Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
PCR como
herramienta de estudio
alestevez@yahoo.com
Universidad del Valle de Guatemala
Temas a tratar en la presentación
• Resumen de ácidos nucleicos.
• Composicion de ácidos nucleicos.
Un nucleótido está
constituido por tres
subunidades
diferentes: un grupo
fosfato, un azúcar de
cinco carbonos y una
base nitrogenada
Breve resumen de ácidos nucleicos
*Esqueleto de desoxirribosa-
fosfatos
* Cadenas antiparalelas
5’ -3’ / 3’-5’
Ciclo de Krebs
Fotosintesis
Funciones de los ácidos nucleicos: (I) transportadores de energía
SIGNIFICADO ENERGÉTICO
• El DNA es el constituyente
primario de los cromosomas de
las células y es el portador del
mensaje genético, contenido en
unidades o “genes”.
¿Qué es un gen?
• Es una secuencia de nucleótidos en la molécula de ADN, equivalente a
una unidad de transcripción.
PROMOTOR
Secuencia que no se traduce Secuencia que no se traduce
5` 3`
Unidad de transcripción
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÌA MOLECULAR
Hebra molde
Transcripción
Traducción
El código genético es la secuencia de nucleótidos en el ARNm,
cada tres = un codón, significa un aminoácido en la proteína
Tipos de RNA
Los distintos tipos de RNA permiten la expresión del DNA:
• Transcripción
(núcleo)
Iniciación
Elongación
Terminación
• Traducción
(citoplasma)
Iniciación
Elongación
Terminación
Transcripción Traducción
DNA mRNA proteínas
• Transcripción = síntesis de
ARNm.
• Ocurre en el interior del núcleo
(cel eucariotas).
• Necesita:
– Una cadena de ADN que
actúe como molde.
– Enzimas: ARN-polimerasa.
– Ribonucleótidos trifosfato
de A, G, C y U.
Funciones de los ácidos nucleicos: (III) Expresión de la información genética
Proceso de Transcripción:
Traducción
mRNA
rRNA
proteínas
Transcripción Traducción
DNA mRNA proteínas
• La cadena peptídica se sintetiza por la unión de los sucesivos aa que se van
situando en el ribosoma transportados por los correspondientes tARN.
• El ribosoma se desplaza a lo largo de la cadena de mARN.
Ribosoma
Cadena de
amino-
tRNA
ácidos
mRNA
• Desnaturalización
• Hibridación o Annealing
X Ciclos
• Extensión
• Extensión Final
PASO 1: Desnaturalización
(94º-98ºC)
• Denaturalización Inicial
• Desnaturalización
• Hibridación o Annealing X Ciclos
• Extensión
• Extensión Final
• Se suele utilizar de 25 a
40 ciclos, según los reque-
rimientos del protocolo.
Resultado
2N
Parámetro
fundamental: • Los productos pequeños son
sintetizados más rápidamente,
Tm o melting siendo más competitivos
temperature de los
primers
• A pesar de que la hibridación
original no era específica, los
productos acumulados sí tendrán
Visualización del producto de
hibridación perfecta con el oligo y
PCR mediante un gel de
competirán por los reactivos con el
agarosa.
producto no deseado.
Factores determinantes de
especificidad
• Mg+2 es cofactor de
Taq, estabiliza la
interacción entre
hebras de DNA (a
bajas concentraciones,
los dNTPs lo atrapan)
• A altas [Mg+2] menor
astringencia**
• El Tm determina la
temp de hibridación
(5ºC abajo del Tm).
Qué es la Astringencia?
• Los factores que más influyen en el proceso de hibridación (afectan
especificidad) son la temperatura,
temperatura el pH y la concentración de cationes (Mg2+).
• Por el contrario, las soluciones con alta concentración salina o las bajas
temperaturas permiten la formación de híbridos imperfectos (algunos pares de
bases no están correctamente emparejados). Estas condiciones de baja fidelidad
(“low stringency”)
stringency se usan para detectar secuencias relacionadas con la del
primer, aunque no sean perfectamente complementarias (por ejemplo, para
géneros de bacterias o para detectar genes relacionados con algún gen ya
caracterizado).
RESUMEN
Factores a tener en cuenta en una reacción de PCR
• Dos rounds de PCR: 1era amplificación es diluída en una segunda con oligos internos
• Verifica especificidad y diluye inhibidores
• Transferencia de producto abriendo el tubo no es recomendada para uso en
laboratorio clínico CONTAMINACIÓN CON AEROSOLES
• Ej. Diferenciar Entamoeba histolytica de E. dispar, Plasmodium falciparum de P. vivax
Modificaciones al PCR:
PCR en tiempo real
• Ventaja sobre PCRs anteriores es el método de detección del producto de
amplificación: mientras que en el PCR tradicional se debe recurrir a geles de agarosa o
poliacrilamida, en el PCR en tiempo real la máquina va registrando la producción de
producto a medida que se va originando, de aquí su nombre de PCR en “tiempo real”.
• Formatos de detección
SYBR® Green
Sondas marcadas o sondas Taqman®
"Molecular Beacons"
Doble sonda marcada o sondas "LightCycler"
PCR en tiempo real:
Formatos de detección
SYBR® Green
Sondas marcadas o sondas Taqman®
"Molecular Beacons"
Doble sonda marcada o sondas "LightCycler"
SYBR® Green
• Formato más sencillo es el que usa moléculas fluorescentes que se intercalan en el DNA
de cadena doble, siendo la más utilizada SYBR® Green (menos tóxica que el bromuro de
etidio)
Diseño de Oligonucleótidos
(primers)
Actividad Práctica: Diseño de primers
• http://healthcare.partners.org/dnacore/oligotoolform.cfm - Takes
into account degererate bases. Do not use degenerate primers in
SNP detection.
• Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_
Actividad Práctica: Diseño de primers
Mediante el uso de programas: