Staphylococcus

Dra. Elsa Masae Mamizuka USP Dr. Antnio Carlos Pignatari

Diretor do Laboratrio Especial de Microbiologia LEMC

Introduo a cocos Gram-positivos Caractersticas do Gnero Staphylococcus Staphylococcus aureus Enzimas Extracelulares Testes de aglutinao rpida para coagulase Padres de Hemlise Regulao de Fatores de Virulncia Staphylococcus epidermidis Outras espcies de Staphylococcus Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus Staphylococcus saprophyticus Deteco de resistncia de Staphylococcus aureus oxacilina e ou vancomicina Resistncia aos Antibiticos Staphylococcus aureus resistente oxacilina-ORSA Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxaclina ( meticilina) Resistncia Vancomicina Deteco da VISA/VRSA Relao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

ndice

Introduo a cocos Gram-positivos

Os cocos Gram positivos (CG+) compem um grupo de grande importncia clnica. So responsveis por inmeras e variadas afeces e sndromes. Os CG+ anaerbios facultativos de importncia clnica pertencem a uma de duas famlias: Micrococcaceae ou Streptococcaceae

Pesquisa de catalase na bactria

Introduo a cocos Gram-positivos

A partir da caracterizao da amostra como CG+ atravs da colorao de Gram, a determinao da famlia feita pela prova da catalase. A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactria em contato com o perxido de hidrognio, e pesquisar a formao de bolhas de oxignio.

catalase
2H2O2

2H2O + O2

Introduo a cocos Gram-positivos

+
Micrococcaceae
As bactrias desta famlia so catalase POSITIVAS

Streptococcaceae
As bactrias desta famlia so catalase NEGATIVAS

Caractersticas do Gnero Staphylococcus

Esta estrutura caracterstica lembra cachos de uva.

Caractersticas do Gnero Staphylococcus

As sp mais importantes na clnica S. lugundensis S. schleiferi S. sciuri S. lentus S. caseolyticus S. hyicus S. chromogenes S. carnosus S. simulans S. cohnii S. xylosus S. saprophyticus S. gallinarium S. kloosii S. equorum S. arlettae S. epidermidis

S. capitis
S. warnei S.saccharolyt. S. caprae S. hominis S. haemolyticus

S. intermedius
S. delphini

S. auricularis
S. aureus

Caractersticas do Gnero Staphylococcus

As mais importantes no laboratrio clnico so: S. lugundensis S. schleiferi S. sciuri S. lentus S. caseolyticus S. hyicus S. carnosus S. simulans S. cohnii S. xylosus S. saprophyticus S. gallinarium S. epidermidis S. capitis

S. warnei
S.saccharolyt. S. caprae S. hominis

S. chromogenes
S. intermedius

S. kloosii
S. equorum

S. haemolyticus
S. auricularis

S. delphini

S. arlettae

S. aureus

Staphylococcus aureus

De todas as espcies do gnero, o S. aureus o mais importante. responsvel pelo segundo maior nmero de infeces em seres humanos.
O S.aureus est presente no trato respiratrio superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da populao em geral, e assim permanece sem causar doena em condies normais.

Caractersticas do Gnero Staphylococcus

O gnero Staphylococcus composto por vrias espcies: S. lugundensis S. schleiferi S. sciuri S. lentus S. caseolyticus S. hyicus S. chromogenes S. intermedius S. delphini S. carnosus S. simulans S. cohnii S. xylosus S. saprophyticus S. gallinarium S. kloosii S. equorum S. arlettae S. epidermidis S. capitis S. warnei S.saccharolyt. S. caprae S. hominis S. haemolyticus S. auricularis S. aureus

Staphylococcus aureus

O nome aureus significa dourado em latim, qualidade atribuda ao pigmento amarelado caracterstico produzido pela bactria.

Enzimas Extracelulares

A enzima extracelular mais importante a coagulase. A produo de coagulase exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critrio para a identificao de uma amostra como pertencente espcie. coagulase

Fibrinognio
protrombina

Fibrina

Estafilotrombina Causa coagulao

Fatores de Virulncia do Staphylos

Staphylos no o nico que produz coagulase

Staphylococcus aureus

No laboratrio clnico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A bactria em questo inoculada num tubo com plasma de coelho. Se o plasma coagular, a espcie S. aureus.

