ENZIMAS

Desde finales del siglo XVIII y principios del siglo XIX, se conoca la digestin de la carne por las secreciones del estmago y la conversin del almidn en azcar por los extractos de plantas y la saliva.

En el siglo XIX Louis Pasteur estudiando la fermentacin del azcar en el alcohol por las levaduras, lleg a la conclusin de que dicha fermentacin era catalizada por una fuerza vital contenida en las clulas de la levadura.

Inicialmente las llamo fermentos y pens que solo funcionaban con organismos vivos (Fermentos organizados). Escribi que "la fermentacin del alcohol es un acto relacionado con la vida y la organizacin de las clulas de las levaduras, y no con la muerte y la putrefaccin de las clulas".

En 1878 el fisilogo Wilhelm Khne (18371900) acu el trmino enzima, derivada del griego "en levadura", para describir el proceso de fermentacin.

En 1897 Eduard Buchner encontr que el azcar era fermentado inclusive cuando no haba elementos vivos en los cultivos de clulas de levaduras (Fermentos desorganizados). Llam a la enzima que causa la fermentacin de la sacarosa, zimasa. En 1907 recibi el Premio Nobel de Qumica..

A cada enzima se le asignan dos nombres. El primero es corto y es como se conoce a la protena de manera coloquial, es el nombre sugerido. El segundo es ms completo e infiere propiedades sobre la reaccin que la enzima desarrolla, se le conoce como nombre sistemtico, este nombre permite reconocer a la enzima sin ambigedad y localizarla en el metabolismo.

Nombre sugerido
Nombre sistemtico

 Muchas de las enzimas poseen en su nombre el sufijo -asa unido al nombre del substrato de la reaccin que cataliza, por ejemplo: Ureasa: protena cuyo sustrato es la urea Lactasa: protena cuyo sustrato es la lactosa Tambin suele utilizarse este sufijo a la descripcin de la reaccin que la enzima cataliza: Lactato deshidrogenasa: deshidrogena (le quita Hidrgenos) al lactato Adenilato ciclasa: hace un ciclo en la adenina.

Algunas enzimas poseen nombres que no representan su actividad o sustrato:

Lisozima Tripsina

CLASIFICACIN Existe una clasificacin normalizada con 6 categoras principales dependiendo de la reaccin que catalice la enzima. Cada enzima est clasificada mediante su nmero EC. Nombre sistemtico.

1. Oxirreductasas 2. Transferasas 3. Hidrolasas 4. Isomerasas 5. Liasas

6. Ligasas

Transferasas
Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas molculas) a otras sustancias receptoras. Suelen actuar en procesos de interconversin de monosacridos, aminoacidos, etc. Ejemplos: transaminasas, quinasas.

Oxirreductasas
Catalizan reacciones de oxidorreduccin o redox. Precisan la colaboracin de las coenzimas de oxidorreduccin (NAD+, NADP+, FAD) que aceptan o ceden los electrones correspondientes; tras la accin cataltica, estas coenzimas quedan modificadas en su grado de oxidacin, por lo que deben ser transformadas antes de volver a efectuar la reaccin cataltica. Ejemplos: deshidrogenasas, peroxidasas.

Hidrolasas
Verifican reacciones de hidrolisis con la consiguiente obtencin de monomeros a partir de polimeros.
Actan en la digestin de los alimentos, previamente a otras fases de su degradacin. La palabra hidrlisis se deriva de hidro 'agua' y lisis 'disolucin'. Ejemplos: glucosidasas, lipasas, esterasas.

Liasas
Catalizan reacciones en las que se eliminan grupos (H2O, CO2 y NH3) para formar un doble enlace o aadirse a un doble enlace, capaces de catalizar la reduccin en un sustrato.

Ejemplos: descarboxilasas, liasas.

Isomerasas
Actan sobre determinadas molculas obteniendo de ellas sus ismeros de funcin o de posicin, es decir, catalizan la racemizacion y cambios de posicin de un grupo en determinada molcula obteniendo formas isomricas . Suelen actuar en procesos de interconversin.

Ejemplo: epimerasas (mutasa).

Ligasas
Realizan la degradacin o sntesis de los enlaces denominados "fuertes" mediante al acoplamiento a sustancias de alto valor energtico (como el ATP).

