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UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte CB Centro de biocincias Departamento de biologia celular e gentica Docente: Carlos Alfredo

do Galindo Blaha

Discentes: Fernanda Carvalho Cagni Marina Sampaio de Menezes Cruz

Introduo
O Ttano uma das doenas mais dramticas e prevalentes no mundo; A manifestao da doena, paralisia espstica, causada pela segunda substncia mais venosa conhecida, a toxina tetnica; Clostridium tetani Bactria anaerbica formadora de esporos, cujo habitat inclui solo e poeira; A toxina tetnica bloqueia a liberao de neurotransmissores da membrana pr-sinptica de neurnios inibitrios da medula espinhal e do tronco enceflico de mamferos;

Introduo
At ento, informaes genticas de C. tetani restrito a seqncia nucleotdica da toxina tetnica (TeTx) e do seu ativador transcripcional (TetR); A identificao e anlise de todos os genes no genoma ir contribuir para nosso entendimento de como uma bactria inofensiva de solo muda para um organismo potencialmente devastador do sistema nervoso aps entrar em contato e interagir com um hospedeiro e desvendar o sistema regulatrio que interfere na formao da toxina.

Mtodos
Seqenciamento:
O genoma do C. tetani E88 foi seqenciado utilizando o programa Mega-BACE 1000 e ABI prism 377 e editado pelo GAP4;

ORFs:
A previso inicial das ORFs foi feita pelo programa GLIMMER (www.tigr.org/software/glimmer/); O resultado foi verificado e melhorado manualmente usando como critrio presena de stios de ligao de ribossomos e cdon de anlise de uso; Foi realizada a verificao e o refinamento pela pesquisa de sequencias no GenBank/ banco de dados do Laboratrio Europeu de Biologia Molecular utilizando o BLAST.

Mtodos
Comparao genmica:
Para anlises comparativas, cada ORF de C. tetani foi comparada com todas as ORFs de C. perfringens e C. acetobutylicum utilizando o BLAST; Foi considerada homologia significativa quando houve >30% de identidade de aminocido do C. perfringens e >60% do C. acetobutylicum.

Resultados e Discusso
Caractersticas gerais do genoma:
O cromossomo de C. tetani contm 2,799,250 bp contendo G+C de 28,6%. O plasmdeo pE88 com 74,082 bp exibe um contedo pequeno de G+C de 24,5%; Isso indica que no houveram recentes aquisies de transferncias laterais de genes e que o genoma mais estvel que os genomas de enteropatgenos; 82% das ORFs no cromossomo so transcritas na mesma direo que o DNA replicado, no C. perfringens 83%. Isso no observado em patgenos como Vibrio cholerae ou Yersinia pestis.

Resultados

Resultados e Discusso
Codificao da Toxina Tetnica no plasmdeo pE88
A origem do pE88 ainda no foi esclarecida, sendo 50% das OFRs encontradas pertencentes unicamente ao C. tetani Foram identificadas 61 ORFs das quais 28 apresentavam similaridade com protenas de funo conhecida. O plasmdeo pE88 carrega os genes da toxina tetnica (TeTx) e seu transcrito regulatrio direto (TetR) Alm dos genes da TeTx e TetR, o pE88 tambm carrega genes para fatores de virulncia extras como a colagenase (ColT) afeta a integridade do tecido do hospedeiro infectado ColT mostrou maior similaridade com ColB 79% de semelhana de aminocidos no segmento 1 Ausncia do segmento 2

Resultados e Discusso
pE88 codifica tambm vrias outras protenas transmembranas e de transporte; 7 protenas reguladoras da formao da TeTx
Um sistema de dois componentes (CTP21/CTP22) mostrando similaridade com sistemas de outras Gram+ como Bacillus cereus e C. botulinum Apresentam tambm similaridade entre outras espcies de Clostridium:

TetR e fatores alternativos de regulao para a sntese de ToxA e ToxB de C. dfficile UviA do C. perfringens suposto regulados positivo do gene da bacteriocina UVinduzida

Resultados e Discusso
Fatores de virulncia no cromossomo
Foram encontradas OFRs para tetanolisina O, hemolisina e protenas de ligao fibronectina similares a outras espcies de Clostridium SLPs: protenas de membrana presentes em C. tetani

19 homlogos da Cwp66, uma adesina de C. difficile, que est relacionada a domnios de ligao celular 11 ORFs relacionadas ao SLPs, sem homlogos em outras espcies de Clostridium, mas contm domnios de algumas protenas de superfcie como domnios semelhantes a Ig presentes em algumas bactrias H indcios de que essas protenas so exportadas

Resultados e Discusso
Secreo de protenas
No se sabe como a toxina tetnica (peptdeo sinal N-terminal) liberada 419 protenas de C. tetani apresentam o peptdeo sinal e so reconhecidas pelo Sec mecanismo secretrio dependente caracterstico de procariotos sendo ele o principal aparato de translocao proteica
Protenas de funo desconhecida, fatores de virulcia, protenas de superfcie, peptidases, protenas de esporulao, protenas sensoriais (quimiotaxinas)

Nem todos os genes do sistema Sec esto presentes no C. tetani


SecA, SecD, SecE, SecF, SecY Ausncia de SecB (chaperona) e SecG (complexo de protenas de membrana) indicando modificao no sistema Sec.

SRP Partcula de Reconhecimento de Sinal: translocao de protenas e sua insero na membrana (receptor que reconhece e insere a protena)

Resultados e Discusso
Comparao genmica:
199 ORFs so comuns para C. tetani e C. perfringens; 516 ORFs C.tetani no possuem nenhuma similaridade 27 peptidases, muitas delas sendo zinco-metaloproteases; 7 ORFs para degradao lipdica; 15 ORFs para utilizao da etanolamina, semelhante a Salmonella; 21 ORFs para decomposio de aminocidos, apesar de possuir poucos genes para utilizao de acares, que so abundantes no C. acetobutylicum e C. perfringens.

Resultados e Discusso
H a presena marcante de 35 genes para sistemas dependentes do on sdio. Isso explicado pelo importante papel do sdio na fermentao de aminocidos.

Concluso
Pode ser concludo que C. tetani um patgeno invasivo com um amplo arsenal de fatores de virulncia. Esse arsenal ampliado pela habilidade de produo da toxina tetnica e, possivelmente, pela presena de vrios SLPs (protenas de membrana); A sequenciao do genoma nos fornece informaes sobre os sistemas regulatrios para que a traduo de sinal para a expresso da toxina tetnica seja estudada.