Introduccin

La clula bacteriana es esencialmente una maquinaria de sntesis capaz de duplicarse a s misma. En un medio apropiado fsica y nutricionalmente, un cultivo de mos se reproducen continuamente como clulas vegetativas, los nutrientes absorbidos y metabolizados permiten crecer al microorganismo.
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Mtodos de recuento de clulas

Los mtodos bsicos que se utilizan para determinar el nmero total de mos son: Conteo de clulas al microscopio

Conteo de clulas viables.

Mtodo del nmero ms probable (MPN)
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Conteo de clulas al microscopio

Se emplea un dispositivo graduado con 25 cuadrados cuyo volumen y rea es conocido. Ej.: Cmara de Petroff-Hausser, cmara de Neubauer, hemocitmetro
Limitaciones: - Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de muestras. -No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bact/ml para que sean observadas al microscopio. -No distinguen clulas vivas de muertas.

Conteo de clulas viables

Una clula viable es definida como aqulla que es capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo. El conteo en placas es el mtodo ms utilizado. Se asume que cada *Siembra en colonia surgi de una Diseminasimple clula, placa por cin en contando el nmero extensin de colonias uno puede placa calcular el nmero de *Vaciado en clulas viables en la placa muestra.
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Seguimiento de la muestra para el recuento en placa

1.- Se mezclan y homogenizan porciones de muestras de los alimentos. 2.- Se diluyen de forma seriada en un diluyente apropiado. 3.- Se incuban a temperatura apropiada. 4.- Se siembran en la superficie o en la masa de un medio de agar. Transcurrido el tiempo de crecimiento se cuentan las colonias viables utilizando un contador Quebec o electrnico.
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Conteo de clulas viables

Calculo de clulas viables

1.- Contar el nmero de colonias de las placas que contengan entre 15 y 150 colonias.

2.-

Multiplicar por el inverso de la dilucin correspondiente. Por ejemplo: Si en la dilucin 1x10-4 se encontraron 50 colonias presentes el resultado ser:
1/1x10-4 = 10, 000 x 50 = 500, 000 UFC /ml gr. 105 UFC/ ml = 5x
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Mtodo del nmero ms probable

La tcnica se basa en la determinacin de presencia o ausencia (pos o neg) en rplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en las muestras. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilstica.
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Ventajas del mtodo

Repetible Sencillo
Es el mtodo ms apropiado para coliformes fecales.

Desventajas del mtodo

Se requiere de mucho material

Falta de exactitud

No se observa morfologa
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Calculo del NMP

Se puede efectuar combinando los resultados positivos y negativos obtenidos en las pruebas de tubos mltiples. La combinacin de tubos mltiples ms frecuentemente utilizada es la de 5 porciones de 10 ml y 5 porciones de tres diferentes diluciones decimales para obtener datos validos. La mayora de las tablas de NMP estn generalmente ligadas a valores de pruebas que comienzan con porciones de muestra de 10 ml.
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Ejemplo

(+) (+) (-) (+) (-)

(-) (+) (-) (+) (-)

(-) (-) (-) (-) (-)

Nos vamos a las tablas de 5 tubos 3 diluciones (10ml, 1ml y 0.1ml)

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Tablas para NMP

5 Tubos con 10 ml 0 0 0 0 5 tubos con 1 ml 0 0 1 2 5 tubos con 0.1 ml 0 1 0 0 ndice del NMP por 100 ml <2 2 2 4

1 1 1 1 1
2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3

0 0 1 1 2
0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 3

0 1 0 1 0
0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0

2 4 4 6 6
5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 17 12

MTODOS FSICOS Y QUMICOS Basados en la actividad metablica de los microorganismos en un sustrato dado, en la determinacin de su respuesta de crecimiento o en la determinacin de alguna fraccin de la clula microbiana. MTODOS FSICOS: *Impedancia. *Microcalorimetria. *Citometra de flujo.
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IMPEDANCIA
En un circuito elctrico, la impedancia es la aparente resistencia al paso de una corriente alterna que se corresponde con la resistencia elctrica real a una corriente continua.

Cuando los mos crecen en medios de cultivo, metabolizan sustratos de escasa conductividad originando productos metablicos de mayor conductividad y, de este modo, reducen la impedancia de los medios.
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PRINCIPIOS BSICOS DE MEDIDA

Directa Se realiza colocando dos electrodos de metal sumergidos en un medio de cultivo inoculado, midiendo entre ellos la impedancia bipolar mientras crecen los microorganismos presentes.

