Alumnos: Rolando Alberto Rodrguez Fonseca Paula Vernica Hernndez Cedillo

Yuliana Silva Romero

La cromatografa en frio es un tipo de cromatografa donde la solucin a separar se transforma en aerosol y las gotitas del aerosol se congelan y posteriormente descongelan.

Para congelar la muestra se utiliza un sistema de inyeccin (jeringa) que transforma la muestra en aerosol, este inyector se conecta al rotor con forma de tapa, o bien el matraz con la solucin se conecta a un sistema de aerosolizacin.

Las gotitas de aerosol se congelan rpidamente en el nitrgeno liquido sometido a centrifugacin, al ocurrir esto las gotitas adquieren mayor tamao y peso por lo tanto su coeficiente de sedimentacin se incrementa y la separacin que por centrifugacin es mas rpida, El rotor perforado que sostiene la copa con nitrgeno liquido descongelar posteriormente las gotas de muestra.

La centrifugadora a utilizar posee un rotor perforado y otros dos rotores mas, el segundo rotor es una copa donde se coloca nitrgeno lquido, el ultimo rotor es una tapa del rotor copa donde esta el nitrgeno lquido, este rotor semejante a una tapa tiene un tubo por el cual se conduce la muestra.

Rotor Fsi (gotas congeladas)

Vertido del nitrogeno liquido

Suspensin por spooning

Evaporacin del refrigerante

Despues se utilizaron 3 procedimientos:

Vaso de precipitado

Solucin fosfato de potasio

Tasa de aislamiento

Con poco nitrogeno liquido se aade diluyente y se agita

Agitacin de helice a 2000 rpm

Se deja en el rotor de plastico

Tiempo hasta que derrita

FORMACIN DE GOTITAS Y FREEZING Materiales: Agua destilada, angre y levadura AGUA DESTILADA Seinyect en un rotor, se refrigeraron en un placa de petri mediante la utilizacin de refrigerante. Despues,se observa bajo un microscopio de baja potencia. Las gotas se fotografiaron cuando el lquido refrigerante se haba evaporado.

SANGRE la sangre de rata se trat con unanticoagulante quelante, se inyect al rotor para evaluar el proceso de congelacin. Las muestras se sembraron directamente desde el medio de descongelacin, o cuando las altas tasas de supervivencia se prev, a partir de 1000 diluciones. Debido a que el nmero total de clulas se recuper despus de la congelacin y descongelacin la determinacin del porcentaje de supervivencia requiere algunas modificaciones. El nmero total de clulas en alcuotas de la suspensin descongelada y en los controles no congeladas se determin el numero de celulas viables en placas de agar.

Las fotografas de las gotitas obtenida cuando el agua se inyect en el nitrogeno lquido:

Rotor estacionario: las partculas varian de 0,1 a 10 mm las gotitas ms pequeas eran esfricas, las gotas ms grandes tenan una forma irregular. Rotor conducido a velocidades cada vez mayores: se produjeron las partculas esfricas ya que estas eran mas pequeas.

La figura muestra una fotografa de sangre, ilustra que la tcnica de inyeccin produjo un espectro de tamaosde partculas congeladas.

En contacto con la superficie del nitrgeno lquido en un rotor , se rompen gotita grandes en gotitas mas pequeas, que se mantienen hasta que la tensin superficial del fluido produce una forma esfrica. Las partculas son atrapadas en el refrigerante y pasan a la pared del rotor. Debido a la inercia inicial de una partcula y la velocidad que alcanza en el campo centrfugo, la partcula deja un rastro de nitrgeno lquido sobrecalentado a su paso, que se vaporiza despus de que la partcula ha pasado. La transferencia de calor es probablemente rpida, ya que la ausencia de aglutinacin indica la esfericidad relativa de las gotitas congeladas que estn suficientemente solidificado para evitar la distorsin cuando se pone en contacto con la pared del rotor despus del paso por 1,2 cm de nitrgenolquido.

