PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM BIOFSICA

RADIOBIOLOGIA E FOTOBIOLOGIA PROF LVARO LEITO

Journal of Molecular Biology (1974) Diogo Neves G. da Silva Francisco Carlos da Silva

INTRODUO
Em mutantes de E. coli K12 uvr, deficientes em exciso e, consequentemente, mais sensveis do que o tipo selvagem para UV, os dmeros permanecem no DNA, ou em molculas que podem ser precipitadas pelo cido tricloroactico (Howard-Flanders et al., 1966, Boyle & Setlow, 1970). O DNA sintetizado por clulas uvr, logo aps irradiao com UV, contm fragmentos que sedimentam mais lentamente em gradientes de sacarose alcalino em relao a clulas controle com o DNA no irradiado (Rupp & Howard-Flanders, 1968; Howard-Flanders et al, 1968).

INTRODUO
O objetivo do trabalho foi demonstrar se dmeros de pirimidina, induzidos por UV, permanecem no DNA aps a irradiao ou se so transferidos para algum componente da frao precipitada com cido. Trs premissas do modelo atual para o reparo ps-replicao foram testados: 1) O nmero de dmeros de pirimidina no DNA irradiado deve permanecer constante em clulas uvr ao longo do reparo; 2) Nenhum dmero deve aparecer no DNA replicado, mesmo que ocorram trocas entre fitas irradiadas e molculas filhas; 3) Fitas-molde sem dmeros devem ser detectadas em clulas irradiadas que comearam a produzir molculas-filhas de DNA de alto peso molecular.

MATERIAIS E MTODOS
Cepas bacterianas:

As bactrias utilizadas foram cepas derivadas de E. coli K12, como:

AB2487 recA13, AB2499 uvrB5, AB2500 uvrA6, SR72 uvrB5 recA56, SR111 recA13, recB21 e SR159 recB21, uvrB5.

As colnias foram cultivadas 37C, com meio mnimo, contendo glicose, aminocidos, tiamina e timina. Foram utilizados para o experimento culturas na fase exponencial, com cerca de 108 clulas/mL.

MATERIAIS E MTODOS
Irradiaes:

Aproximadamente de 2 a 4108 clulas/mL foram irradiadas com uma lmpada germicida a 254 nm. A taxa de dose incidente foi 0,73 ergs/mm2. As suspenses de clulas foram estimuladas durante a irradiao por uma plataforma rotativa shaker. As culturas foram mantidas no escuro ou em luz amarela aps a irradiao para evitar a fotorreativao.

MATERIAIS E MTODOS
Fotorreativao:

As clulas foram fotorreativadas pela exposio luz de uma lmpada de mercrio de alta presso (200W) filtrada numa placa de Petri para remover comprimentos de onda abaixo de 390nm. A suspenso de clulas foi exposta por 30s, depois removida da luz por 30s e novamente exposta por 30s (total: 20min de exposio).

MATERIAIS E MTODOS
Marcao Radioativa:
1) Marcao simples

As cepas foram cultivadas por, pelo menos, 3 geraes em meio contendo 2g/mL de timina no-radioativa e 50Ci de [metil-3H] timina/mL. Aps crescerem, foram centrifugadas, lavadas 2 vezes e ressuspensas em 2mL de meio fresco contendo 10g/mL de timina no-radioativa. As culturas foram ento incubadas por 30min antes de serem irradiadas.

timina no-radioativa +

50Ci de [metil-3H] timina/mL

MATERIAIS E MTODOS
2) Marcao dupla

As cepas foram cultivadas por, pelo menos, 3 geraes em meio contendo 2Ci de [2-14C] timina/mL. Aps crescerem, foram centrifugadas, lavadas 2 vezes e ressuspensas em 2 ou 4mL de meio fresco contendo 1,610-5 M de timina noradioativa. As culturas foram ento incubadas por 30min antes de serem irradiadas.
10Ci/mL de 2Ci de [2-14C] timina/mL

Aps a irradiao, [3H] timidina foi adicionada para dar uma concentrao final de 10Ci/mL e as clulas foram reincubadas. Vrias amostras em diferentes tempos foram retiradas. Controle: no-irradiado, tratado de forma igual, com marcao de [3H] timidina por 60min.

