Enzimas

Desde 1850, Pasteur reconoce que las fermentaciones en levadura son catalizadas por fermentos. A fines del siglo XIX, Buchner hizo fermentaciones de azcares a alcohol in vitro, o sea, en un sistema no viviente. Las enzimas son catalizadores proteicos (salvo las ribozimas) que se distinguen por su eficiencia y especificidad. En la clase debe quedar claro porqu son esenciales para la clula. No habra vida si no fuese por la catlisis

Se purifican con las tcnicas ya descritas. Es muy importante el ensayo.

Varias requieren un cofactor, sea un metal o una coenzima.

Ser un vestigio de la catlisis primitiva?

Por lo general, las coenzimas derivan de vitaminas, componentes esenciales de la dieta

Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reaccin que catalizan

Reaccin enzimtica

E + S <----> ES <----> EP <----> E + P

Enzimas no afectan el equilibrio, sino la velocidad!!

En este caso, el nivel energtico del P es menor que el del S, por lo tanto G es negativo y la reaccin es espontnea. Pero espontaneidad no tiene que ver con la velocidad!

La velocidad de reaccin est determinada por la energa de activacin, mediante la frmula:

G/RT
+ +

k = (kT/h) e

k es la constante de Boltzman y h la constante de Plank

En una reaccin monomolecular (un solo sustrato), k es una constante de primer orden y sus unidades son seg-1 (porque v = dS/dt = kS, expresado en trminos de unidades, es M/seg = kM). Si la reaccin es de dos sustratos, la constante es de segundo orden y sus unidades son seg-1M-1. La energa de activacin representa la barrera energtica que hay que vencer para llevar al sustrato al estado de transicin.

El estado de transicin es una forma del sustrato que se ha activado mediante una reaccin qumica parcial, a partir del cual el sustrato puede ir a P o volver a S. Su formacin es una etapa limitante de la reaccin y su existencia es transiente . El estado de transicin no es un intermediario en particular de la reaccin. Lo que hace la enzima es bajar la G+ ofreciendo un camino alternativo.
+

Se debiera esperar que un anlogo estable de un supuesto estado de transicin sea un buen inhibidor de una reaccin enzimtica. Este es efectivamente el caso (por ej) de la prolina racemasa. Ambos anlogos planares unen la enzima con una afinidad 160 veces mayor que la prolina.

Enzimas y anticuerpos comparten el ser protenas que unen compuestos en forma especfica. Se ha visto que cuando anlogos de supuestos estados de transicin de reacciones enzimticas son incubados con anticuerpos, stos aceleran las reacciones de descomposicin espontnea de los anlogos en varios rdenes de magnitud. Esto da origen al concepto de anticuerpo cataltico (abzyme). Actualmente se estn explorando aplicaciones clnicas de estos anticuerpos.

Se han aislado varios anticuerpos que catalizan la hidrlisis de estos steres anlogos de los estados de transicin de la hidrlisis enzimtica de steres y carbonatos

El G de una reaccin est dado por:

G = G + RTln([P]/[S])
Las condiciones estndares para G son 298 K, 1 atmsfera y 1 M de P y S. Si se hace a pH = 7.0, se tiene G. Se mide en Kjoule/mol o Kcal/mol.

En el equilibrio, G = 0 y la razn [P]/[S] = Keq De donde se deduce que:

G = - RTlnKeq
Por lo tanto, el G est relacionado a la constante de equilibrio de la reaccin.

Por lo tanto, a menor Keq, ms positivo el G y menos espontnea la reaccin

Cmo se explica la disminucin de G+ que permite que el estado de transicin se alcance ms rpido?

Por la energa de unin, derivada de la interaccin de E con S por medio de las interacciones no covalentes que hemos descrito: inicas, enlaces de H, van der Waals e hidrofbicas. En cada interaccin hay un G, lo que podra estar ayudado por un factor entrpico, dependiendo de el o los sustratos.

Aunque las enzimas pueden ser activas faltndoles fragmentos, su gran tamao se explica por la optimizacin de estas interacciones

La interaccin E con S no es llave cerradura como lo propuso Emil Fisher a fines del siglo XIX, puesto que de ser as no ocurrira ningn cambio en el S.

Ocurre ms bien mediante un encaje inducido (Koshland 1958).

