Escolar Documentos
Profissional Documentos
Cultura Documentos
Sukarti Moeljopawiro
Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi
Precision:
The degree of agreement between replicate experiments Precision does not mean accuracy, since measurements may be highly precise but inaccurate due to a faulty instrument
Type of errors
Errors may be:
Random Careless Inaccurate instruments
Random error which are individually unpredictable Errors can arise from careless experiments work:
Using apparatus wrongly Do not read the manufactures instructions Using broken instruments
Standard solution:
Should be included in all measurements Should be treated in an identical manner to the fluids under investigation Function: provides a useful check on the accuracy of a method
The function of standard and blank: to correct the obtained value Several blanks and controls need to be used when working with enzymes
Glassware
Macam Glassware
Pipet gondok (Volume pipette) Pipet ukur (Graduated pipette) Pipet tetes (Pasteur pipette) Pipet mikro
Labu godog (Digestion flask) Labu ukur (Volumetric flask) Labu pemisah Gelas piala (Beaker glass) Botol timbang Gelas arloji Gelas ukur (Measuring cylinder) Erlenmeyer (Erlenmeyer flask)
Cleaning glassware
Grease rag soaked in chloroform or benzene and soaking overnight in chromic acid Very dirty apparatus soaking in a mixture of concentrated nitric and sulphuric acids After rinsing in tap water followed by several rinses in distilled water Normal glassware dried in an oven Volumetric glassware rinsed with alcohol then dried warm air
Terima kasih
CHROMATOGRAPHY
Sukarti Moeljopawiro
Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi
Extreme physical conditions may: Irreversibly change the structure of the molecules Destroy any biological activity
Chromatography
This technique utilizes differences in the basic physical properties: Mass Size Shape Charge Adsorption effect
Chromatography (contd)
A three component system is involved: The mixture to be separated (liquid) A stationary phase (column or film)
Solid play an active part in the separation process
Kinds of Chromatography
Gel Filtration Adsorption Chromatography Ion Exchange Chromatography Partition Chromatography
Paper Chromatography Thin-layer Chromatography
Gas Chromatography
Gas-liquid Chromatography Gas-solid Chromatography
Gel Filtration
Adsorption Chromatography
Adsorption (chem.) : The taking up of one substance at the surface of another Absorption (chem.) : Penetration of a substance into the body of another Adsorbent (chem.) : The substance, either solid or liquid, on whose surface adsorption of another substance takes place Chamber Dictionary of Science and Technology. Chambers Edinburgh.
A
Solute
D A and C B D and E
Solute
Solvent
E
Solvent
Adsorbent
Adsorption Chromatography
(contd)
Solvent reservoir
Adsorbent
+ +
+
+
+ + +
Partition Chromatography
Two kinds of Partition Chromatography:
Paper Chromatography Thin-layer Chromatography (TLC) Partition Chromatography for the compounds that are soluble in both water and organic solvents
Adsorption Chromatography for the compounds that are readily soluble in organic liquid but sparingly soluble in water Ion Exchange Chromatography for ionizable water soluble compounds
Paper Chromatography
Based on direction of solvent flow:
Ascending Chromatography Descending Chromatography Circular Chromatography
Rf =
Ascending Chromatography
Descending Chromatography
Circular Chromatography
Thin-layer Chromatography
This method is very rapid (many separations can be completed under an hour) The spots are very compact (so it is possible to detect compounds at low concentration) Compounds separation is much better than paper chromatography Separated compounds can be detected using corrosive sprays at high temperature
Thin-layer Chromatography
(contd)
Thin-layer Chromatography
(contd)
Gas Chromatography
Principles
(gas)
MOBILE PHASE
Sample in
Sample out
STATIONARY PHASE
(solid or heavy liquid coated onto a solid or support system)
