Mtodos Cromatogrficos

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/chromintro.html http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/

http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/LC/

Cromatografia
Definio

Histrico Michael Tseewt - botnico russo 1906 Dcada de 30 Dcada de 40 - pratos tericos/impulso CG Dcada de 60 CLAE
Parmetros em cromatografia:

Tempo de reteno (distncia, volume, tempo de reteno corrigido) Resoluo Pratos tericos Altura equivalente a um prato terico (HETP)

Cromatografia: Classificao
1. Forma fsica do suporte
Cromatografia planar: CP e CCD Cromatografia em coluna CG e CL -dimetro interno do tubo(preparativa/ analtica) -estado fsico da F.M.(gas/lquido/supercrtico) -tipo de coluna (aberta/fechada) -fase estacionria (lquido/slido) 2.Mecanismo de separao (processos fsico-qumicos ou mecnico) 3.Polaridade das fases utilizadas

Mecanismos de separao

http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm

Polaridade da fase estacionria:

Fase normal - Fase estacionria polar Fase reversa - Fase estacionria apolar

Cromatografia em papel
Compostos hidrossolveis, cidos orgnicos e ions metlicos Princpio: partio (solubilidade) Quantidade de amostra necessria 10-3 a 10-6 g Tipos: ascendente, descendente, bidimensional, circular F.M. - Sistema de solventes F.E. - gua retida na celulose (papel Whatman) Mtodos de deteco: fsico-qumicos

Anlise qualitativa: Rf (fator de reteno) - problema : reprodutibilidade Anlise quantitativa: densitmetro, extrao dos solutos

Cromatografia em Camada Delgada

Mtodo rpido (20-40 min.) Uso de diversos agentes cromognicos Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g) Grande gama de compostos pode ser analisada Mtodo simples e barato F.M. - sistema de solventes F.E - Adsorventes (slica, alumna, celite, amido) Mtodos de deteco: fsico-qumicos Princpio: Adsoro (polaridade)

Adsoro depende: natureza qumica do adsorvente rea de superfcie/ tamanho da partcula porosidade da partcula -atividade --> stios ativos

Tipos de adsorventes:
G- aglutinantes (gesso amido ou talco) H- sem aglutinante (p/ CL) P-camada preparativa F- contm fluorescncia

R- adsorvente sem aditivo

Critrios para escolha da fase mvel:

analitos devem ser solveis diferentemente

no deve haver reao entre analitos/FM e FM/FE

CCD - exemplos

Requerimento da amostra::
detectvel no cromatograma solvel na FM estvel luz, oxignio, solvente, no ser voltil

Comparao
CP Vantagens: tcnica simples no requer instrumentao sofisticada baixo custo Desvantagens: uso limitado alargamento de banda-difusopouca alternativa de reveladores CCD Vantagens: maior sensibilidade mais rpido > repetibilidade < difuso > faixa de aplicao reveladores reativos permite aquecimento Desvantagens degradao de compostoslbeis devido grande superfciede exposio dificuldades na quantificao

Cromatografia Gasosa
Rapidez
Alto poder de separao Separao de vrias classes de compostos em uma anlise Sensibilidade (ppm - ppb) Facilidade de registrar dados Variedade de detetor (especificidade) Amostras volteis Compostos termicamente estveis Tcnicas auxiliares p/ identificao

Cromatografia Gasosa: aplicaes Anlise de cidos graxos e triglicerdeos Anlise de micotoxinas Anlise de compostos volteis responsveis pelo aroma caracterstico de alimentos Anlise de aucares Anlise de amino cidos Anlise de pesticidas Anlise de frmacos etc etc

Cromatografia Gasosa : tipos

Cromatografia Gs-Slido FE: slidos (slica, carvo grafitinizado, polmeros porosos) Princpio de reteno:(adsoro, volatilidade) Cromatografia Gs-Lquido *** Lquido mantido estacionrio em suporte inerte Princpio de reteno: solubilidade, volatilidade

Cromatografia Gasosa: Instrumentao

Gs de arraste (FM) H2, N2, He, Ar Funo: transporte da amostra Propriedades: inerte, compatvel com o detetor, puro

Cromatografia Gasosa: Instrumentao Injetor

Colunas empacotadas cmara de aquecimento Colunas capilares:
split splitless on- collum Cuidados: Introduzir qtddes reprodutveis de amostra Vaporizar totalmente a amostra sem decomp-la No discriminar compostos

Cromatografia gasosa: Instrumentao Colunas - tipos

Parmetro Compri/o (m) Pratos tericos

Coluna empacotada 1-4 1-3 2400 5

Coluna capilar 0,15 - 0,75 10 -100 3000 0,5 - 2

Diam. Int. (mm)

Espessura F.E.(m)

Vazo gs (ml/min)
Vol. amostra (l)

20 - 60
02 - 20

1- 5
0,001- 0,5

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Cromatografia gasosa: Instrumentao Colunas - fase estacionria (FE)

Apolar: hidrocarbonetos no aromticos, silicones (ex.: SE-30) P.E. Polar: contm grande quantidade de grupos polares (Ex.: Carbowax)- interaes tipo pontes de hidrognio Intermediria: grupos polares ou potencialmente polares em esqueleto apolar (Ex. SE-52) Escolha da coluna: Polaridade da fase estacionria, dimetro e espessura do filme quantidade de amostras, tempo de anlise, presso (velocidade da FM), temperatura do forno Comprimento pratos tericos