Demostracin del encaje inducido con la hexoquinasa (107.862 D)

Al entrar glucosa al sitio activo, el OH del C6 desplaza una molcula de agua que normalmente se encuentra en esa posicin. Este OH del C6 es el que se fosforila con el P g del ATP. La xilosa se une tambin al sitio activo pero como no tiene C6, no desplaza al agua. Cuando en este caso se agrega ATP, la enzima es engaada y fosforila el agua. La fosforilacin del agua no ocurre si no se agrega la xilosa, lo que demuestra que sta (y por ende la glucosa) provoca un cambio conformacional que activa a la enzima para que catalice la ruptura del enlace fosfoanhidrido entre los fosfatos b y g del ATP.

La energa de unin alcanza para vencer una serie de obstculos: a) entrpico, cuando corresponda, ya que la entropa puede disminuir al unirse uno ms sustratos a la enzima;

b) ruptura de interacciones sustrato-solvente (solvatacin);

c) la distorsin que hay que introducir en el S para pasarlo a P

d) lo ms importante: para romper enlaces.

Pero hay otros factores, adems de la energa de unin, que contribuyen de un modo fundamental a bajar la energa de activacin

Efectos de proximidad y orientacin. La importancia de este factor se aprecia, por ej, en la reaccin no enzimtica de un ster con un carboxilo para formar un anhidrido
*

* Cuociente entre las constantes de velocidad.

Catlisis cido-base: en la catlisis cida general hay una transferencia transitoria de un protn desde un cido de Bronsted (especie que dona H+), bajando la energa libre del estado de transicin. La catlisis bsica general ocurre cuando una base de Bronsted abstrae protones. En una reaccin puede haber simultneamente catlisis general cida y bsica. Se habla de catlisis cido-base especfica cuando participa el agua.

Figura: hidrlisis de un enlace peptdico: B) el protn entregado por el cido promueve un alejamiento de los e- del C carbonlico, facilitando el ataque del O del agua; C) al asociarse el carboxilo a un H del agua, los e- se mueven hacia el oxgeno del agua, facilitndose tambin el ataque al C carbonlico; D) una enzima puede hacer simultneamente catlisis cida y bsica.

bsica

general
cida

Reaccin catalizada por la RNAsa A con dos his: una actuando como cido y la otra como base

especfica

Fosfohexosa (o fosfogluco) isomerasa: una enzima de la glicolisis

(esta parte no se detalla)

El protn que retira el glu no necesariamente es el mismo que es devuelto al C1, porque al ser glu un cido dbil, el protn es intercambiado libremente con el agua.

Residuos del sitio activo que tpicamente participan en catlisis cido-base

Dada la importancia de los pKa de los aa del sitio activo en la catlisis cido-base, las enzimas son muy sensibles al pH. Recordar que la pepsina acta en el jugo gstrico (pH = 1.5), la tripsina en el intestino delgado y la fosfatasa alcalina en tejido seo.

Catlisis covalente: con formacin transiente de un enlace covalente E-S, ocurriendo etapas nucleoflicas y electroflicas en las que participan cadenas laterales de aa o coenzimas. Ej: decarboxilacin de acetoacetato

El N protonado de un e de la lis acta como imn de electrones. Coenzimas tpicas de este tipo de catlisis son el piridoxal-P y la tiamina-PP o TPP.

Catlisis por iones metlicos: aprox. un tercio de las enzimas requieren metal. Pueden ser metaloenzimas (Cu, Fe, Zn, Mn) o enzimas activadas por metales: K, Mg, Ca. Tpicamente en reacciones de xido-reduccin. Ej: enolasa, enzima de la glicolisis.

Primero, la lis 345 hace catlisis bsica general y luego el glu 211 hace catlisis cida general. Los iones de Mg2+ estabilizan el intermediario y facilitan la abstraccin del H+ del C2

Cintica enzimtica
Herramienta til para estudiar mecanismos de accin enzimticos. Qu pasa en el transcurso de una reaccin?
v = dP/dt

La velocidad de reaccin depende de la concentracin de S, la que va cambiando en el transcurso del tiempo. Una manera de simplificar el anlisis cintico es medir la velocidad inicial. Cuando el S est en exceso sobre la enzima, su cambio de concentracin en estas condiciones es despreciable.