Se no coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente

Staphylococcus aureus

Protena A (SpA) Tem a habilidade de se ligar poro FC de IgG, impedindo, portanto que ela sirva de fator de opsonizao na fagocitose. F
ab

Fab

IgG
S. aureus

Fc

SpA (Atn)

Testes de aglutinao rpida para coagulase

Testa a presena de proteina A e fator de coagulao (clamping factor) Fornece resultado + em 5 a 20 seg. Mostra correlao de 80% com mt.classico preo e mbalagem com 150un. U$116.00

Teste de aglutinao do latex azul para deteco do clumping factor e protein A associado Staphylococcus aureus Resultado em 60 seg Sensibilidade/especificidade: 99/92% Inclui partcula de latex , carto p/teste, haste, e controles positivo e negativo Preo: embalagem de 105 um. U$ 105.62 Validade 18 meses

Padres de Hemlise

esverdeado

Regulao de Fatores de Virulncia

Os fatores de virulncia produzidos por S. aureus no so expressados a toda hora, so dependentes da fase de crescimento da bactria.
no de clulas Protena A adesinas coagulase hemolisinas Toxinas Alimento em abundncia alimento Taxa estacionria

Protena A adesinas coagulase hemolisinas toxinas

tempo

Staphylococcus epidermidis

A segunda espcie mais importante do gnero Staphylococcus o Staphylococcus epidermidis. O Staphylococcus epidermidis faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores.

Importante na infeco hospitalar

Staphylococcus epidermidis

O Staphylococcus epidermidis uma espcie bem menos virulenta do que S. aureus. No apresentam a produo de coagulase e algumas cepas apresentam a produo muito tmida de certas enzimas proteolticas. Todavia, isto no significa que S. epidermidis no possa ser patognico. Esta espcie tem muitos fatores de adeso e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plstico (cateter, prteses, stents, etc.).

Staphylococcus epidermidis

O Staphylococcus epidermidis um risco para pacientes imunocomprometidos e para usurios de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infeces generalizadas no-piognicas. Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infeces em locais com prtese.

Outras espcies de Staphylococcus

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade novobiocina.

Outras espcies de Staphylococcus

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade novobiocina.

Identificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica

Gnero Staphylococcus Planococcus Micrococcus Enterococcus Streptococcus Aerococcus Stomatococcus *

Catal.

Motilidade NaCl 5%

Oxidase

Aerbio

Ttrade

Estrito + + + neg neg neg varivel neg + neg varivel neg neg neg + + + + varivel + neg neg neg + neg neg neg neg no + varivel no no no no no varivel varivel no no + varivel

* aderente ao meio

Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus

Coco GRAM +
Streptococcaceae

catalase + Micrococcaceae DNAse + Staphylococcus sp.

Sensvel novobiocina?

+ Staphylococcus no saprophyticus

Coagulase + Staphylococcus aureus

Staphylococcus grupo saprophyticus

Outras espcies de Staphylococcus

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua sensibilidade novobiocina.

Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus

Espcies de Staphylococcus do grupono saprophyticus (Grupo epidermidis)

S. epidermidis S. haemolyticus S. hominis S. capitis S. warneri

Espcies de Staphylococcus do grupo saprophyticus

S. saprophyticus S. cohnii S. xylosus

Staphylococcus saprophyticus

O Staphylococcus saprophyticus de interesse clnico pois frequentemente causa infeco do trato urinrio, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia.

As outras espcies de Staphylococcus de interesse clnico causam infeces parecidas com o S. epidermidis, e o tratamento igual. Logo, o mais importante discriminar o Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do Staphylococcus coagulase negativa.

Deteco de resistncia de Staphylococcus aureus oxacilina e ou vancomicina

Resistncia aos Antibiticos

A primeira vez que um antibitico foi usado, clinicamente, foi contra uma infeco por Staphylococcus aureus.

Sir Alexander Fleming

Resistncia aos Antibiticos

A penicilina funcionou bem contra infeces estafiloccicas at os anos 60, quando rapidamente comearam a surgir cepas resistentes penicilina.

Resistncia aos Antibiticos

Para contornar o problema, foi criado o beta-lactmico sinttico meticilina, que era resistente ao das betalactamases.

Anel b-lactmico

meticilina

Resistncia aos Antibiticos

A meticilina funcionou bem at os anos 70, quando comearam a surgir as cepas resistentes a meticilina (MRSA).

meticilina

Resistncia aos Antibiticos

Todo antibiticos beta-lactmico se liga a enzimas que participam da sntese da parede celular chamadas PBPs (Protenas Ligadoras de Penicilina). O MRSA desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP plenamente funcional mas no tem afinidade por beta-lactmicos.

penicilina

PBP2a
(PVN) ligadora de penicilina = enzima

Resistncia aos Antibiticos

Devido a este mecanismo de resistncia, as cepas MRSA/ORSA so resistentes no s penicilina, mas a todos os antibiticos betalactmicos! No laboratrio clnico, deve-se reportar num antibiograma resistncia a todos os beta lactmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas s vezes so suscetveis = ocorre apenas in vitro) quando a amostra for MRSA mesmo quando so sensveis a alguns beta lactmicos in vitro. A PBP2a codificada pelo gene mecA. Este gene carreado num elemento gentico mvel chamado de Cassete Cromossmico Estafiloccico mec (SCCmec).

