INSTITUTO DE AGRONOMIA CURSO DE PS-GRADUAO EM AGRONOMIA/CINCIA DO SOLO Cassia Cassia Pereira Coelho Pereira Coelho ntroduao ntroduao W Lm eucarlonLes esLruLura da cromaLlna e expresso gnlca so regulados por etilaao de DNA odificaao de histonas siRNAs ntroduao ntroduao W ,eLllao do unA 7roteao do genoma das 7lantas ru7o metil na 7osiao S do anel de 7irimidina citosina I|gura 1 ulagrama esquemLlco de meLllao Lm geral hlpomeLllao de pares CC (em vermelho) nas regles regulaLrlas mosLrada em clrculos aberLos correlaclona com aLlvao Lranscrlclonal enquanLo meLllao desses pares CC represenLado pelos clrculos fechados correlaclona com supresso de genes A flecha quebrada lndlca o slLlo de lnlclo de Lranscrlo (Ll eL al 2009) ntroduao ntroduao W Acetilaao W etilaao W Ubiquitinaao W ADPribolisaao W Fosforilaao ,odlflcao de hlsLonas ,odlflcao de hlsLonas em residuos de lisina Acetilaao e metilaao: Westabelecida 7or: HAT e HKTs WRemovidas 7or: HDACs e HD& ntroduao I|gura ,eLllao de unA e Lranscrlo gnlca alnel superlor hlsLonas aceLlladas rodeadas por formas no meLlladas de unA alnel lnferlor slLlos de llgao meLll CC como o ,eC2 e ,u2 podem se llgar ao unA meLllado recruLando hlsLonas deaceLlladas (PuACs) e hlsLonas meLllLransferase (P,@s) e formar componenLes supressores de Lranscrlo C complexo leva a um malor rlgor a esLruLura da cromaLlna e lnLerfere com o vlnculo de alguns faLores de Lranscrlo porLanLo lnlblndo a Lranscrlo do gene (Ll eL al 2009) (Ll eL al 2009) sl8nAs W "s siRNAs derivados de 7recursores de longa dsRNA W Atual no silenciamento de genes ntroduao ntroduao W |genoma descrlo de reguladores eplgeneLlcos aos logo do genoma W @ecnologlas de sequenclamenLo de alLo rendlmenLo revelam regulao eplgenmlca W Anllse de LranscrlpLoma perfll eplgeneLlco LsLraLeglas para anllse de LsLraLeglas para anllse de eplgenoma eplgenoma em em planLas planLas W Tecnologias genmicas utilizadas no 7erfil e7igenmico enomic tiling microarray variaao do microarranjo tradicional Alta densidade de sondas de oligonucleotideos &equenciamento de alto rendimento 3 7lataformas mais utilizadas: W &equenciamento genmico FLX a 7artir de 4S4 life science/Roche a77lied science W lumina/ solexa genome analyzer W &"LiD &ystem/ a77lied biosystems 8oche 434 lLx W @ecnologla baseada em plrosequenclamenLo W Slnal de sequenclamenLo lnclado pela llberao de fosfaLo duranLe reaes da unA pollmerase lumina/ solexa genome analyzer W @ecnologla de slnLese de sequenclamenLo de unA de 4 cores W SuporLa sequenclamenLo paralelo masslvo W AlLa acuracea de sequanclamenLo mesmo para sequenclas repeLlLlvas Usada em: W&equenciamento WDescoberta de 7olimorfismo WPerfil de smRNAs Wa7eamento de metilaao de DNA e modifiaao de histonas @he |ed 8|osystems SCL|D` W Dsa unA llgase em vez de pollmerase para lnlclar sequenclamenLo por slnLese W Codlflcao de duas bases alLa acuracea W 8endlmenLo e cusLos slmllares ao lllumlna erfll de ,eLllao do genoma lnLelro W Combinaao de detecao de metilaao de DNA com microarranjo de DNA ou tecnologias de sequenciamento de alto rendimento W 3 7rinci7ais abordagens sao utilizadas 7ara detectar metilaao de DNA Digestao de endonucleases Purificaao 7or afinidade Conversao de bisulfito &equencing library construction Highthrough7ut sequencing Endonucleases de restriao WcrBC clivam sequencias metiladas WCombinaao de digestao 7or crBC com microarray tiling ou sequenciamento de alto rendimento etilaao do DNA etilaao de DNA &equencing library construction Highthrough7ut sequencing Purificaao 7or afinidade WDNA metilado 7ode ser enriquecido usando 7roteinas de dominio de ligaao metil ou anticor7os es7ecificos WBDchi7 - detecta a7enas metilaao C WmCPchi7 WmCPseq - combinaao com llumina etilaao de DNA &equencing library construction Highthrough7ut sequencing Conversao de bisulfito WTratamento do DNA genmico com bisulfito converte citosinas a uracilas WCitosinas metiladas nao sofrem conversao WQuantificaao da extensao da metilaao do DNA combinaao de tratamento com bisulfito e microarray tiling - B& seq WProblema da tcnica: Conversao incom7leta da citosina S S seq seq ee a a mals mals ampla ampla ee provelLosa provelLosa Lecnologla Lecnologla para para anllse anllse de de de de meLllao meLllao de de unA unA Perfil de