, o 650 1 min)

 Incineracin:
Destruccin de material contaminado

Flameado :
Desinfeccin

Resistencia a calor
RESISTENCIA Priones Endosporas bacterianas Mycobacteria Virus sin envoltura lipdica Hongos Bacterias Virus con envoltura lipdica

Esterilizacin por filtracin

La esterilizacin por filtracin se logra por el paso de un lquido o un gas a travs de un material capaz de retener los microorganismos presentes. La esterilizacin por filtracin se emplea para materiales sensibles al calor, tales como ciertos medios de cultivo, azcares, soluciones de antibiticos y otros medicamentos, etc.

Filtros de profundidad: Estos filtros estn elaborados por un material fibroso (papel, asbesto o fibra de vidrio) dispuesto al azar, de manera que dentro de la estructura del filtro se crean vas tortuosas donde pueden quedar retenidos la mayora de los contaminantes presentes.

Filtros de superficie: Son filtros elaborados generalmente de acetato de celulosa o nitrato de celulosa y contienen poros de tamao uniforme. Este tipo de filtro tiene como ventaja que, al conocer exactamente el tamao de poro que presentan, se pueden seleccionar filtros capaces de retener la totalidad de los microorganismos presentes en una solucin. Sin embargo, se saturan rpidamente y la velocidad de filtracin a travs de ellos es lenta. La mayor parte de los filtros de membrana se pueden esterilizar en autoclave y luego se manipulan aspticamente al ensamblar el equipo.

FILTRACIN DE AIRE
Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air) Remocin de hasta el 99.97% de partculas mayores de 0.3 micrones de dimetro Se usan en cabinas o habitaciones de flujo laminar CONTROL Retencin Mnima de un 99.97% de partculas generadas mediante ensayo DOP(di-octil-nftalato) en caliente con un dimetro de 0.3 micrones.

SE USAN PARA Lograr ambientes con nmero de partculas controlado: FLUJOS LAMINARES AREAS DE TRABAJO

Cabinas de Flujo Laminar Vertical

Salida de aire

Entrada de aire

Protege la muestra, el operador y el medio ambiente

Esterilizacin por radiaciones

Baja energa

Actividad antimicrobiana

Alta energa

Dos tipos: Radiaciones ionizantes Radiaciones no ionizantes

Radiaciones Ionizantes
Caractersticas: Alta energa, baja longitud de onda Gran poder de penetracin Ionizan tomos y molculas No requieren altas temperaturas Tipos: Rayos gamma (60Co o 137Cs) Rayos catdicos (electrones acelerados) Partculas beta

Mecanismos de accin:
Formacin de radicales libres Dao al ADN, ARN

Resistencia:
Priones

Deinococcus radiodurans Enterococcus faecium

Esporas bacterianas Virus Hongos Bacterias (en gral)

D (kGy) 3 1.2

Bacillus pumilus Staphylococcus spp.

m.o.

Desventajas: Equipo especial, personal entrenado No todos los materiales resisten el tratamiento Reacciones no deseadas en alimentos

Radiaciones no Ionizantes
Caractersticas: Baja energa, sin poder ionizante Sin poder penetrante Mxima eficiencia biocida a 260nm

Mecanismos de accin: Sitio blanco ADN Formacin de dmeros de timina Usos: Desinfeccin de superficies Desinfeccin de aire y agua

NO SE UTILIZAN PARA ESTERILIZAR SINO PARA:

ESTERILIZACIN Luz ultravioleta

POR RADIACION UV

La radiacin ultravioleta producida artificialmente en el espectro de 250 nm ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante por ms de 30 aos.
La accin de los rayos ultravioleta se debe a la produccin de ozono que logra la asepsia, ya que este gas conserva su accin inhibidora hasta una dilucin de 1 x 40.000. Los aminocidos aromticos de las protenas y las bases puricas y primidinicas, en particular la timina del DNA, son los principales compuesto blancos afectados por la accin bactericida de la accin ultravioleta. Evitando la replicacin de las tiras del DNA o causando recombinaciones que terminan en mutaciones mortales.

Dmeros de timina

Procesos de esterilizacin
Agente Calor hmedo Condiciones 121C 15 min. (o equivalente) Usos Material termoestable Penetrable por vapor

Calor seco

160C 2 horas 180C 1 hora

Material termoestable No penetrable por vapor

Radiaciones ionizantes

25KGy 45KGy

Material termosensible Resistente al tratamiento

Filtracin

0.22 micras de poro

Material filtrable

Control de Esterilizacin

Controles del proceso Indicadores: Fsicos Qumicos Biolgicos

Post-proceso: TEST DE ESTERILIDAD !!!