Staphylococcus aureus resistente oxacilina-ORSA

CIM meticilina Modalidade Nivel de expresso mecA PBP2a bla Maioria 8 8 1,5-3 6-12 10-200 800 Subp-R 200 400 800 800 Freq de Subp-R

BorderlineBORSA MOD-SA Heterognea Heterognea Heterognea Homognea

Baixo Baxo Baixo Medio Alto Alto

+ + + +

PBP 1,3,4 + + + +

+++ + + + + +/-

107 10-5 103 1

b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulao resistente.

Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxaclina ( meticilina)

Para detectar a resistncia a oxacilina no laboratrio clnico, pode-se utilizar a tcnica de disco difuso em gar (Kirby-Bauer).

Tambm pode-se detectar cepas MRSA atravs de um gar screening de oxacilina que gar Mller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentrao de oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colnias indica resistncia a oxacilina. Para a determinao da concentrao inibitria mnima de oxacilina, o mtodo de macrodiluio em caldo deve ser feito com caldo Mller-Hinton com uma concentrao final de 4% de NaCl.

Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxacilina ( meticilina)

O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina uma alternativa vlida em casos de dvida, com uma eficcia diagnstica praticamente similar ao do mtodo de referncia de diluo em gar hiper salino, a concentrao crtica de 6 g/ml de oxacilina (NCCLS,1997). Sistemas automatizados de micro diluio nem sempre oferecem sensibilidade, especificidade e eficcia suficientes para a deteco deste tipo de cepas, quando comparado aos mtodos de referncia (Snchez, 1998), Um mtodo alternativo, rpido e eficaz, embora nem sempre aplicvel em rotina, a deteco do gene mecA, por mtodos de amplificao por PCR (Murakami et al., 1991). Este mtodo teria a vantagem de no estar sujeito s condies do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em grande nmero de isolados, empregado em casos de dvida com valores de CIM prximo do limite.

Resistncia Vancomicina

O mecanismo de resistncia vancomicina em Staphylococcus aureus ainda no foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes.
Em S. aureus, ocorrem fenmenos bizarros e pouco ortodoxos em relao resistncia vancomicina. Primeiramente, a morfologia das colnias de VRSA heterognea, dando a impresso de contaminao.

VSSA

VRSA

VRSA

VSSA

VRSA

VRSA

Resistncia aos Antibiticos

Em 1997, foi relatada no Japo, a primeira cepa clnica de Staphylococcus aureus resistente vancomicina (VRSA), pelo Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade Juntendo em Tquio.

Resistncia aos Antibiticos

Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcus aureus resistentes vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referncia de queimados. Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001. ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCIN Oliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm; Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu, Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhD Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui, and Hiramatsu)

Resistncia Vancomicina

Outro fenmeno comum oxacilina e a vancomincina a ocorrncia da resistncia heterognea (hetero-resistncia) de S. aureus a estes antibiticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de vancomicina (<4g/mL), ou a oxacilina (<2g/mL), sendo consideradas sensveis por mtodos tradicionais de avaliao sensibilidade. Todavia, no caso da vancomicina por ex. estas cepas podem conter subpopulaes de clulas que apresentam um MIC 8g/mL, numa freqncia de 1:106 clulas. Estas clulas no so detectadas por mtodos tradicionais (antibiograma e MIC).

A nica forma de se detectar uma cepa hetero-VRSA atravs de uma anlise de populaes, onde se inocula diferentes diluies de uma suspenso bacteriana em meio de cultura silido adicionado de concentraes crescentes de vancomicina.

Resistncia Vancomicina

Quando o resultado plotado num grfico obtm-se trs possibilidades distintas de curva:

VRSA

heteroVRSA

VSSA Sensvel Vancomicina

Resistncia Vancomicina

Observou-se tambm, por morfometria, que enquanto as cepas sensveis vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA e VSSA

Resistncia Vancomicina

Parece portanto, que a resistncia vancomicina est ligada a uma exacerbao da sntese da parede celular, em que inmeros genes regulatrios estariam envolvidos. At agora, todavia, ningum parece saber por certo quais genes esto envolvidos e at que ponto. Uma das grandes limitaes no estudo do mecanismo de resistncia vancomicina em S. aureus que a emergncia da resistncia um fenmeno ainda raro. Existem ainda poucas cepas no Mundo atualmente

Deteco da VISA/VRSA

Deteco de VISA/VRSA
Screening CIM Vancomicina
2 g/mL 4-16 g/mL

Difuso com disco + placa de BHI com vancomicina 6 g/mL

32 g/mL 14 mm, e/ou cresce > 14 mm, e no cresce

Relatar como VSSA

Possvel VISA

Possvel VRSA

Possvel VISA/VRSA

Relatar como VSSA

Checar Pureza da cepa e revisar resultados Notificar o mdico e CCIH sobre possvel identificao de VISA/VRSA, aguardar repetio dos testes