Ejemplos: sintetasas, carboxilasas.

COMPONENTES

La unin de la glucosa induce un cambio conformacional en la enzima hexocinasa (cataliza la fosforilacin de la glucosa).

La enzima 1) une al sustrato, 2) reduce la energa del estado de transicin, y 3) impulsa al paso cataltico.

REACCIONES ENZIMATICAS
En estas reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en diferentes molculas, los productos.

Enzima + Sustrato

Complejo Enzima Sustrato

Enzima + Productos

Al igual que los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin (G) de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reaccin.

La energa libre (Go) de los productos es inferior a la de los reactantes

DGo = SP - SS = 0 = Equilibrio <0 = Espontaneidad >0= No espontaneo

Qu hace un catalizador? Un catalizador reduce la barrera de energa para una reaccin, con la que aumenta el nmero de molculas que tienen la energa suficiente para alcanzar el estado de transicin y hacer que la reaccin vaya ms rpido en ambas direcciones.

El catalizador maneras:

reduce el estado de energa

de dos

1.-Por unin al sustrato en una conformacin intermediaria que se asemeja al estado de transicin pero que tiene una energa inferior.

2.-El catalizador hace que las molculas reactantes se unan en la orientacin adecuada aumentando la reactividad. Una parte de la energa de activacin se utiliza para que los sustratos roten y se enfrenten con los tomos correctos para formar los enlaces.

Las enzimas catalizan alrededor de 4.000 reacciones bioqumicas distintas.

NOTA: No todos los catalizadores bioqumicos son protenas, pues algunas molculas de RNA son capaces de catalizar reacciones (como el fragmento 16S de los ribosomas en el que reside la actividad peptidiltransferasa).

Al igual que las dems protenas, las enzimas se componen de una cadena lineal de aminocidos que se pliegan durante el proceso de traduccin para dar lugar a una estructura terciaria tridimensional de la enzima, susceptible de presentar actividad.

Concepto importante ya que en el Capitulo 4 hablaremos de estabilidad enzimtica

Estructuras y mecanismos
Las enzimas son generalmente protenas globulares que pueden presentar tamaos muy variables, desde 62 aminocidos como la 4-oxolocronato tautomerasa, hasta los 2.500 presentes en la sintasa de cidos grasos.

Solo una pequea parte de la enzima (alrededor de 3 a 4 aminocidos) estn directamente involucrados en la catlisis. La regin que contiene estos residuos encargados de catalizar la reaccin es conocida como centro activo.

MECANISMOS DE REACCIN ENZIMTICA

S+E

ES

E+P

1.- CATLISIS CIDO-BASE 2.- CATLISIS COVALENTE 3.- CATLISIS POR IONES METLICOS

1.- CATLISIS CIDO-BASE: Triosa fosfato isomerasa Se produce un intercambio de protones

Dmero: dos subunidades idnticas Cilindro b paralelo con hlices a en los bucles de interconvexin Lugar activo: cerca de la parte superior del cilindro. Puede acomodar G3P o DHAP
Bioqumica Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002

Catlisis cido-base: triosa fosfato isomerasa

G3P se une al centro activo

Intermediario enediol, se forma por transferencia de un protn de C2 al Glu 165 y un protn de His 95 al carbonilo

DHAP unida al centro activo

E + G3P

E- G3P

E-enediol

E- DHAP

E + DHAP

Aminocidos donadores de protones

2.- CATLISIS COVALENTE

Se forman enlaces covalentes transitorios E-S para facilitar la formacin de producto A-B + X: A-X + B A + X: + B

X: = Ncleo nucleoflico de la enzima

3.- CATLISIS POR IONES METLICOS

Los iones metlicos participan de diferentes formas en la catlisis. Orientacin del sustrato para que reaccione Estabilizando cargados estados de transicin de compuestos

Intervienen en reacciones redox cambiando su propio estado de oxidacin

Un tercio de las enzimas requieren algn in metlico para catalizar

Las enzimas tambin pueden contener sitios con la capacidad de unir cofactores, necesarios a veces en el proceso de catalisis, o de unir pequeas molculas, como los sustratos o productos (directos o indirectos) de la reaccin catalizada.