Controles del proceso

Indicador fsico Ej: Temperatura, presin

Indicador qumico

Cambio de color

Indicador biolgico

Microorganismo resistente

Agentes qumicos de esterilizacin y control del crecimiento

Antispticos Alcoholes Iodo rgano-Mercuriales

Colorantes
Desinfectantes y/o Esterilizantes Cloro y Compuestos clorados Aldehdos Oxido de Etileno Compuestos Fenlicos

Alcoholes
Lesionan la membrana celular de los microorganismos y desnaturalizan protenas. Desorganizan la estructura fosfolipdica de la membrana. No destruyen esporas y tienen una accin germicida lenta. Los alcoholes de cadena corta tienen un efecto nocivo mayor que los de cadena larga. Se utilizan en concentraciones del 50 al 70%. Los ms utilizados son el etanol e isoproplico.

Iodo
Es un agente oxidante que modifica grupos funcionales de protenas y cidos nucleicos. Inactiva protenas y enzimas por oxidacin de los grupos -SH a S-S, pudiendo atacar tambin grupos amino, indoles, etc. Se utiliza como desinfectante de la piel (tintura de iodo: yodo molecular 2% y yoduro de sodio 2% en alcohol), aunque es irritante. Es efectivo contra esporas en una concentracin de 1600 ppm de iodo libre

Perxido de Hidrgeno
Es un antisptico dbil, con capacidad oxidante y formadora de radicales libres. Actualmente, el perxido de hidrgeno gaseoso se est utilizando como desinfectante de superficies o decontaminante de gabinetes biolgicos debido a que no posee las propiedades txicas y cancerigenas del xido de etileno y formaldehdo.

rgano-Mercuriales
Estos tipos de compuestos se combinan con los grupos -SH de las protenas, inactivando enzimas. Dentro de los mercuriales orgnicos se encuentran el metafen y el mertiolate.

Colorantes
Los derivados del trifenilmetano (violeta de genciana, verde de malaquita y verde brillante) bloquean la conversin del cido UDP-acetilmurmico en UDPacetilmuramil-pptido.

R = HSO4- Verde Brillante R = Cl- Verde de Malaquita

Violeta de Genciana

Cloro y sus derivados

El cloro, los hipocloritos y las cloraminas son desinfectantes que actan sobre protenas y cidos nucleicos de los microorganismos. Oxidan grupos -SH, y atacan grupos aminos, indoles y al hidroxifenol de la tirosina.

El producto clorado ms utilizado en desinfeccin es el hipoclorito de sodio (agua lavandina), que es activo sobre todas las bacterias, incluyendo esporas, y adems es efectivo en un amplio rango de temperaturas.
La actividad bactericida del hipoclorito de sodio se debe al cido hipocloroso (HClO) y al Cl2 que se forman cuando el hipoclorito es diluido en agua.

El hipoclorito de sodio se comercializa en soluciones concentradas (50-100 g/l de Cloro activo) y Generalmente, se utilizan soluciones con una concentracin del 0.1-0.5% de Cloro activo. Su actividad est influida por la presencia de materia orgnica

Aldehdos
Son agentes alquilantes que actan sobre protenas, lo que provoca modificacin irreversible de enzimas e inhibicin de la actividad enzimtica. Se utilizan como desinfectantes y esterilizantes. Destruyen esporas. El glutaraldehdo es el nico esterilizante efectivo en fro. El formaldehdo como gas se utiliza para descontaminar edificios, ambientes, etc. El formaldehdo gaseoso se obtiene por calentamiento del paraformaldehdo tiene la desventaja de ser muy irritante y perder actividad en ambientes refrigerados.

Glutaraldehido

Paraformaldehido

Formaldehido

Oxido de Etileno
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgenos lbiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos, etc. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria farmacutica. Sirve para esterilizar material termosensibles como el descartable y plstico, equipos electrnicos, bombas cardiorrespiratorias, etc. Es muy peligroso

Compuestos Fenlicos
Son desinfectantes que provocan lesiones en la membrana citoplasmtica porque desordenan la disposicin de las protenas y fosfolpidos. El fenol no es usado a menudo como desinfectante por su olor desagradable, por ser muy irritante y por el resido que queda luego de tratar las superficies.