Deduccin de la ecuacin de Michaelis-Menten

Condiciones: - velocidades iniciales (k-2 despreciable) - [S] >> [E] - steady state, es decir, d[ES]/ dt = 0
E + S <-----> ES <-----> E + P
k-1 k-2 k1 k2

En el steady state, formacin de ES es igual a su desaparicin: k1[E][S] = k-1[ES] + k2[ES] pero [ET] = [E] + [ES]

Al reemplazar E por ET - ES y despejar ES queda: [ET] [S] [ES] = -----------------Km + [S] k-1 + k2 donde Km = -----------k1

En definitiva, la velocidad de aparicin de P en las condiciones Michaelianas estar dada por: v = k2 [ES] Al reemplazar [ES] por [ET] [S] / (Km + [S]) queda: k2 [ET] [S] v = ------------------Km + [S] La velocidad mxima de la reaccin se dar cuando [ET] = [ES], es decir, Vm = k2 [ET]. Por lo tanto: Vm [S] v = --------------Km + [S]
Ecuacin de Michaelis-Menten

Representacin de la ecuacin de Michaelis-Menten: una hiprbola

A pesar de que se debe cumplir que [S] > > > [E], la dependencia de la velocidad inicial en [S] se da porque la formacin de ES est en equilibrio con su disociacin a E + S. Al crecer S, se desplaza el equilibrio hacia la formacin de ES y aumenta la velocidad.

Situaciones especiales: - Cuando v = Vmax, [S] = Km - Cuando [S] < < < Km, v tiene dependencia lineal con S - Cuando [S] > > >Km, v se aproxima asintticamente a Vmax

En la reaccin

E + S <-----> ES <-----> E + P
k-1 k-2

k1

k2

k-1 + k2 habamos definido Km = --------------k1

Si k2<<k-1, entonces Km = k-1/k1 k-1/k1 se define como la constante de disociacin de ES, o Ks. Solo en este caso, la Km da la idea de ser el recproco de la afinidad de la enzima por el sustrato

Habamos visto que Vm = k2[ET] corresponde a la velocidad lmite de la reaccin cuando la enzima est saturada. A esta constante de velocidad la podemos definir como constante cataltica:

Vm = k2[ET]

kcat = Vm/[ET]

Con unidades de seg-1, Kcat da el nmero de molculas de S que pasan a P por molcula de enzima y por unidad de tiempo (nmero de recambio o turnover number). No confundir con actividad enzimtica: una unidad enzimtica es la cantidad de enzima que convierte una cierta cantidad de S en P en cierto tiempo . As, uno obtiene U/ml. Ni con actividad especfica: U/mg protena

Pero en rigor, el solo valor de Kcat es una aproximacin a la real eficiencia de una enzima, porque no se cuantas veces est aumentando la velocidad respecto de la reaccin no catalizada. El mismo valor de Kcat para dos enzimas diferentes puede implicar una eficiencia bastante distinta.

Por tal motivo, se suela usar la razn kcat/Km como referencia de la eficiencia cataltica de una enzima o constante especfica. Tanto un valor alto de Kcat como una baja Km (alta afinidad de E por S) contribuyen a aumentar el valor de kcat/Km. Pero hay an algo ms. Kcat la hemos obtenido con una enzima saturada. Pero si quisiramos medir la frecuencia con que la enzima transforma al S en P cada vez que interacta con l, es mejor trabajar en una zona donde los encuentros de E con S sean ms ocasionales. Ello ocurrir si [S] <<< Km (como ocurre en la clula). En estas condiciones: k2[ET] [S] v = --------------------Km + [S] k2 v = ---- [ET][S] Km

En k2/Km = k1k2/(k-1 + k2), el cuociente ser mximo cuando k2 >>> k-1, es decir, cuando la formacin de P sea mucho ms rpido que la disociacin de ES a E + S. En este caso (nada de rebuscado), k2/Km = k1, que es la cte de velocidad en la formacin de ES a partir de E + S (de segundo orden : M-1seg-1). En estas condiciones, la velocidad de reaccin va a estar limitada por la velocidad de difusin de E y S.

Se ha establecido que el factor de la difusin para E y un S promedio establece un lmite superior mximo para k1 de 108-109 M-1seg-1. Se dice que enzimas que tienen Kcat/Km en este rango han alcanzado la perfeccin, porque catalizan la reaccin cada vez que encuentran una molcula de S.

Ntese que diferencias en kcat son distintas a las diferencias en kcat/Km

La hiprbola es muy poco precisa para calcular Km y Vmax

Por ejemplo, a una [S] igual a 10 Km, la velocidad es solo un 91% de Vmax

Mucho ms til es el llamado mtodo de los dobles recprocos, o ecuacin de Lineweaver- Burk, la que representa una recta

Reacciones con ms de un sustrato:

Tambin se analizan con criterios de Michaelis-Menten. Puede haber a) formacin de ES1S2 por entrada al azar u ordenada, b) o puede haber salida de P1 antes de la entrada de S2 (ping-pong).

Estas alternativas quedan en evidencia al hacer Lineweaver-Burk dejando una [S] constante en exceso y variando el otro. Si se intersectan, hay ES1S2. Si son paralelas, es ping-pong.

