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Universidad Autnoma de Zacatecas Francisco Garca Salinas Unidad Acadmica de Ciencias Qumicas Qumico Farmacutico Bilogo

LABORATORIO DE GENTICA

*CARIOTIPO HUMANO*
*Mnica Adriana Rodrguez Zavala *Abraham Lpez Arellano *Sara Ziga Estupian *Carlos Alberto Jasso Jasso 7. Semestre Grupo C

OBJETIVOS
Conocer y comprender la importancia de la tcnica de extraccin y cultivo de leucocitos Conocer y comprender la importancia de realizar un cariotipo humano

Laboratorio de Gentica

INTRODUCCIN
Mediados del siglo XIX hasta mediados del siglo XX no se sabia el numero de cromosomas del ser humano

Historia

El problema era que en la placa metafsica los cromosomas estn juntos y es difcil verlos por separado

A mediados del siglo pasado surgi la citogentica; que tiene por objetivo el estudio de los cromosomas y el de sus alteraciones.

Hoy en da sabemos que el nmero de cromosomas es caracterstico de cada especie.

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En 1960 Moorhead describi que los linfocitos se diferenciaban en la sangre perifrica, pero que poda entrar en mitosis en condiciones in vitro. Con este descubrimiento, se realizo el cariotipo a partir de sangre perifrica, lo que tuvo varias ventajas:

Es un tejido fcil de obtener. Permite la obtencin de un gran numero de clulas con lo que se obtienen abundantes metafases.

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Cultivo de leucocitos
El cultivo celular es el proceso mediante el que clulas, ya sean clulas procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. Condiciones adecuadas para mantener un cultivo celular:
Temperatura pH Nutrientes Gases

Las clulas pueden ser purificadas con facilidad de la sangre sin embargo slo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo.

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Ante todo, deben guardarse las mximas condiciones de esterilidad.

Cariotipo
Cariotipo: conjunto ordenado de los cromosomas de un organismo determinado, clasificados por su forma, tamao y estructura de bandas.

Idiograma de un cariotipo
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Usos
Mediante el cariotipo se pueden analizar anomalas numricas y estructurales, cosa que sera muy difcil de observar mediante gentica mendeliana. Esta variacin proporciona la base para una gama de estudios que podra llamarse citologa evolutiva.
Pero usadas en conjunto con otros datos filogenticos, el fisionamiento cariotipico puede ayudar a explicar dramticas diferencias en los nmeros dipliodes entre especies estrechamente relacionadas, que antes fueron inexplicables.
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Clasificacin de los cromosomas


Metacntricos
Submetacntricos

Acrocntricos

Telocntricos

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Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a la G, atendiendo a su longitud relativa y a la posicin del centrmero, que define su morfologa. De esta manera, el cariotipo humano queda formado as:
Grupo A: Pares cromosmicos 1, 2 y 3. Cromosomas muy grandes, 1 y 3 metacntricos; 2 submetacntrico. Grupo B:Pares cromosmicos 4 y 5. Cromosomas grandes y submetacntricos. Grupo C: Pares cromosmicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X. Cromosomas medianos submetacntricos. Grupo D: Pares cromosmicos 13, 14 y 15. satlites. Grupo E: Pares cromosmicos 16, 17 y 18. Cromosomas pequeos, metacntrico el 16 y submetacntricos 17 y 18. Grupo F: Pares cromosmicos 19 y 20. Cromosomas pequeos y metacntricos. Grupo G: Pares cromosmicos 21, 22, Y. Cromosomas pequeos y acrocntricos (21 y 22 con satlites).
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Cromosomas medianos acrocntricos con

A partir de 1970 se comenzaron a realizar una serie de tratamientos y tinciones a los cromosomas para identificarlos mejor, que fueron las tcnicas de bandeo, que las hay de dos tipos:
Encontraremos cromosomas con bandas alternantes (oscuras y claras)

Bandas de todo el cromosoma.

Bandas que tien solo determinados puntos del cromosoma

Bandas C: solo tien la heterocromatina. Bandas NOR: tie los satlites de los cromosomas acrocntricos. Bandas T que marcan los telmeros para ver si falta alguno.

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Bandas que se tien en los cromosomas

Bandas Q, de quinacrina. Con esta tincin se obtienen unas bandas alternantes, mas o menos fluorescentes.

Bandas G, de Giemsa. Se obtiene un patrn de bandas que permite individualizar los cromosomas y reconocerlos.

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Extraccin y cultivo de leucocitos


Materiales Equipo Campana de flujo laminar Incubadora a 37C

1 jeringa de 5ml Frasco estril

REACTIVOS
Medio de cultivo Mc coy
Este medio McCoy fue desarrollado originalmente para la propagacin de linfocitos humanos contiene los componentes esenciales que imitan las condiciones ptimas para la proliferacin de las clulas.

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Fijador de Carnoy El fijador de Carnoy es un fijador que contiene cloroformo. Penetra en tejidos extremadamente rpido y pude fijar piezas de tejido de pequeo tamao en minutos.