Deteco da VISA/VRSA

Deteco de VISA/VRSA
Confirmao CIM Vancomicina
2 g/mL 4-16 g/mL

Pelo laboratrio de referncia

placa com vancomicina (BHI + vancomicina 6 g/mL

32 g/mL

cresce Relatrio Presuntivo VISA/VRSA

No cresce Relatar como VSSA

Relatar como VSSA

Relatrio Presuntivo VISA

Relatrio Presuntivo VRSA

Salvar o isolado Notificar o mdico e CCIH sobre o resultado presuntivo de VISA/VRSA e enviar a cepa para Laboratrio de Referncia

Resistncia a Macroldeos

Os macroldeos so antibiticos de primeira escolha s para Streptococcus pneumoniae, dentre os Gram positivos. Os macroldeos utilizados na clnica so: Eritromicina Claritromicina Azitromicina nico macroldeo disponvel por 40 anos!!

O lanamento dos novos macroldeos recentemente aumentou o uso destas drogas.

Resistncia a Macroldeos

Os macroldeos so inibidores da sntese protica bacteriana. Os ribossomos bacterianos tm duas subunidades: 30S e 50S.

Resistncia a Macroldeos

aa

Os macroldeos tm afinidade pela subunidade 50S do mRNA ribossoma bacteriano.

tRNA ribossoma

Os macroldeos interferem na sntese de protenas por bloquear o stio ativo do ribossoma por impedimento estrico.

Resistncia a Macroldeos

A resistncia aos macroldeos ocorreu pela primeira vez, em 1953. A bactria metilava o rRNA que perdia afinidade aos macroldeos. A metilao feita por uma adenina N6-metiltransferase, cujo gene denominado erm [Erythomycin Ribosome Methilation]. Os genes erm geralmente esto localizados em elementos genticos mveis, tal como transposons, geralmente inseridos no cromossoma. Alguns destes transposons residem em plasmdios.

Os genes erm muitas vezes esto associados presena de genes que conferem resistncia tetraciclina (genes tet).

Resistncia a Macroldeos

As lincosamidas (clindamicina) e as estreptograminas tm o mesmo alvo (50S rRNA) que modificado pelos genes erm.

Estes antibiticos so denominados como pertencentes ao grupo MLS

Resistncia a Macroldeos

Os genes erm conferem resistncia tanto eritromicina quanto clindamicina. Mas a resistncia clindamicina s detectada in vitro com a induo por eritromicina. Eritromicina
(bom indutor)

Clindamicina (mal indutor)

ermAchatamento do Halo

erm+

Relao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

Para Staphylococcus aureus e coagulase negativos oxacilina resistentes, no testar cefalosporinas, penicilinas de amplo espectro ou Imipenem, pois falso resultados sensveis podem ocorrer. S. saprophyticus mantem boa sensibilidade e no precisam ser testados pois dificilmente apresentam resistncia SMXTMP, quinolonas e nitrofurantona, (drogas de escolha). Staphylococcus aureus ou coagulase negativos sensveis penicilina so sensveis a todos os beta-lactmicos. Testar pelo disco de penicilina e no de ampicilina. Se produtoras de beta-lactamase pelo testes acidimtrico, iodomtrico ou da cefalosporina cromognica(nitrocefin) considerar resistente a ampicilina e penicilina. Staphylococcus resistente a penicilina produtor de penicilinase e resistente a todas as penicilinas: ampicilina, amoxicilina, piperacilina e ticarcilina. A associao de penicilinas com inibidores: sulbactam, clavulanato e tazobactam s tero atividade para os estafilococos oxacilina-sensveis.

Relao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

Staphylococcus aureus e outros coagulase negativos quando resistentes oxacilina considerar como resistentes a :Penicilinas (penicilina, ampicilina com e sem inibidor de beta-lactamase[sulbactam], amoxicilina com e sem inibidor [clavulanato], piperacilina com e sem inibidor, Ticarcilina com e sem inibidor), cefalosporinas de 1a, 2a, 3a, 4 , Aztreonam( droga sem atividade contra Gram positivos), e Carbapenens(Imipenem, Meropenem e ertapenem) Staphylococcus spp com teste para gene mecA+= oxacilina R (existem testes de aglutinao especficos para detectar este gene. Staphylococcus spp podem desenvolver resistncia durante a terapia com quinolonas, por isso amostras diferentes devem ser sempre testadas e no repetir o antibiograma anterior. Todo Staphylococcus aureus com halo para vancomicina 14mm deve-se testar a CIM e aqueles com CIM4g enviar a Laboratrio de referncia.

Prevalncia de resistncia

Prevalncia de resistncia