Los derivados del fenol ms utilizados son el hexaclorofeno (compuesto difenlico) y los cresoles (alquil fenoles). Estos son muy efectivos a bajas concentraciones contra formas vegetativas de bacterias. No son efectivos contra esporas.

Coeficiente del fenol

BIOSEGURIDAD

Bioseguridad
Contencin primaria: proteccin del personal y del medio ambiente inmediato del laboratorio de la exposicin a agentes infecciosos. Contencin secundaria: Proteccin del medio ambiente externo al laboratorio de la exposicin a materiales infecciosos Equipos de Seguridad (Barreras Primarias). Los equipos de seguridad incluyen gabinetes de seguridad biolgica (BSCs), recipientes cerrados, y otros controles de ingeniera destinados a eliminar o minimizar las exposiciones a materiales biolgicos peligrosos.

Diseo y Construccin de Instalaciones (Barreras Secundarias)

Riesgo Biolgico: Es la probabilidad de sufrir cualquier tipo de infeccin, alergia, o toxicidad por una exposicin no controlada a agentes biolgicos.

Bioseguridad

Niveles de Bioseguridad

Bioseguridad

Agentes de Riesgo
Se entiende por agente de riesgo biolgico cualquier microorganismo -incluyendo de los genticamente

modificados- cultivo celular, animal o planta o producto

de estos, capaz de producir cualquier tipo de infeccin, alergia o toxicidad en humanos, animales u otros seres

vivos.

Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo I

Sin riesgo o bajo riesgo individual y comunitario. Agentes bien identificados que se sabe que no producen enfermedad en humanos sanos y existe un potencial mnimo de peligro para el personal del laboratorio y el ambiente.
Bacillus subtillis Naegleria gruberi
virus de la hepatitis canina infecciosa

Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo II

Riesgo individual moderado y bajo riesgo comunitario. Agentes asociados con enfermedades en humanos, especialmente por ingestin o exposicin percutnea o mucosa. Patgenos que pueden producir enfermedad en humanos animales pero es poco probable que sea un problema para los trabajadores del laboratorio, la comunidad, los animales o el ambiente. La exposicin en el laboratorio puede producir una enfermedad seria pero existe tratamiento efectivo y las medidas preventivas estn disponibles, el riesgo de dispersin de la enfermedad es limitado.
Salmonella spp.
Virus de la Hepatitis B Toxoplasma spp.

Bacillus anthracis Bordetella pertussis

Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo III

Alto riesgo individual, bajo riesgo comunitario. Trabajo con animales infectados con agentes exticos que tienen riesgo de transmisin por aerosoles y pueden causar una enfermedad seria o potencialmente letal. Patgenos que usualmente causan serias enfermedades en animales y humanos pero que comnmente no se propagan de un individuo infectado a otro. Las medidas preventivas y de tratamiento efectivo estn disponibles.

Brucella bortus Coxiella burnetii

Mycobacterium

Bioseguridad

Agentes de Riesgo - Grupo IV

Alto riesgo individual y comunitario. Trabajo con agentes peligrosos que tienen alto riesgo de amenazar la vida, transmitirse por va area o que se desconoce su riesgo de transmisin. Patgenos que usualmente causas serian enfermedades en los animales o los humanos y que pueden transmitirse de un individuo de forma directa o indirecta. Usualmente no estn disponibles ni medidas preventivas ni tratamiento efectivo.

Virus de Marburg Ebola Virus Junn

Bioseguridad

Gabinetes de seguridad biolgica Clase I (Campana)

B. Ventana
C. Filtro de Escape HEPA

A. Apertura frontal

D. Pleno de Escape

Bioseguridad

Gabinetes de seguridad biolgica Clase II (Flujo Laminar)

A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de Escape HEPA; E. Pleno de Escape de Presin Negativa; F. Ventilador; G. Filtro HEPA adicional para enviar aire.

A. Apertura Frontal; B. Ventana; C. Filtro de escape HEPA; D. Pleno posterior; E. Filtro HEPA de Suministro; F. Ventilador

Bioseguridad

Gabinetes de seguridad biolgica Clase III (Flujo Laminar)

A. Inserciones para guantes con aros circulares para instalarles guantes del largo del brazo al gabinete;B. Ventana, C. Filtro de Escape HEPA; D. Filtro HEPA de Suministro; E. Caja para Autoclave de Doble Extremo.

Bioseguridad

Transporte de material riesgoso