Contiene:
Etanol absoluto---------60 ml Acido actico glacial----10 ml Cloroformo-------------30 ml

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Fitohemaglutinina
Las clulas deben encontrarse en divisin. Para ello, se har la incubacin de la muestra en presencia de productos inductores de la mitosis (mitgenos), como es el caso de fitohemaglutinina.
La Fitohemaglutinina (PHA) del Phaseolus vulgaris aglutina hemates y leucocitos; es capaz de unirse a oligosacridos y estimula la mitosis en diferentes estirpes celulares, incluidos los linfocitos.

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Colchicina
Es un frmaco antimittico que detiene o inhibe la divisin celular en metafase o en anafase. Es un compuesto que evita el reparto de las cromtidas de un cromosoma durante la mitosis, provocando la poliploida de la clula filial, ya que aunque no haya separacin, s hay duplicacin del material gentico.
Su efecto se debe a su accin sobre las protenas citoesquelticas del huso mittico interfiriendo en la polimerizacin de los microtbulos del huso mittico.

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Medio hipotnico
Con el objetivo de conseguir una buena separacin cromosmica, las clulas deben someterse a choque osmtico. Para ello, se emplea un medio hipotnico (0,075M KCl), que ocasiona el aumento de volumen de las clulas.

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Tincin
Hay que proceder a la tincin de los cromosomas para que sean identificables.

En el cariotipo clsico se suele utilizar una solucin de Giemsa como tincin (especfica para los grupos fosfato del ADN) para colorear las bandas de los cromosomas (Bandas-G). Cada cromosoma tiene un patrn caracterstico de banda que ayuda a identificarla.
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Incubar 72 hrs. 37C.


Aadir al frasco 10 gotas de sangre + 2.2ml fitohemaglutinina.

Tenerlo listo en una campana de flujo laminar.

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CARIOTIPO HUMANO

Centrifugar 2000 rpm. Decantar.


Pasar cultivo a un tubo cnico.

Aadir 0.25ml colchicina, incubar 1 hr/37C.

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Centrifugar 2000 rpm . 5 min. Y decantar.

Incubar a 37C por 20 min. Aadir 3ml KCL y re suspender.

Aadir 2ml de solucin Carnoy. Re suspender , y completar hasta 8ml, homogenizar.

Aadir 2ml KCL y homogenizar.

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Centrifugar 2000 rpm, 5 min. Y decantar.

Llevar hasta 5ml con Carnoy.

Centrifugar 2000 rpm. 5 min. Y decantar.

Resuspender en 0.5ml de Carnoy.

Adicionar 2ml de Carnoy. Incubar 4C por 24 hrs.


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Dejar secar al aire El goteo expandir y romper las clulas


En un portaobjetos lavado con alcohol dejar caer gotas de la muestra de una altura considerable

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Observar al microscopio

Realizar una tincin de giemsa

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RESULTADOS
La tincin permiti observar los cromosomas en el proceso de divisin celular. Se puede apreciar las diferencias de tamao y formas. Estas diferencias son las que permiten agrupar los cromosomas con caractersticas similares, es decir realizar el cariotipo.

Estos resultados son los que se esperaran observar.


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Discusin
Al realizar la observacin en el microscpio no pudimos visualizar los cromosomas debido a que falt que las clulas se hincharan aun ms, por lo que nuestros resultados no fueron los esperados. Para un mejor resultado tendramos que realizar la tcnica nuevamente poniendo especial cuidado en este paso.
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Conclusin
El cariotipo es una herramienta muy til al momento de analizar anomalas numricas y estructurales. Y con ello ayudar a diagnosticar numerosas enfermedades genticas. En un cariotipo encontramos el conjunto de caractersticas que permiten reconocer la dotacin cromosmica de una clula. Permitiendo identificar y separar especies.
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Referencias
Robert L., Nussbaum; Roderick R. McInnes; Huntington F. Willard (2008). Captulo 5: Principios de citogentica clnica (en castellano). Thompson & Thompson. Gentica en Medicina (7 edicin). Barcelona: Elsevier Masson. pp. 68-75 Revista Cubana de Investigaciones Biomdicas versin impresa ISSN 0864-0300 Rev Cubana Invest Biomd v.24 n.1 Ciudad de la Habana ene.-mar. 2005 Instituto de Nutricin e Higiene de los Alimentos Efecto inmunomodulador de la fitohemaglutinina dePhaseolus vulgaris Dr. Vladimir Ruiz lvarez, Dra. Mara de los ngeles Boffill Crdenas, Dra. Olga Lidia Gonzlez Gonzlez, Dra. Maira Masjuan del Pino y Tc. Freisman Blanco Machado. http://www.euita.upv.es/varios/biologia/tecnicas_de_histologia_vegetal/Documentos/Fijadores_quimicos .htm http://www.laboratoriomicrovet.com/medios/mccoy.html

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