OXITOCINA Y BRADIQUININA

Lizaola Jaime Jos David Lpez Flores Rosa Paola Martnez Salazar Mnica Jazmn Ortiz Navarro Tania Lizbeth Sierra Snchez Otniel Isa

Equipo # 7:

La oxitocina es una hormona formada por nueve aminocidos, que participa en la regulacin de diversos procesos fisiolgicos, la mayora de ellos vinculados con la reproduccin, donde se incluyen la funcin ovrica, el parto, la lactacin y el establecimiento de conductas como el instinto materno y otras interacciones sociales importantes para el comportamiento sexual. Su secuencia es cistena - tirosina - isoleucina glutamina - asparagina - cistena - prolina leucina - glicina (CYIQNCPLG). Los residuos de cistena forman un puente disulfuro

La sntesis biolgica se lleva a cabo por clulas nerviosas neurosecretoras magnocelulares en el ncleo supraptico y el ncleo paraventricular del hipotlamo, de donde es transportada por los axones de las neuronas hipotalmicas hasta sus terminaciones en la porcin posterior de la hipfisis (neurohipfisis), donde se almacena y desde donde es segregada al torrente sanguneo.

La bradiquinina es un pptido fisiolgico y farmacolgicamente activo que est formado por nueve aminocidos. La secuencia de aminocidos de la bradiquinina es la siguiente: arg - pro - pro gly - phe - ser- pro - phe - arg. Su frmula emprica es por consiguiente C50H73N15O11.

La actividad del sistema calicrenacinina produce bradiquinina por desdoblamiento proteolticode su precursor ciningeno, ciningeno de elevado peso molecular (CEPM), empleando la enzima de la cininogenasa.

SINTESIS EN EL LABORATORIO A nivel laboratorio, podemos sintetizar ambos pptidos por el mtodo clsico (en solucin) de dos formas: 1.- Elongacin gradual (figura 28a)

2.-Condensacin fragmentada (figura 28b)

La sntesis en solucion an es utilizada para la produccin a gran escala en la mayora de las aplicaciones industriales. Se lleva a cabo en distintos solventes orgnicos, pero para prevenir formacin de oxazolonas se recomienda el uso de acetato de etilo, tetrahidrofurano, t-butanol, y acetonitrilo.

El primer factor a considerar, es que un pptido puede sintetizarse a partir del amino terminal o del carboxilo terminal, pero como ya se mencion en el apartado anterior, es preferible hacerlo a partir del carboxilo terminal para reducir el riesgo de racemizacin. Para comprender mejor las estrategias de elongacin, supongamos que tenemos un tetrapptido a sintetizar ABCD, si se sigue la elongacin gradual, se pondran a reaccionar el aminocido D con el C, se purifica el producto, posteriormente se le agregara el aminocido B, ahora purificaramos BCD para finalmente adicionar el aminocido A.

En la condensacin fragmentada se sintetizaran el dipptido AB y el CD por separado, y los productos purificados se haran reaccionar para de esta manera tener el producto esperado. Si suponemos un rendimiento del 80% en cada etapa de purificacin, al final de la sntesis por elongacin gradual tendramos un rendimiento del 51.2%, mientras que por el mtodo de condensacin fragmentada el rendimiento total sera del 64%.

Por ejemplo, en la sintesis de oxitoxina realizada por Du Vigneaud la estrategia que siguieron fue elongacin gradual a partir del carboxilo terminal, cuyo grupo protector permanente era un etil ster, otros grupos permanentes utilizados fueron bencil ter para la tirosina y bencil ster para las cistenas. El grupo temporal del amino utilizado fue el benciloxicarbonil, el cual fue removido por HBr/AcOH

Pero dado que ambos son nona-pptidos, resulta tedioso el mtodo anterior, el cual se ha suplido casi en su totalidad por la sntesis de pptidos en fase slida, de la cual existen 2 tcnicas: 1. De Merriefield. 2. De Sheppard

Aunque las reacciones se llevan a cabo en solventes orgnicos, como en el mtodo clsico, el nombre de sntesis de pptidos en fase slida, fue dado por el hecho de que el pptido va creciendo anclado a un soporte

La tcnica de Merrifield.

Cuando Bruce Merrifield incursion en el rea de sntesis de pptidos se dio cuenta de lo extenuante y largo que significaba obtener el producto deseado, por lo que imagin que el procesopoda simplificarse. Su idea bsicamente consista en ensamblar en un soporte slido insoluble el residuo C-terminal del pptido a sintetizar, con lo cual la cadena de aminocidos ira creciendo anclada al soporte slido mediante una estrategia de elongacin gradual. Finalmente, el producto deseado es desprendido del soporte, y su purificacin y caracterizacin se llevan a cabo en solucin. Lo anterior permite que haya una rpida filtracin y lavados para deshacerse de reactivos y productos secundarios despus de cada etapa de la sntesis, en consecuencia, no habr que purificar cada pptido intermediario, lo que se traducir en una reduccin de tiempo y un aumento en la produccin.

