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METABOLISMO DO NITROGNIO

INTRODUO
Nutrio mineral: soluo do solo. macronutrientes : N , P, K, Ca, Mg, S. micronutrientes : B, Cl, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo, (Co). O N de grande importncia para as plantas: AA, Protenas, Enzimas, cs.Nuclicos (RNA, DNA), Clorofilas etc... Fonte de N: 1. Ar (solo): N2 (plantas fixadoras) 2. soluo do solo: NO3- e NH4+

O CICLO DO NITROGNIO
Fixao No Simbitica Desnitrificao Fixao Biolgica ou Simbitica

N2

N2, NO2,N2O

N2

Uredeos
Bactrias Rhizobium

SOLO

Amonificao
Oxidao Nitrosomonas Oxidao Nitrobacter

Absoro NO3-

NH3/NH4+

NO2-

Lixiviao
Lenol Fretico

Nitrificao

Amonificao: Liberao de NH4+ para o meio ambiente. Nitrificao: formao de NO3- por ao de bactrias. NH3 + 3 O2 NO2- + 2 H+ + 2 H2O 2 2
NITROSSOMONAS

NO2- + O2 2
NITROBACTER

NO32

ABSORO DE NITRATO
Existe um sistema de EFLUXO e INFLUXO.

Em cevada o sistema de influxo de 13NO3- apresenta modelo tpico da cintica de Michaelis-Menten.

O influxo depende do nvel de nitrato (tratamento prvio) e o sistema de transporte de nitrato induzido por nitrato e do TIPO COTRANSPORTE ANTIPORT NO3-/ H+

REDUO DO NITRATO
O nitrato reduzido a amnia/amnio (NH3/NH4+) por dois processos catalticos: A) REDUTASE DO NITRATO. B) REDUTASE DO NITRITO. Esta reduo pode ocorrer na raiz e/ou folha, dependendo da espcie, idade e suprimento de NO3-.

NO CITOSOL
RN NO3- + 2 H+ + 2 eNO2- + H2O.

NO CLOROPLASTO OU PLASTDEO
RNi NO2- + 8 H+ + 6 eNH4+ + 2 H2O

REDUTASE DO NITRATO (RN)


dependente de NADH formada de duas sub-unidades de 110-115 KDa de massa molecular, com grupo prosttico FAD, Heme(Fe), citocromo b557 e cofator Mo. Os eltrons passam: NADH FAD CIT b557 MoCo NO3A enzima pode conter reaes parciais: reduo do CIT, cujo papel fisiolgico no claro.

A localizao: no CITOSOL e pode estar prxima a membrana do cloroplasto durante o tempo de reduo (facilita o rpido transporte de NO2- para dentro do cloroplasto, pois um composto altamente txico).

LANADEIRAS FORMAO DO NADH


MITOCONDRIAL

CLOROPLASTIDIAL

REDUTASE DO NITRITO (RNi)


uma enzima dependente de FERREDOXINA (FD). formada de uma sub-unidade de 60-64 KDa de massa molecular e contm siro-heme como grupo prosttico (4Fe-4S) no seu stio ativo. Localizao: cloroplastos

ASSIMILAO DA AMNIA
GLUTAMINA SINTETASE (GS) Enzima responsvel pela assimilao do NH4+(NH3), o qual incorporado na forma orgnica pela aminao do 2-oxoglutarado catalisado pela glutamato desidrogenase e/ou pela produo do 2-oxoglutarato do ciclo de Krebs. A catlise da GS dependente de ATP para converter Glu em Gln (Km 3-5 M) e est presente em todos os tecidos das plantas.

Porta de entrada da amnia para a formao dos aminocidos em plantas superiores. uma protena octamrica com massa molecular de 350-400 KDa, com 12 sub-unidade. Nveis altos de GS tm sido isolados de ndulos de leguminosas que fixam nitrognio (feijo isoenzimas GSn1 e GSn2) Localizao: CITOSOL (GS1) e CLOROPASTOS (GS2) ou PLASTDIOS.

ATP Mg+2

ADP + Pi

GLUTAMATO + NH3

GLUTAMINA

GLUTAMATO SINTASE (GOGAT)


a enzima responsvel pela transferncia do grupo amida da Gln para o 2-Oxoglutarato para produzir 2 molculas de glutamato (Glu). Duas diferentes formas de GOGAT esto presentes em plantas superiores Utiliza a Ferredoxina reduzida (FD) como fonte de poder redutor (FD dependente) 1. - Est presente em altas concentraes nas folhas e est localizada nos cloroplastos

Utiliza o NADH (NADH dependente)


1. Est presente em baixas concentraes nas folhas, mas
tem um grande papel na fixao do N2 pelos ndulos (apresenta massa molecular de 200 KDa ) 2. Est localizada nos plastdios de ndulos de Phaseolus
NH2 NH2 2H