La evaluacin preliminar de la centrfuga de congelacin en lo que respecta a la celda de la supervivencia ha supuesto tres parmetros diferentes: tamao de gota la velocidad del rotor la tasa de recalentamiento de las suspensiones congeladas

El modo de pulverizacin de inyeccin de la muestra congelada se obtuvieron gotitas pequeas y de tamao uniforme La jeringa inyeccin dio un espectro de tamaos de partculas en cada velocidad del rotor La constante de valores ms altos de supervivencia obtenidos a partir del modo de pulverizacin

supervivencia de las clulas congeladas centrfugamente inyecta o pulveriza en F-I-f rotor a velocidades diferentes

tabla 1. efectos del calentamiento y el modo de introduccin de la muestra sobre la supervivencia de la levadura por centrifugacin congelados
serie experimental rotor muestra el modo de introduccin tasa de calentamiento en relacin lento porcentaje de supervivencia*

los efectos del calentamiento tasa

F-I-f

inyectado desde jeringa

0.002

F-Il-f

"

F-III-t

diluyente rpido, vertiendo Rpido, centrfuga Agitacin rpida,

10. 5

6. 8

efectos de introduccin de muestras

F-I-f

5.09t

rociado

16.32t

*corregido para la viabilidad de los controles t promedio de 8 experimentos

la supervivencia de las clulas aumentado con velocidad creciente del rotor las muestras inyectadas a partir de una jeringa, la tasa de supervivencia se elev a un mximo a 3000 rpm y disminuido. Aunque las diferencias eran pequeas, los resultados fueron consistentes dentro de experimentos. Con muestras pulverizadas en el refrigerante, la tasa de supervivencia aument en todo el rango de velocidad del rotor.

Mazur mostr que en las clulas de levadura de refrigeracin de alta tasas de congelar los internos Con los procedimientos de entrega ptimos y velocidad del rotor, la centrfuga de congelacin rpida tcnica de calentamiento producido supervivencias del 33,8 por ciento Doebbler y Rinfret obtuvieron supervivencias de 42 por ciento por pulverizacin suspensiones de levadura en una superficie mvil de nitrgeno lquido

Moor y Mhlethaler report supervivencias de 30 por ciento cuando un 0,2 mm3 gota en un disco de cobre que se sumerge en el lquido propano a -190 C Aunque Rinfret ha calculado que el borde y el centro de una de 1 mm gotita de agua introducida en nitrgeno lquido se enfre a 60 y 300 C por segundo, respectivamente, de 0 a -60 C

Los supervivientes con la tcnica de congelacin centrfuga no fueron superiores a los reportados en otros procedimientos publicados para una congelacin rpida. Este podra significar que, contrariamente a nuestras expectativas, la centrfuga de congelacin hizo no producir una mayor velocidad de enfriamiento. O podra significar que no haya ms del 40 al 50 por ciento de las clulas de levadura se sobrevivir sin importar cmo rpidamente se enfri.

Moor y Mhlethaler inform que el 100 por ciento de la levadura sobrevivi enfriamiento en helio II lquido a un costo estimado (pero no medida) enfriamiento velocidad de 104 C por segundo El presente experimentos, parece que hay un aumento progresivo lento en la supervivencia con aumentando la velocidad del rotor.

Sugiere que la congelacin centrfuga puede ser una herramienta valiosa, especialmente cuando grandes cantidades de material congela rpidamente se requieren. Los datos tambin indicaron algunas vas para mejorar los porcentajes de supervivencia.

Formar y entregar gotitas pequeas, de tamao uniforme, los mtodos para aumentar la velocidad de la superficie del nitrgeno lquido atencin a la cuestin de logrando an ms altos y reproducible ms las tasas de calentamiento (por ejemplo, centrfuga calentamiento) determinar la aplicabilidad de congelacin centrfuga a las clulas excepto los de la levadura, a las partculas subcelulares y virus, otros tcnicas tales como la preparacin de materiales para microscopa electrnica.