MATERIAIS E MTODOS
3) Marcao dupla

As cepas foram cultivadas por, pelo menos, 3 geraes em meio contendo 2Ci de [2-14C] timina/mL. Aps crescerem, foram centrifugadas, lavadas 2 vezes e ressuspensas em 2 ou 4mL de meio fresco contendo 1,610-5 M de timina noradioativa. As culturas foram ento incubadas por 30min antes de serem irradiadas.
10Ci/mL de

10, 15 e 20min 2Ci de [2-14C] timina/mL

Aps a irradiao, [3H] timidina foi adicionada para dar uma concentrao final de 10Ci/mL, e depois removida em 10, 15 e 20 min. As clulas foram filtradas, lavadas e ressuspensas em 2 ou 4mL de meio contendo 810-5 M de timina no-radioativa. Aps a reincubao, vrias amostras em diferentes tempos foram retiradas. Controle: no-irradiado, tratado de forma igual, com retirada de amostra aps 10 ou 15min de incubao com [3H] timidina.

MATERIAIS E MTODOS
4) Marcao dupla

As cepas foram cultivadas por, pelo menos, 3 geraes em meio contendo 2Ci de [2-14C] timina/mL. Aps crescerem, foram centrifugadas, lavadas 2 vezes e ressuspensas em 2 ou 4mL de meio fresco contendo 1,610-5 M de timina noradioativa. As culturas foram ento incubadas por 30min antes de serem irradiadas.
10Ci/mL de

2Ci de [2-14C] timina/mL

Aps a irradiao, as clulas foram reincubadas em meio contendo 1,610-5 metiltimina por 2h, seguido da adio de [3H] timidina (concentrao final de 10Ci/mL). Aps 15min, foram retiradas amostras das clulas.

MATERIAIS E MTODOS

Esquemas de marcao radioativa:

MATERIAIS E MTODOS
Tratamento com a endonuclease:

A preparao da endonuclease continha 1200 unidades/mL e foi purificada por eletroforese de gel de acrilamida. Unidade na presena de clulas infectadas pelo fago T4, libera 1 nmol de nucleotdeos solveis em cido por hora. A enzima produzir rupturas dos filamentos simples no DNA irradiado. Amostras de 0,5mL de culturas contendo de 1 a 5108 clulas/mL foram centrifugadas a 0C, lavadas e ressuspensas em tampo de sacarose. As clulas a serem tratados com a enzima foram primeiramente expostas a uma lisozima e a um detergente para se tornarem permeveis por 30min a 0C, seguido pelo tratamento com a endonuclease por 15min. As condies da reao foram escolhidos para produzir o mximo nmero de quebras de fita simples no DNA irradiado.

MATERIAIS E MTODOS
Gradientes alcalinos de sacarose:

O gradiente alcalino inibe a reao da endonuclease. Foram usados gradientes lineares de 5 a 20% de sacarose, contendo 4,8 ou 3,7mL de soluo, que foram centrifugados e coletados em fraes para detectar radioatividade (espectrofotmetro de cintilao). As fraes contendo os picos de energia foram usadas para calcular o peso molecular mdio, atravs do DNA do bacterifago .

MATERIAIS E MTODOS
Sntese de DNA:

A sntese de DNA foi medida pela incorporao de timina radioativa usando uma modificao de um procedimento descrito por Smith et al., 1968.

[metil-3H] timina foi adidionada s culturas em fase exponencial em meio contendo 1,610-5M de timina no-radioativa.
As clulas foram incubadas at chegar a uma densidade de cerca de 1108 clulas/mL (por pelo menos duas geraes). Cada cultura foi dividido em trs partes, duas das quais foram irradiadas, enquanto a terceiro serviu como controle no-irradiado. As culturas foram reincubadas e amostras foram retiradas em diferentes intervalos, e a radioatividade no precipitado foi determinada.