Cromatografia gasosa: Instrumentao Colunas - fase estacionria (FE) Abreviao de algumas fases estacionrias DEGA - adipato de dietileno glicol DEGS - succinato de dietileno glicol SE-30 - metil silicone OV -11 - 35% fenil- metilsilicone

Carbowax 20 M - polietilnoglicol

Programao de temperatura

Cromatografia gasosa: Instrumentao Detetor - requisitos

Alta sensibilidade
Baixo nvel de rudo Faixa linear ampla p/ a resposta Resposta p/ os compostos de interesse (universais, seletivos, especficos) Insensvel a pequenas mudanas de fluxo e temperatura Destrutivos/ no destrutivos

Cromatografia gasosa: Instrumentao Detetor -Tipos

Ionizao de chamas FID (alta sensibilidade, resposta quase universal) FM = hidrognio ou nitrognio, destrutivo

Condutividade trmica (resposta universal, no destri a amostra) - FM = helio ou hidrognio,no destrutivo

Captura de eltrons (seletivo p/ halognios orgnicos, nitrilas, nitratos e organometlicos) FM = nitrognio, no destrutivo Terminico (seletivo p/ compostos contendo N e P)

Formao de ons pela combusto da amostra na presena de H2 e O2. Origina corrente eltrica no coletor gerando um sinal do qual a combusto do gs de arraste descontada

O bombardeamento do gs de arraste com as particulas B geram eltrons lentos que migram para o nodo gerando corrente constante que ser registrada como linha de base. Qdo a substncia que entra no detector capaz de capturar eltrons, h diminuio da corrente gerando um sinal negativo proporcional concentrao do composto.

Cromatografia gasosa: Anlise qualitativa

Tempo de reteno Tempo de reteno relativo Co-cromatografia com padres (spiking) Grficos p/ sries homlogas ndices de reteno (Kovats, ECL) Tcnicas auxiliares (EM, IR, RMN)

Tr= tempo de reteno Tm = tempo morto- tempo que a FM leva para percorrer a coluna Tr = tempo de reteno corrigido = Tr-Tm

Cromatografia gasosa:Anlise quantitativa

Relao concentrao x rea do pico

Normalizao Padro interno

Padro externo
Fator de resposta

Normalizao: Todo componente produz um pico (f) A resposta do detector dependente apenas da concentrao (f)

Calibrao externa
Soluo contendo padres de todas as substncias a serem analisadas Padres em concentraes prximas amostra Condies analticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeo

Fator de resposta do detector: determina a real resposta para uma determinada classe de substncias Fator de resposta= concentrao/rea

Para um padro contendo a mesma concentrao de trs substncias diferentes com reas A1, A2 e A3

Se assumirmos um fator como 1,00 por ex. f3 =1,00

Ento, para uma amostra com estas trs substncias, a concentrao de cada uma calculada utilizando estes fatores:

Exemplo .Uma amostra contm X, Y e Z.

O padro contm 200 mg de cada em 100mL de solvente. A injeo de 5uL resulta em:

Z a referncia
Fx =1190/238 = 5,8 Fy = 1190/660 = 1,8

II. A anlise daa mostraproblema resulta em:

Multiplica-se cada pico por seu fator: X= 90 x 5,8 Y = 265 x 1,8 e Z = 460 x 1

rea total = 450 + 477 + 460 = 1387 Depois calcula-se a % de rea

Z deve estar presente em todas as amostras

Esse mtodo corrige a diferena de volume a cada injeo

Padronizao interna Uma substncia conhecida adicionada em concentrao definida em todos os padres e nas amostras; No co-elui com a amostra estvel e detectado na concentrao em que se encontra

Etapas: Faz-se uma curva de calibrao baseada na relao entre as reas e concentraes do PI e da substncia de interesse Contamina-se a amostra com um volume conhecido da soluo estoque do padro interno (PI)

Cromatografia Lquida em coluna aberta

Adsoro:
Alumina, Silica, magnso, carbonato de clcio, amido
Natureza da amostra x Comportamento cromatogrfico

1.saturados x insaturados 2.grupos funcionais

> reteno insaturados

COOH > -OH > -NH3 > -SH > -CHO > C=O > CO2R > OCH3 > CH=CH e 3. Impedimento estrico

Atividade: I, II ...V ( % de gua adicionada

0----15%)

Cromatografia Liquida de Alta Eficincia (HPLC)

Solvente: Alto grau de pureza, filtrado e degaseificado, caros

Sistemas de injeo:vlvulas de volumes definidos

Colunas de guarda
Colunas: recheios materiais porosos com partculas de dimetros o mais homogneo possvel e de dimetro igual ou menor a 10 um (em geral) Silica e Alumina. Colunas com fase ligada silica como suporte A) formao do ster silicato (Si-O-R) B)formao da ligao siloxano (Si-O-SiR) C)Ligao Si-C

At 60.000 pratos tericos

Detector: Alta sensibilidade Resposta rpida para todos os compostos da amostra Insensvel mudanas na Fase mvel

Insensvel mudanas de temperatura

Resposta independente para a fase mvel Resposta linear No deve destruir a amostra Fcil operao Fornecer informaes qualitativas

Detector Uv-Vis Detector de Fluorescncia Detector de arranjo de diodos Detector de ndice de Refrao

Detectores eletroqumicos
Quantificao: Calibrao Externa Calibrao Interna