Una de las caractersticas particulares de la tcnica de Merrifield es el uso t-butoxicarbonil como grupo protector temporal del amino, y como permanentes grupos bencil ster (o los relacionados a ste). El soporte slido comnmente utilizado en la tcnica de Merrifield es una resina de poliestireno clorometilada entrecruzada por la incorporacin con una pequea cantidad de divinilbenceno. El primer aminocido es adherido a la resina a travs de la sustitucin del cloro por ayuda de una amina terciaria del Boc-aminocido, generando el equivalente de un bencil ster. La desproteccin es llevada a cabo con una solucin de cido trifluoroactico en diclorometano, le sigue una neutralizacin para que el siguiente residuo pueda ser acoplado por medio de DCC. Las etapas de desproteccin, neutralizacin y acoplamiento son repetidas con los Boc-aminocidos apropiados hasta que la secuencia ha sido completada. Al final de cada etapa el conjugado insoluble polmero-pptido es lavado exhaustivamente para remover el exceso de reactivos y coproductos. Finalmente, tratamiento con cidos fuertes, usualmente HF, remueve todos los grupos protectores permanentes de las cadenas laterales y el producto formado es

La tcnica de Sheppard. El modelo propuesto por Merrifield no fue del agrado de muchos qumicos de la poca, les preocupaba sobretodo la debilidad que presentaba y que no pudieran revisar el producto en cada etapa sino tener que esperar hasta el final. La propuesta de Sheppard era la introduccin de soportes de poliamida en sustitucin del poliestireno. Otra caracterstica importante de esta tcnica, debido a la factibilidad de cambiar del solvente, es el uso de Fmoc-aminocidos en lugar de los Boc utilizados por Merrifield, de ah que a la tcnica de Sheppard tambin se le conozca como sntesis Fmoc-poliamida

En esta tcnica se usa preferentemente dimetilformamida como solvente, dado que provee condiciones ms adecuadas para llevar a cabo la reaccin de acoplamiento. A partir de ah, surgi la idea del cambio de resina, dado que para que el pptido formado fuera completamente solvatado necesitaba de un acarreador que fuera de naturaleza polar, y aunque la poliacrilamida comercial pareca no ser la adecuada para este propsito, s lo fue un derivado de sta, un soporte de polidimetilacrilamida. Un brazo espaciador separa a el primer aminocido de la resina, e incrustado en ste se encuentra un aminocido de referencia, usualmente Norleucina.

La desproteccin de Boc-aminocidos en la tcnica de Merrifield conlleva a una exposicin prolongada al cido, ya que no hay una purificacin intermedia, y estas son precisamente las condiciones vigorosas que se mencionaban anteriormente. Por esta razn, se dio la sustitucin de los Boc-aminocidos por los Fmoc-aminocidos en la tcnica de Sheppard, como grupos protectores permanentes se utilizan los grupos t-butil. Para comprobar que la etapa de acoplamiento se ha llevado a cabo tambin se usa la prueba de Kaiser, adems que puede aprovecharse el hecho de que el grupo protector Fmoc es un cromforo, el flujo que pasa por la resina puede hacerse pasar a travs de un detector de rayos u.v.

Instrumentacin. La sntesis de pptidos en fase slida puede llevarse a cabo manualmente o de forma automtica mediante el uso de equipos comerciales. El sistema ms simple y menos costoso se trata de un contenedor cilndrico en donde se encuentra la resina, todos los reactivos son adicionados manualmente y drenados de la resina mediante vaco. Otro sistema consiste de un contenedor de la resina conectado a dos vlvulas, la vlvula A llena el contenedor de la resina con el liquido correspondiente que es elegido mediante la vlvula B y entra al contenedor mediante presin controlada por nitrgeno, o por vaco. Dado la simplicidad del sistema, la vlvula B slo elige entre solvente para la reaccin de acoplamiento, y el reactivo para la desproteccin temporal de los aminocidos. Cada etapa de la sntesis es llevada a cabo con agitacin, una vez terminada la reaccin se vaca el contenedor de la resina con la vlvula A.

La automatizacin de los sintetizadores de pptidos ha ido evolucionando hasta tener los modernos aparatos con los que se cuenta ahora. En un inicio eran semiautomticos, ya que a pesar de ser de flujo continuo, requeran que los aminocidos fueran introducidos en cada ronda. Los sintetizadores actuales son completamente automticos, son sistemas complejos de vlvulas que seleccionan el flujo que ser bombeado hacia la resina dependiendo de la reaccin que deba ser llevada a cabo (figura 37a), controlados y monitoreados por una computadora externa. La computadora est provista de un software que le permite controlar las velocidades de flujo, la cantidad de aminocidos, los tiempos de desproteccin y acoplamiento de los mismos, los lavados y si alguna de las etapas de la sntesis debe ser repetida. Algunos tambin cuentan con un espectofotmetro el cual monitorea la concentracin de los reactivos en la corriente de salida. Las botellas con los reactivos son presurizadas con nitrgeno slo para una purga inicial de los reactivos para que stos no tapen la bomba.