GLUTAMINA + 2-Oxoglutarato
Glu-sintase(GOGAT) NH2

2 Glu

AMINOTRANSFERASES OU TRANSAMINASES
Aspartato amino transferase
Glu + Oxaloacetato 2-Oxoglutarato + Aspartato

Alanina amino transferase


Glu + piruvato 2-Oxoglutarato + alanina

Obs. 1. Os dois oxoglutaratos formados por essas vias podem retornar ao ciclo GS/GOGAT. 2. As aminotransferases tm sido detectadas em plantas que podem sintetizar todos os aminocidos (exceto prolina). 3.Desse modo, o NITROGNIO pode ser facilmente distribudo a partir do Glutamato, via Aspartato e Alanina, para todos os aminocidos. 4. A aspartato aminotransferase pode estar envolvida no transporte do poder redutor (NADH, NADPH) da mitocndria e cloroplasto para dentro do citosol, os NADH produzidos sero utilizados na reduo do nitrato ou na reduo do hidroxipiruvato no peroxisomo.

PROLINA (Pro)
A prolina sintetizada da seguinte forma:
ATP
Mg+2 Glu NADPH + H+ Glutamil semialdedo NADP+

ADP + Pi
ciclado Pirrolina
5- Carboxilato

PROLINA
NADPH + H+

P5CR
NADP+

A enzimiologia das reaes no est bem esclarecida em plantas superiores, somente a ltima enzima do passo metablico est bem caracterizada e localizada no cloroplasto: - Pirrolina 5- carboxilato redutase. H evidncias de que a ORNITINA via ou Pirrolina 5- carboxilato ou - Pirrolina 2carboxilato pode tambm agir como precursor da PROLINA. A rota sob condies normais no est bem esclarecida.

AcG
GLUTAMATO
P5CS

ORNITINA
OAT

GSA

P5C
P5CR

PROLINA

P5CS = - Pirrolina 5- carboxilato sintase P5CR = - Pirrolina 5- carboxilato redutase OAT = Ornitina aminotransferase o principal aminocido componente particularmente nas sementes de cereais. de protenas,

A prolina pode tambm agir como protetor osmtico (ajustamento osmtico) nas plantas sujeitas ao dficit hdrico ou salino (aumento na sntese, possivelmente atravs da induo da - Pirrolina 5carboxilato redutase e/ou pelo decrscimo na taxa de oxidao mitocondrial da prolina).

% PROLINA - FOLHAS
12

% PROLINA - RAIZ
% de Prolina do total a.a livres
40 35 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5

% Prolina do total de a.a livres

0 0 1 2 3 4 5 6

DIAS DE ESTRESSE

ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE DE NITROGNIO


H ocasies em que as plantas necessitam transportar o nitrognio de um rgo para outro: Ndulos para as folhas e fruto. De folhas velhas para folhas jovens e frutos. De cotiltones de sementes em germinao para as partes areas em expanso e ponta da raiz.

A Asparagina universalmente usada pelas plantas superiores como um componente de armazenamento e transporte. O N-amida derivado diretamente do grupo amida da glutamina, sintetizada pela enzima asparagina sintetase. uma reao dependente de glutamina e ATP.
NH2

ATP

AMP + Ppi

NH2

Gln

+ Aspartato-NH2

Glu-NH2 + Asn-NH2
Asparagina Sintetase

NH2

Os cotildones de sementes em germinao so as principais fontes de asparagina sintetase. Essa enzima requer Cl- para a atividade e inibida na presena de Ca+2.

FORMAO DA AMNIA DURANTE O METABOLISMO DAS


PLANTAS
A amnia formada durante vrios processos: 1. Assimilao Inicial: produto da reduo do nitrato e
fixao de N2. 2. Fotorrespirao: alta taxa liberada na converso de Gly Ser 3. Metabolismo dos componentes de Transporte: liberada durante a degradao da Asn, Arg e uredeos.

4. Reaes especficas dos aminocidos: liberada durante a converso da Phe cinamato (produo de lignina); Cistationina Homoserina (na sntese da metionina); Treonina 2-oxobutirato (na biossntese da Isoleucina) 5. Catabolismo de Protenas: as protenas so hidrolisadas durante a germinao das sementes e durante a senescncia de folhas. H evidncias de que a amnia formada pela ao da glutamato desidrogenase:

Glu + NAD+ + H2O 2-oxoglutarato+NH3 + NADH +H+ GDH

FOTOSSNTESE E O METABOLISMO DO NITROGNIO


O NADPH e o ATP so gerados pelos dois fotossistemas (FS-I e FS-II) e podem ser utilizados para a sntese de outros compostos nitrogenados, tais como AMINOCIDOS e LIPDIOS.