Complejo ternario

ping-pong

Inhibicin enzimtica

Se da cuando un compuesto afecta la cintica de una enzima. Puede ser: Competitiva Acompetitiva Mixta o no competitiva

Competitiva
El inhibidor (I) se une reversiblemente al sitio del S, por lo que hay que aumentar [S] para alcanzar la Vm. O sea, no se altera Vm pero si Km.

Competitiva

a = 1 + [I]/Ki
Ki = [E][I]/[EI]

La Ki es la constante de disociacin del I, lo que da una idea de su eficiencia como tal. Una Ki chica significa un buen inhibidor. Puede ser calculada sacando la pendiente de las distintas rectas obtenidas a [I] diferentes.

Acompetitiva
El I solo se une a ES, por lo tanto a un sitio diferente al sitio activo, de modo que al aumentar S no se llega a Vm.

Acompetitiva

a = 1 + [I]/Ki
Ki = [ES][I]/[ESI]

Se afectan tanto Km como Vm.

Mixta
El I se une a un sitio distinto del sitio activo y lo hace tanto a la E como al ES

Mixta

Puesto que se une tanto a E como a ES, podemos determinar una Ki y una Ki. Tambin se afectan tanto la Km como la Vm y puede ser distinguida por su cintica.

Se habla de Km o Vm aparente cuando en una reaccin con ms de un sustrato, estos parmetros se determinan variando la concentracin de solo uno de ellos en presencia de un exceso de los dems. Los valores absolutos de Km y Vm se obtienen solo despus de hacer un anlisis cintico ms elaborado desarrollado por W.W. Cleland. En general, los valores absolutos son semejantes a los aparentes.

Otra clasificacin de estas tres inhibiciones es competitiva y mixta, siendo la acompetitiva un caso especial de la mixta. Por cierto, todo esto se puede complicar. Cuando la E tiene ms de un S, el I puede ser competitivo para uno u otro si es que tienen distintos sitios de unin. Tambin puede unirse a ES1 si la entrada es ordenada y ser acompetitivo para S2, etc. Existen tambin inhibidores suicidas: se parecen al S y son parcialmente modificados a una especie que se une en forma irreversible a la E. Pueden ser muy tiles como agentes teraputicos.

Regulacin enzimtica

Alosterismo

Modificacin covalente
Ms excepcionalmente: por unin a otras protenas y por procesamiento proteoltico

Enzimas alostricas
Tpicamente catalizan la reaccin inicial (comprometida) en una va metablica y son reguladas por inhibicin feedback por el producto final de la va. Tambin pueden ser activadas por algn efector. Tanto inhibidores como activadores se unen a sus respectivos sitios alostricos, distintos al sitio activo. Por lo general tienen estructura cuaternaria y los sitios activos y alostricos pueden estar en subunidades diferentes.

Ej: aspartato transcarbamilasa 6 subunidades catalticas (azul y prpura, sitio activo) 6 subunidades reguladoras (rojo y amarillo, sitio alostrico)

Enzimas alostricas
El propio S induce un cambio conformacional ejerciendo un efecto homotrpico positivo, dando una cintica sigmodea (izq.) semejante a la que da la unin de O2 a la hemoglobina (der.). En la primera se define K0.5, parmetro que evoca la Km en enzimas michaelianas.

Enzimas alostricas
Los efectores ejercen efectos hterotrpicos positivos (activadores) o negativos (inhibidores). Los primeros acercan la cintica a una de tipo hiperblico.

Los efectores cambian K0.5 pero no Vmax

Enzimas alostricas
Una manera de explicar el efecto hterotrpico positivo (activador alostrico) es que ste produce un cambio conformacional en su subunidad regulatoria que es transmitido a la subunidad cataltica, la que adopta una forma ms afn al sustrato.

efecto heterotrpico positivo

efecto heterotrpico negativo

Otro ejemplo que permite como un ligando puede ejercer un efecto homotrpico positivo (si es el ligando o sustrato normal) o heterotrpico positivo (si es solo un modulador)

Dos modelos para explicar la cooperatividad positiva

(alosterismo, hemoglobina, etc) Monod, Wyman, Changeux Koshland

baja afinidad

alta afinidad

Regulacin enzimtica por modificacin covalente

(protena de 76 aa)

Un caso interesante de regulacin alostrica y covalente (hay varios): la glicgeno fosforilasa. En este caso vemos la isoenzimas de hgado y msculo.

En enzima de msculo: sitio alostrico para el AMP (activador) En enzima de msculo: sitio alostrico para la glucosa (inhibidor)