modificaao de histonas no genoma com7leto em 7lantas W Tecnologia de imuno7reci7taao de 7roteinas (ChP) etilaao de histonas &equencing library construction Highthrough7ut sequencing lragmenLao da cromaLlna 2 lmunopreclpLao por anLlcorpos 3 Llberao dos fragmenLos de unA 4 unA Chl e purlflcado e verlflcado por qLC8 3 SequenclamenLo ex mlcroarray Llllng Chlchlp ou Chl seq Perfil do genoma com7leto de smRNAs em 7lantas W &equenciamento massivo de assinatura 7aralela (P&&) - 7rimeira tcnica W Atualmente: sequenciamento 4S4 e llumina W 2 7rocedimentos 7ara sequenciamento de smRNA de genoma com7leto: Purificaao de smRNA Ligaao de ada7tadores &equencing library construction Highthrough7ut sequencing WRNA carregado em gel WsmRNA sao 7urificados e 7osteriormente ligados a ada7tadores WProdutos ligados sao 7urificados em gel e transcritos reversamente WcDNA am7lificado 7or PCR e sequenciado Caracterizaao do e7igenoma em 7lantas W Cenario de metilaao de DNA em 7lantas W " 7rimeiro ma7a de resoluao com7leto de DNA foi feito utilizando o mtodo mCPchi7 W Perfil de metiloma de DNA: metilaao C, CH e CHH - enriquecida em trans7osons e sequencias re7etitivas etilaao C - em genes nao TE W etilaao em sequncias re7etitivas geram siRNAs associados a re7etiao W Ha uma tendncia de correlaao negativa entre niveis de ex7ressao gnica e metilaao do DNA W Cenario de modificaao de histonas em 7lantas Caracterizaao do e7igenoma em 7lantas etilaao de lisina: ativaao ou res7ressao de genes Acetilaao: ativaao da ex7ressao gnica W Cenario de smRNAs em 7lantas Caracterizaao do e7igenoma em 7lantas Padrao combinatrio de e7igenoma em 7lantas W Perfil de alta resoluao do e7igenoma: W uitos gru7os de siRNAs sao bem metilados W Regioes de metilaao de DNA nao sao necessariamente associadas a siRNAs W Nao ha correlaao 7ositiva entre a intensidade de metilaao de DNA e abundancia relativa de smRNA W A metilaao de DNA negativamente corelacionada com muitas modificaoes de histonas, exceto H3K3me2 W lormao da semenLe Dma celula espermLlca ferLlllza celula ovo hapllde A segunda celula espermLlca ferLlllza a celula cenLral dlpllde endosperma Lrlpllde W uuranLe gameLognese e de exLrema lmporLancla que Lransposons permaneam lnaLlvos LsLabllldade do genoma Acuracea da lnformao geneLlca Re7rogramaao e7igenmica durante gametognese e desenvolvimento de sementes em 7lantas Analises e7igenticas do genoma inteiro: su7orte e7igentico 7ara manter estabilidade do genoma Wenes TE sao demetilados e siRNAs sao 7roduzidos em cel. vegetativas WsiRNAs trans7ortados 7ara clulas es7ermaticas WsiRNAs garatem a res7ressao de trans7ososn durante gametognese WDemetilaao de genes TE formando siRNAs no endos7erma W&iRNAs sao trans7ortados 7ara o embriao Wenes TE silenciados no embriao Analises e7igenticas do genoma inteiro: su7orte e7igentico 7ara manter estabilidade do genoma Proteao do genoma de clulas es7ermaticas 7elo sacrificio da integridade do genomas de clulas vegetativas su7orte Iarlao eplgenmlca naLural em planLas W Com7lexa relaao entre variedade gentica e e7igentica W Dificil identificar im7ortancia da variaao e7igentica na diversidade fenoti7ica W 3 classes de variaao e7igentica refletem diferente de7endncia da variaao gentica "brigatria - somente um resultado da variaao gentica Pura - totalmente inde7endente da variaao gentica Facilitada - variaao gentica e e7igentica agem juntas na determinaao da diversidade fenoti7ica Conservao e dlversldade do meLlloma de unA em planLas W 8ecenLemenLe o padro de meLllao do unA enLre especles fol anallsado por Sseq W ,eLllao CC e preferenclalmenLe enconLrada em exons W adres de meLllao no CC parecem ser mals dlversos ex CPP em Lodo o genoma de arroz e em reglo perlocenLromerlcas de dlcoLlledoneas W P dlferenas de meLllao duranLe a evoluo das especles rlnclpals lnformaes W Perfil e7igenmico de alto rendimento tem revelado redes e7igenticas diversas e sua com7lexa interaao com o transcri7toma de mRNA dita o fenti7o em 7lantas W udanas e7igenmicas em res7osta a estimulos contribuem 7ara a diferenciaao de clulas e tecidos e estabilidade da linha de germinaao W variaao e7igenmica natural ocorre durante a evoluao das es7cies e atua em combinaao com variaao gentica 7ara determinar diversidade fenoti7ica