Indirecta
Uso de medios de cultivo con altas concentraciones de sal. Consiste en dos secciones separadas: 1.- Medio de cultivo y muestra 2.- Medicin de impedancia por medio de una solucin alcalina (KOH) que absorbe el CO2 y gases producidos por los 15 mos.

 Cuando se determina la impedancia de los cultivos en caldo, las curvas son reproducibles para especies y cepas, pudindose identificar cultivos mixtos mediante el uso de inhibidores especficos de crecimiento. En deteccin y cuantificacin las ventajas del mtodo, respecto de los mtodos clsicos, como el contaje en placa, son notables. Para muestras muy contaminadas, que son crticas en un medio industrial o clnico, la impedancimetra proporciona aumentos en la velocidad de deteccin de contaminacin de 2 a ms de 30 veces.
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Uso de la impediometra en la microbiologa alimentaria

Se ha utilizado para la deteccin de grupos de bacterias importantes para la industria alimentaria como Listeria, Clostridium y Lactabacilaceas. Sin embargo cuando el grado de contaminacin es muy bajo, los resultados del recuento por impedanciometra no concuerdan plenamente con los del mtodo convencional.
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 Tambin se ha comprobado que cuanto ms grande es el nmero de cepas de especies diferentes utilizadas en una prueba, ms baja es la correlacin entre la numeracin por impedancia y el recuento por mtodos convencionales. sto se debe al resultado de diferentes actividades metablicas de las diversas especies implicadas.

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Microcalorimetra
Es la materia que estudia los cambios de calor insignificantes: La medicin del cambio de la entalpia implicada en los sustratos de crecimiento. Entalpia: cantidad de energa que un sistema puede intercambiar con su entorno. La produccin de calor que se mide esta estrechamente relacionada con las actividades metablicas de las clulas.
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Calormetros
Discontinuos
De flujo

Se adapta un microcalormetro a un recipiente calormetrico que es atravesado por el flujo de calor.

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Microcalormetria
Es considerado como un mtodo rpido. Los resultados varan de acuerdo a los antecedentes del mo: Volumen del inculo Presencia de sustratos fermentadores, entre otros. Es til en alteraciones de alimentos enlatados. Para calcular el nmero de bacterias en la carne picada o molida.
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Citometra de flujo
La Citometra de Flujo es la ciencia que determina los componentes celulares y las caractersticas de cada una de las clulas en suspensin lquida.
Las clulas suspendidas una por una son llevadas a un detector por medio de un conducto de flujo. Aparatos de flujo liquido o flujo laminar determinan la trayectoria y la velocidad de las clulas que atraviesan el detector figurando entre las propiedades que pueden ser detectadas la fluorescencia, la absorbancia y la dispersin de la luz.
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Esquematizacin

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MTODOS QUMICOS
Nucleasa termoestable Lisado de Limulus para investigacin de endotoxinas Sondas de cido nucleico Amplificacin del DNA (Reaccin en cadena de la polimerasa PCR).

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Nucleasa termoestable
Mtodo casi especifico para la determinacin de la concentracin de S. aureus. Esto es posible en razn de la estrecha correlasin existente entre la produccin de coagulasa y de nucleasa termoestable por las cepas de S. aureus .

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Mtodos para determinar la enzima

1.- Por espectrofotometra 2.- Mtodo rpido que incluye DNA en el medio, este es inundado con HCl 4N, despus de haber incubado las muestras por 1 hora a 50 C. 3.- Mezcla de DNA con azul de toluina en una solucin salina. Por medio de pocillos donde es colocada la muestra e incubada 3 horas a 37C, la formacin de un halo color rosa indica la reaccin de la DNAsa con el DNA.

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Ventajas
Debido a su naturaleza termoestable, la enzima persistir aunque las clulas bacterianas sean destruidas por el calor. La rapidez con la que puede ser detectada. (3 horas) Se puede detectar en cultivos no concentrados de la muestra del alimento.
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Lisado de Limulus (LAL)

Las bacterias gram-negativas se caracterizan por producir endotoxinas, que son responsables de algunos sntomas que acompaan a las infecciones producidas por estas bacterias. La prueba de lisado de Limulus emplea una protena lisada obtenida de las clulas de la sangre (amebocitos) del cangrejo de herradura (Limulus polyphemous). Actualmente esta protena es la ms sensible a las endotoxinas.
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 Las endotoxinas son compuestos qumicos complejos que se encuentran exclusivamente en la membrana externa de la pared celular de las bacterias gram negativas . Mtodos del LAL Mtodo de gelificacin o gel-clot", (Cuenta en placa, NMP) Turbidimtricos Cromognicos.
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Industrias alimentarias donde es aplicado

Leche y productos lcteos

Pescado fresco
Carne de pavo cocida
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