RESULTADOS
a) Perda dos stios sensveis endonuclease no DNA irradiado de clulas deficientes em exciso:

Os dmeros de pirimidina induzidos pela UV permanecem no DNA irradiado ao longo do reparo ps-replicao? O DNA foi marcado em clulas uvr antes da irradiao e foi observada sua sensibilidade endonuclease especfica UV do fago T4 em tempos diferentes. O DNA das clulas incubadas 60 ou 120 minutos aps a irradiao com UV sedimentaram mais rpido que o DNA das clulas retiradas imediatamente aps a irradiao, sugerindo uma perda progressiva de stios sensveis endonuclease durante a incubao. Essa reposta indica que dmeros so removidos do DNA irradiado sob essas condies ou so alterados, de modo que eles no seriam mais sensveis nuclease. Essa perda no causada por exciso ou fotorreativao residual.

RESULTADOS

RESULTADOS

= controle (no-irradiadas tratadas com enzima)

tratamento com endonuclease em diferentes tempos

RESULTADOS
b) Aparecimento de stios sensveis endonuclease no DNA aps a irradiao:

Existem stios sensveis endonuclease no DNA sintetizado? Clular marcadas com [14C] timina antes da irradiao e [3H] timidina aps a irradiao.

Aps 2h, o tratamento com a enzima reduziu os DNAs a aproximadamente o mesmo tamanho = a distncia entre os stios sensveis eram os mesmos no DNA sintetizado e na fita-molde.
Aps 10min, o DNA marcado com [3H] timidina foi heterogneo em seu tamanho. Quando os gaps na fita filha foram preenchidos, e os fragmentos unidos em molculas maiores, a juno causou a insero de stios sensveis enzima.

RESULTADOS

RESULTADOS
= controle (no-irradiadas tratadas com enzima) tratamento com endonuclease em DNA irradiado e sintetizado

10min aps irradiao

2h aps irradiao

RESULTADOS

tratamento com endonuclease em DNA irradiado e sintetizado = controle (no-irradiadas tratadas com enzima)

10min aps irradiao

2h aps irradiao

RESULTADOS

tratamento com endonuclease em DNA irradiado e sintetizado = controle (no-irradiadas tratadas com enzima)

DNA marcado com [3H] timidina = sintetizado 10min aps irradiao 2h aps irradiao

RESULTADOS

As posies relativas dos picos nas amostras tratadas com endonuclease sugerem que a distncia entre os stios sensveis endonuclease no DNA parental e sintetizado aumenta conforme o tempo de incubao.

Os stios sensveis endonuclease tambm se tornaram menos frequentes no DNA com o aumento do tempo de incubao aps a irradiao.
Essa perda de stios ocorreu mais devagar em doses maiores (40 e 20 ergs/mm2). Clulas mutantes em recA foram utilizadas para testar se o DNA sintetizado sedimenta da mesma forma que o DNA parental e se h efeitos aps a incubao com a endonuclease.

RESULTADOS
= controle (no-irradiadas tratadas com enzima)

tratamento sem endonuclease em DNA sintetizado = gaps no preenchidos

RESULTADOS
= controle (no-irradiadas tratadas com enzima) tratamento com endonuclease em DNA irradiado e sintetizado

tratamento sem endonuclease em DNA sintetizado = gaps no preenchidos

RESULTADOS
c) Stios sensveis endonuclease no DNA sintetizado em 2 ou mais horas aps a irradiao:

Quando clulas deficientes em exciso so incubadas em meio de crescimento por 2 ou mais horas aps a irradiao e marcadas por 10min, a maioria do DNA marcado sedimenta da mesma forma que o DNA controle no-irradiado. Clulas marcadas por 10min imediatamente aps a irradiao sedimentam mais lentamente. O DNA aparentemente intacto aps 2 ou mais horas aps a irradiao contm stios sensveis endonuclease?