Estructura de la Mioglobina con grupo Hemo

Las enzimas tambin se clasifican sobre la base de su composicin.

Enzimas constituidas en su totalidad de protenas se conocen como enzimas.

Enzimas complejas o holoenzimas, se componen de protenas, ms una pequea molcula orgnica.. En donde la protena es la apoenzima, mientras que el componente no proteico se conoce como la coenzima o grupo prosttico. Muchos grupos de prsteticos y coenzimas son derivados de vitaminas solubles en agua.

COFACTORES: son iones inorgnicos que se unen temporalmente a las enzimas molcula Hierro Fe 2+ o Fe 3+ Cobre, Cu + o Cu 2+ Cinc, Zn2+

Oxidacin / reduccin Oxidacin / reduccin Ayuda a unir el NAD

COENZIMAS: molculas pequeas que tiene carbono, interaccionan dbilmente durante la catlisis. La mayor parte de las coenzimas son vitaminas, muchas de las cuales deben ser incorporadas con la dieta. molcula Biotina Coenzima A NAD y FAD

transporta -COOtransporta -CH2-CH3 transportan electrones

GRUPOS PROSTETICOS: estn permanentemente unidos a las enzimas molcula Hemo Flavina Retinal

une iones O2 y electrones, contiene el cofactor hierro une electrones Cofactor en la absorcin de la luz

ESPECIFICIDAD
Las enzimas suelen ser muy especficas tanto del tipo de reaccin que catalizan como del sustrato involucrado en la reaccin. La forma, la carga y las caractersticas hidrofilicas/hidrofobicas de las enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas tambin muestran: Estereoespecificidad Regioselectividad Quimoselectividad

MODELO DE LA "LLAVE-CERRADURA" * Sugerido por Emil Fisher en 1894. * La enzima y el sustrato poseen complementariedad geomtrica, cuyas formas encajan exactamente una con otra

MODELO DEL ANCLAJE INDUCIDO

En 1958 Daniel Koshland propone una modificacin al modelo de la llave-cerradura indicando que las enzimas son estructuras bastante flexibles, el sitio activo puede ser reformado por la interaccin con el sustrato. Como resultado de ello, la cadena aminocidica que compone el sitio activo es modificada en posiciones precisas que permite a la enzima llevar a cabo su funcin cataltica. En algunos casos, como en las glicosidasas, el sustrato cambia ligeramente de forma para entrar en el sitio activo.

MODULACIN ALOSTRICA
Los cambios alostericos (zonas de la enzima diferentes al sitio activo) permiten un cambio estructural de la protena en respuesta a la unin de efectores.

La modulacin puede ser directa, cuando el efector se une directamente a sitios de unin en la enzima, o indirecta, donde el efector se une a otra protena o a una subunidad proteca que interacta con la enzima alostrica y que influencia la actividad cataltica.

MODULACIN ALOSTRICA
El sitio de unin se conoce como sitio alostrico. A las enzimas que lo contienen, se les denomina alostricas. Las interacciones alostricas pueden tanto inhibir como activar enzimas, y son una forma muy comn de controlar las enzimas en las clulas

EFICIENCIA CATALITICA
* La mayora de las reacciones catalizadas por enzimas son muy eficientes y transcurren desde 106 hasta 1014 veces ms rpido que la misma reaccin no catalizada. * Tpicamente, cada molcula de enzima es capaz de transformar cada segundo de 100 a 1000 molculas de substrato en producto. * El nmero de estas molculas transformadas a producto por molcula de enzima en cada segundo, se conoce como el nmero de recambio.