JUSTIFICATIVAS
1. 1. O NO2- pode ser reduzido numa reao dependente da luz nos cloroplastos para formar glutamina e glutamato. 2.RNi, GS, GOGAT esto localizadas nos cloroplastos. 3.O caminho da fotorrespirao envolve a sntese de glicina pela transaminao do glioxilato. A NH3 liberada pela reao da Gly Ser reassimilada nos cloroplastos.

4.Nas C4, o aspartato, a alanina e o glutamato esto envolvidos no transporte de metablitos entre clulas da bainha vascular e clulas do mesfilo. 5.A aminotransferase do aspartato: 2-oxoglutarato esto envolvidas em transferir o poder redutor (NADPH) gerado no cloroplasto. 6. Os cloroplastos tm a capacidade de converter o Aspartato Lisina, Treonina, Isoleucina e Homocistena em reaes dependentes de LUZ. O piruvato leucina, valina e isoleucina, na sintese de aminocidos aromticos.

7.Todas as enzimas ou a maior parte delas necessrias para a sntese dos aminocidos essenciais: Lisina, Treonina, Isoleucina, Homocistena, Leucina, Valina, Triptofano, Fenilalanina e Tirosina, localiza-se nos cloroplastos, como tambm da sintese de arginina e prolina. 8.Os cloroplastos tm a capacidade de reduzir sulfato de cistena, e as enzimas envolvidas nos passos metablicos esto localizadas nos cloroplastos. A reduo da gluationa, assim como os mecanismos de desintoxificao de superxidos so tambm dependentes da luz.

9.Uma grande quantidade de protenas(p.ex. subunidades de RUBISCO, ATP-Sintetases e certos citocromos) so codificados pelo DNA cloroplstico e, portanto, dependentes da luz. 10.Os cloroplastos tm capacidade de sintetizar cidos graxos, cidos nucleicos e clorofilas, utilizando NADPH e ATP produzidos diretamente dos dois fotossistemas. OBS. Em locais no verdes como as razes, os processos descritos podem ocorrer nos plastdios e a energia dependente dos acares produzidos nas folhas.

METABOLISMO DA FIXAO DO N2
FORMAO DOS NDULOS. 1 Crescimento dos plos radiculares. As razes exsudam compostos orgnicos, tais como, acares, aminocidos, etc. que iro atrair as bactrias rhizbia (Quimiotactismo), formando uma rhizosfera microbiana. 2 Os plos radiculares eliminam exsudados especficos (flavanides-antocianinas) para atrair as bactrias para as razes e induzir especificidade atravs do gene nod da bactria (nodulao).

3 A bactria Rhizbia atraca na superfcie do plo radicular (provavelmente pela protena especfica LECTINA-glicoprotena). 4 Em resposta ao sinal da Rhizbia, o plo radicular curva com a mesma grudada. 5 A bactria Rhizbia digere a parede celular e forma o CORDO DE INFECO (forma de tubo) para dentro do crtex da raiz, onde penetram e se multiplicam intensamente, ocorrendo tambm intensa diviso celular das clulas corticais que se exteriorizam, formando o NDULO

Incio da formao de ndulo radicular em uma planta leguminosa.

1. A regio da crtex da raiz, com intensa diviso celular, recebe o nome de ndulo primrio. 2. Ao chegar nas proximidades do ndulo primrio, o cordo de infeco se ramifica para invadir as clulas vegetais. 3. Pequenos grupos de bactrias, contidas no interior de vesculas membranosas, so liberados dentro do citoplasma das clulas vegetais do ndulo primrio. 4. O citoplasma da clula invadido conter vrios grupos de bactrias, individualizado por uma membrana derivada da membrana do cordo de infeco.

5. A partir desse incio de estabelecimento do ndulo radicular, as bactrias, que se encontram dentro das clulas radiculares hospedeiras, param de se multiplicar, aumentam de tamanho e sofrem vrias alteraes bioqumicas para se transformarem em bactrias especializadas na fixao de nitrognio, os bacteriides. 6. Para diferenciar as duas fases da vida desses microrganismos, convencionou-se que o nome bactria seria utilizado enquanto no ocorressem as transformaes bioqumicas que iniciam o processo de fixao de nitrognio. Portanto, quando os microrganismos passam a fixar nitrognio so chamados de bacteriides.

7. Os ndulos radiculares desenvolvidos possuem uma organizao prpria de tecidos. Eles apresentam um meristema responsvel pela formao das clulas da regio de invaso, uma regio central e conexes vasculares com o xilema do cilindro central da raiz. Envolvendo e delimitando toda essa estrutura est o parnquima do ndulo.