Aps 2h de incubao, as fitas filhas apresentam stios sensveis endonuclease, pois elas so clivadas e assim, aparecem fragmentos menores no gradiente de sacarose.

RESULTADOS
= controle (no-irradiadas tratadas com enzima) tratamento com endonuclease em DNA irradiado e sintetizado

2h / 15min com [3H] timidina 15min com [3H] timidina

15min com [3H] timidina / 2h

RESULTADOS
= controle (no-irradiadas tratadas com enzima) tratamento com endonuclease em DNA irradiado e sintetizado DNA marcado com [3H] timidina = sintetizado

2h / 15min com [3H] timidina 15min com [3H] timidina

15min com [3H] timidina / 2h

RESULTADOS
d) Fotorreativao de stios sensveis endonuclease:

especfica para dmeros de pirimidina. Os stios sensveis endonuclease, particularmente aqueles observados no DNA sintetizado aps a irradiao, so dmeros? Aps marcao com [3H] timidina, a cultura irradiada foi dividida em 2 partes: uma foi exposta fotorreativao e a outra permaneceu no escuro. Os stios sensveis endonuclease foram removidos, tanto no DNA parental quanto no DNA sintetizado.

As cpias de DNA sintetizado (no-irradiado) parecem ter dmeros.

RESULTADOS
tratamento com endonuclease em DNA irradiado e = controle (no-irradiadas sintetizado tratadas com enzima)

Escuro

Fotorreativao

RESULTADOS
e) Sntese de DNA e perda de stios sensveis endonuclease aps a irradiao:

Os stios sensveis endonuclease diminuem gradualmente no DNA parental e sintetizado aps a irradiao, com clulas em crescimento. Dmeros produzidos pela irradiao podem ser gradualmente distribudos entre sucessivas geraes de molculas-filhas de DNA. A diminuio desses stios deve se correlacionar com a quantidade relativa do novo DNA sintetizado aps a irradiao.

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

DISCUSSO

A presena de dmeros de pirimidina torna o DNA suscetvel clivagem pela endonuclease especfica ao UV do fago T4. A diminuio gradual dos stios sensveis endonuclease nas clulas uvr irradiadas reflete uma remoo lenta dos dmeros. Este processo inibido pela ausncia de aminocidos requeridos pela clula, porm ela permanece passvel de fotorreativao. Os dmeros permanecem no DNA numa forma que pode ser reconhecida e reparada pela enzima de fotorreativao. Os dmeros induzidos pela UV no so alterados ou removidos pelo DNA irradiado em clulas uvr quando o ciclo de replicao terminado pela ausncia de aminocidos. Qualquer reparo nessas clulas requer a sntese de DNA.

DISCUSSO

A perda de stios sensveis endonuclease no DNA irradiado poderia refletir a remoo de dmeros nas fitas irradiadas, ou uma alterao tornando-as irreconhecveis enzima.

Como esses stios aparecem nas fitas filhas, provvel que os dmeros sejam removidos das fitas irradiadas e incorporados molculas-filhas.
Realmente so dmeros pois a fotorreativao diminiu os stios sensveis. Experimentos de transferncia de densidade evidenciaram que o DNA parental irradiado troca fragmentos com fitas-filhas, sob condies similares. Esses fragmentos podem incluir os dmeros.

Essa troca no ocorre de forma rpida, a tornar o DNA intacto. Uma lenta diluio de dmeros pode ocorrer gradualmente ao longo das sucessivas geraes de molculas-filhas.

DISCUSSO

Enquanto houver dmeros persistindo na clula, a troca de dmeros continuar ocorrendo.

DISCUSSO

AGRADECEMOS A ATENO!!!

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

selvagem

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

selvagem

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

Reparo ps-replicao em E. coli uvr (no escuro)

recA