Enzima

Anhidrasa carbnica Corismato mutasa Triosafosfato isomerasa Carboxipeptidasa A AMP nucleosidasa Nucleasa estafilococal

Velocidad en ausencia de enzima 1.3 X 10 1 2.6 X 10 5 4.3 X 10 6 3.0 X 10 9 1.0 X 10 11 1.7 X 10 -13

Velocidad de reaccin catalizada 1.0 X 106 50 4300 578 60 95

Rendimient o 7.7 X 106 1.9 X 106 1.0 X 109 1.9X 1011 6.0 X 1012 5.6 X 1014

SDS-PAGE
Lane 1, molecular weight standards; Lane 2, 164,500 g supernatant (20 lg); Lane 3, 20 mg protein corresponding to the peak of ADH activity after anionic exchange (DEAE-Biogel) chromatography; Lane 4, fraction 25 (10 mg protein) obtained after affinity-chromatography on 5AMP-Sepharose

37.5 kDa

CINTICA ENZIMTICA
Es el estudio cuantitativo de la catlisis enzimtica. Determina la afinidad de las enzimas por sus sustratos y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, cmo es controlada su actividad en la clula

Funciones de estado:
Energa Interna Entalpia Entropa Energa Libre de Gibbs Direccionalidad y espontaneidad de una reaccin

Cintica qumica:

Determina la rapidez/velocidad en la que ocurre una reaccin

A Vo = k [A]x

Vo = Velocidad Inicial K = Constante de velocidad (depende de T, pH, etc) X = Orden de la reaccin

CINTICA ENZIMTICA
Las reacciones enzimticas se ajustan a dos tipos de cinticas, que son: Hiprbolas rectangulares: enzimas que siguen la cintica de Michaelis-Menten

Sigmoidales: enzimas alostricas que muestran fenmenos de cooperatividad

En 1913, Leonor Michaelis y Maude Menten desarrollaron y propusieron una ecuacin de velocidad que explica el comportamiento cintico de las enzimas.

Michaelis, L., and Menten, M. L., Die Kinefik der Invertinwirkung, Biochem. Z., Berlin, 1913, 49~ 333.

Reaccin modelo.
Michaelis y Menten En este modelo la enzima se combina reversiblemente con su substrato para formar el complejo enzima-sustrato (ES) que subsecuentemente se rompe para formar el producto, hecho que regenera a la enzima.

k1 k2 ES ES EP k 1
S = substrato E = enzima ES = complejo enzima substrato, complejo de Michaelis y Menten, complejo intermediario K1 (de formacin) ,k-1 (de disociacin) y k2(liberacion de producto) son las constantes de velocidad de la reaccin.

Vo = Vmax [S] Km + [S]

ORDEN DE REACCION
Cuando [S]0 es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer orden (la velocidad es proporcional a la concentracin de sustrato) . Vo = k [A]x

A altas [S]0, la enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la velocidad ya no depende de [S]0. En este punto, la reaccin es de orden cero y la velocidad es mxima (Vmax).

Vo = k [A]x

Representacin grfica del estado preestacionario de una reaccin enzimtica donde se puede apreciar la fase inicial rpida
3) Las V de las reacciones son medidas en el estado estacionario

2) Despus de este tiempo, la V cambia relativamente lenta los intermediarios son encontrados en el estado estacionario

1) Al mezclar una enzima con una gran cantidad de sustrato, hay un periodo conocido como: preestacionario

ORDEN DE REACCION
REACCIN DE PRIMER ORDEN la velocidad es proporcional a la concentracin de sustrato).

REACCION DE ORDEN CERO la velocidad ya no depende de [S]0.

Si se mantiene la concentracin de la enzima constante y variando la concentracin de substrato se obtiene una curva hiperblica

Vo = Vmax [S] Km + [S]

Si Km = [S]
Vo = V max 2

Velocidad mxima: la velocidad de una reaccin (v) es el nmero de molculas de substrato convertidas en producto por unidad de tiempo y usualmente se expresa en moles de producto formadas por minuto.

La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima, aumenta conforme se incrementa la concentracin de substrato hasta que se llega a una velocidad mxima (Vmax), a partir de la cual la velocidad de la reaccin, es independiente de la cantidad de substrato.

El que la velocidad no pueda seguirse incrementando, refleja la saturacin del sitio activo con el substrato.

Vmax

Velocidad inicial (Vo): Es la velocidad ejercida por la enzima, inmediatamente despus de que se ha puesto en contacto con el substrato y hasta antes de que se haya consumido el 10 % de la concentracin inicial del mismo. La razn de lo anterior es que en ese momento, la concentracin del producto de la reaccin que se ha acumulado, en muy pequea y, por tanto, la reaccin en el sentido inverso, es decir, la transformacin del producto en el substrato original, puede ser ignorada.