A NITROGENASE E A REAO DE FIXAO DE NITROGNIO


1. A reao de fixao do nitrognio caracteriza-se pela reduo do N2 NH3 (NH4+). A NITROGENASE E A REAO DE FIXAO DE NITROGNIO

N2
Nase

NH3 (NH4+)

2. Para que a reao ocorra, necessrio que haja um transporte de eltrons, mediado por molculas aptas a realiz-lo. 3. A enzima nitrogenase formada por duas unidades proticas, a Ferro-protena (Fe-protena) e a MolibdnioFerro-protena (MoFe-protena), ambas capazes de transportar eltrons. Durante a reao de reduo do N2, a nitrogenase auxiliada por uma terceira molcula transportadora de eltrons, a ferridoxina. 4. O modelo proposto para a evoluo da reao pode ser entendido do seguinte modo:

A ferridoxina, na sua forma reduzida, transfere um eltron para a unidade Fe-protena da nitrogenase. A Fe-protena, ento reduzida, doa o eltron recebido para a MoFe-protena. A MoFe-protena acumula os eltrons. Aps 8 transferncias, essa unidade ter acumulado 8 eltrons e, ento, far a reduo do N2 NH3. Para cada eltron transferido da Fe-protena para a MoFe-protena so consumidos 2 ATPs. Para reduzir uma molcula de N2 so necessrios 8 (oito) eltrons e, portanto, 16 ATPs.

A LEGHEMOGLOBINA
1. As clulas das razes da planta, bem como os prprios bacteriides, precisam de O2 para a respirao celular. Mas o oxignio (O2) altamente inibitrio para a atividade da Nitrogenase (Nase).

O QUE AS PLANTAS FAZEM????

2.As estratgias desenvolvidas para evitar o excesso de O2 nos ndulos radiculares, prevenindo contra a conseqente inibio da nitrogenase, foram duas: Estratgia anatmica: o parnquima do ndulo funciona como uma barreira de difuso do O2. Os espaos intercelulares so pequenos e pouco numerosos, podendo ser preenchidos com gua. Logo, a entrada de O2 no interior do ndulo muito dificultada. Estratgia bioqumica: as clulas vegetais da regio central do ndulo produzem a leghemoglobina (hemoglobina das leguminosas). Essa molcula um carregador de O2, que garante que os bacteriides recebam o O2 necessrio para sua respirao, evitando que o gs circule livremente no ndulo.

GENES ENVOLVIDOS NA FIXAO BIOLGICA DO NITROGNIO


1. NAS BACTRIAS: Famlia Rhizobiaceae. Genes nif, aparentemente esto envolvidos com a sntese da nitrogenase. Genes fix produzem as molculas que regulam o processo de fixao. Por exemplo, sabe-se que o gene fix X codifica a ferridoxina nessas bactrias.

2. FORMAO DOS NDULOS X BACTRIAS Famlia Rhizobiaceae. A Genes nod (nodulao) so encontrados na bactria, sendo responsveis pela produo da protena que recebe o sinal qumico da planta hospedeira (os flavonides-antocianinas) e pela produo das enzimas que sintetizam o fator de nodulao. B) Genes NOD so encontrados na planta leguminosa, sendo responsveis pela sntese de protenas denominadas nodulinas. As nodulinas (p. ex. a LEGHEMOGLOBINA) desempenham papel importante na formao e manuteno do ndulo radicular.

BIOQUMICA DA FIXAO

FORMAO DOS UREDEOS


1. So compostos resultantes da fixao do N2 e baseados na estrutura da uria. 2. Os principais compostos so: Alantonas, c. Alantico e a Citrulina, sendo que os dois primeiros correspondem a 50 90% do nitrognio orgnico encontrado no xilema de vrias leguminosas tropicais (soja, caupi, feijo). 3. H boas evidncias de que os uredeos so sintetizados como produtos da fixao do nitrognio nos ndulos das plantas leguminosas tropicais.

Exemplos: Em soja, aps 10 minutos de aplicao de 13N , 40% da radioatividade foi encontrado no 2 c.alantico. 4. Em caupi, 90% do exudato do xilema (aps 2 horas de exposio do ndulo ao 13N2 ) foi de cido alantico.

5. Alantona e c.Alantico so derivados da purina INOSINA MONOFOSFATO, que sintetizada da RIBOSE-5-FOSFATO e requer nitrognio da Gutamina, Aspartato e Glicina.

UREDEOS X ESTRESSE HDRICO


UREIDEOS - XILEMA
mmoles N-uredico / L seiva
80

UREIDEOS NO XILEMA
controle

mmoles N-ureideo/L seiva

60 40 20 0

80 60 40 20 0 1 2

estresse

DIAS DE ESTRESSE

DIAS APS A REHIDRATAO

OBRIGADO!!!!!!!!!