Caractersticas de Km:
* La constante de Michaelis-Menten es caracterstica de una enzima y particular para un substrato. * Refleja la afinidad de la enzima por ese substrato.

* Km es numricamente igual a la concentracin de substrato a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la Vmax (Km= Vmax/2). * Este parmetro, Km no vara con la concentracin de enzima.

Significado de una Km pequea: un valor numrico pequeo de Km refleja una alta afinidad de la enzima por su substrato porque a una baja concentracin del mismo, la enzima a desarrollado ya la mitad de la velocidad mxima. Significado de una Km grande: el valor numrico grande de Km refleja una baja afinidad de la enzima por su substrato porque a una concentracin elevada del mismo, la enzima desarrolla la mitad de la velocidad mxima.

Relacin Velocidad-Concentracin de enzima

La velocidad de la reaccin es directamente proporcional a la concentracin de la enzima a cualquier concentracin de substrato. Por ejemplo, si la concentracin de enzima es disminuida a la mitad, la velocidad inicial de la reaccin (v0) es reducida tambin a la mitad de la original.

S se trabaja con la condicin de que la concentracin del substrato sea saturante, variando entonces la concentracin de enzima,

Inhibition of 1,3GalT by Gal1,3GlcNAc-C8. 1,3GalT (43 ng/l enzyme) activity was measured with different concentrations of LacNAc-C8 in the presence of various concentrations

La ecuacin de Michaelis y Menten describe como vara la velocidad de reaccin con la concentracin de sustrato:
S es la concentracin de sustrato

Vmax S v0 Km S
en donde: v0 es la velocidad inicial de la reaccin Vmax es la velocidad mxima Km es la constante de Michaelis y Menten=

La Vmax corresponde al valor mximo al que tiende la curva experimental, y la Km corresponde a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la Vmax.

Articulo mas citado de toda la historia cerca de 6,000 citas cientificas

La representacin grfica de Lineweaver-Burk permite identificar la Km (constante de Michaelis-Menten) y Vmax (velocidad mxima); el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de 1/Kmas de fcil.

1.Qu informacin puede obtenerse a partir de una representacin de Lineweaver-Burk cuando la recta obtenida, extrapolada convenientemente corta al eje X en 40 (mol/L)-1.

1.Calcular la Km y la Vmax a partir de una representacin de dobles inversos sabiendo que la recta obtenida corta al eje de ordenada en 5103 (moles/min) y la pendiente de dicha recta es 120 min/L.

1.En base a los siguientes datos, calcular los valores de Km y Vmax, segn la representacin de doble inversos.

[S] (M) 2.1 10-5 2,5 x 10-5 3,3 x 10-5 5,0 x 10-5 1,0 x 10-4 1,5 x 10-4 2,0 x 10-4 3,0 x 10-4 5,9 x 10-4 1,4 x 10-3

Actividad U/mg protena) 0.67 0.75 0.91 1.16 1.56 1.79 1.92 2.10 2.27 2.50

Grfico de Lineweaver-Burke
An as, si se grafica una doble recproca, es decir, el inverso de la velocidad (1/v0) contra el inverso de la concentracin de substrato (1/S), se obtiene una lnea recta. El grfico de Lineweaver-Burke, tambin se denomina de dobles recprocas y se utiliza para calcular la km y la vmax as como para determinar el mecanismo de accin de los diversos tipos de inhibidores.

La ecuacin que describe a la grfica de Lineweaver-Burke es:

1 Km 1 v 0 Vmax S Vmax
que describe una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es igual a 1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1/Vmax.
Lineweaver, H; and Burk, D. (1934). The Determination of Enzyme Dissociation Constants. J. Ameri. Chem. Soc. 56: 658666

Experimento cintico para la actividad enzimtica

Cuando se grafica la velocidad de la reaccin, v0, contra la concentracin de substrato, S, no siempre es posible determinar la condicin en que se ha llegado a la velocidad mxima, Vmax, debido al incremento de la pendiente en la hiprbola a concentraciones de substrato elevadas. Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al modelo de Michaelis.

Experimento cintico para la actividad enzimtica. grfico de Lineweaver-Burke Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al modelo.