Column:
Glass/stainless steel Containing solid support (GSC) Solid support is coated a liquid (GLC)
Instrumentation
Injection port sample introduction
Manual - Direct Injection Automated - Autosampler
Instrumentation (contd)
Oven Temperature Control
Isothermal Gradient
240 200
Temp (deg C)
Instrumentation (contd)
Column
Packed
Capillary
Instrumentation (contd)
Detector
Destructive
Mass Spectral (CI/EI) Flame Ionization (FID) Nitrogen-Phosphorus (NPD) Flame Photometric (FPD) Electrolytic Conductivity (Hall/ELCD)
Non-destructive
Thermal Conductivity (TCD) Electron Capture (ECD) Photo Ionization (PID)
Instrumentation (contd)
Detector
Biological detector
Gypsy moth to detect Gypsy moths hormone Human at the end of column detecting separated aromas
Terima kasih
Sukarti Moeljopawiro
Biochemistry Laboratory Faculty of Biology
PCR
Polymerase Chain Reaction
Ditemukan oleh Kary Mullis (1984) Memperbanyak potongan DNA
SIKLUS PCR
PCR terdiri atas beberapa proses:
Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA (memisahkan DNA menjadi 2 rantai tunggal) Penurunan suhu untuk penempelan primer oligonukleotida pada rantai DNA Polimerisasi karena adanya primer dan deoksiribonukleosida trifosfat serta adanya enzim Kemudian proses diulang lagi sampai 25 30 kali
Siklus PCR
KEUNGGULAN PCR
Dapat menganalisis DNA yang sangat sedikit
KELEMAHAN PCR
Optimasi perlu waktu, kalau tidak optimum menyebabkan kesalahan interpretasi Karena sangat sensitif menyebabkan problem kontaminasi sangat tinggi terjadi kesalahan Kebersihan tanpa adanya kontaminasi dituntut sangat tinggi pada saat bekerja
TEKNIK PCR
BAHAN:
DNA Primers Enzim (Thermostable Polymerase) Empat macam deoksiribonukleosida trifosfat Ion Mg Buffer dan akuades
OPTIMASI PCR
Agar potongan DNA berhasil didapatkan dengan baik perlu optimasi:
Konsentrasi: enzim, dNTPs, Mg2+, primer Suhu dan waktu: annealing, denaturasi, polimerisasi/pemanjangan
Konsentrasi enzim
1 2,5 unit/100 l larutan reaksi namun tergantung dari template target dan primer. Masing-masing sampel perlu dioptimasi Konsentrasi untuk optimasi dianjurkan antara 0,5 5 unit/100 l
OPTIMASI PCR
Konsentrasi dNTPs
(lanjt.)
Stok dNTPs harus netral (pH 7), disimpan dengan konsentrasi 10 mM pada suhu 20C. Konsentrasi keempat macam deoksiribonukleosida trifosfat harus sama pada larutan dNTPs
Spesifitas dan ketelitian naik dengan rendahnya konsentrasi, sebab dengan konsentrasi yang rendah memperkecil kemungkinan terjadinya salah penempelan primer ( 20 M/100 l larutan reaksi).
Namun konsentrasi tersebut juga tergantung DNA yang diamplifikasi
OPTIMASI PCR
Konsentrasi Mg2+
(lanjt.)
Optimasi konsentrasi ion Mg sangat penting sebab konsentrasi ion Mg akan mempengaruhi: penempelan primer, suhu dissosiasi baik jalin DNA template maupun produk PCR, spesifitas produk, pembentukan primer-dimer, aktivitas enzim dan ketelitian Konsentrasi sebaiknya antara 0,5 2,5 mM
Konsentrasi primer
Konsentrasi primer dianjurkan antara 0,1 0,5 M. Semakin tinggi konsentrasi primer menyebabkan terjadinya salah tempel (mispriming) dan terjadi penumpukan produk yang tidak diinginkan, juga kemungkinan terjadi primer-dimer
OPTIMASI PCR
(lanjt.)
0,067 Y / OD260 = X
(Ruiz et al., 1997) Y : volume reaksi (l) X : volume primer yang akan dipakai (l) OD260 : optical density pada 260 nm
OPTIMASI PCR
Suhu annealing
(lanjt.)
Suhu yang diperlukan untuk annealing primer tergantung pada: komposisi basa, panjang dan konsentrasi DNA Suhu annealing terbaik biasanya 5C dibawah Tm. Biasanya suhu antara 50 72 C menghasilkan produk yang bagus Suhu terlalu tinggi menyebabkan penempelan primer tidak betul dan kesalahan perpanjangan pada ujung 3 primer, sehingga suhu annealing sangat kritis lebih-lebih pada tahap putaran permulaan
OPTIMASI PCR
(lanjt.)
Pemanjangan rantai (primer extension) Waktu pemanjangan tergantung pada panjang dan konsentrasi DNA yang diamplifikasi serta suhu Suhu pemanjangan umumnya 72 C Suhu 72 C selama 1 menit cukup untuk produk dengan panjang 2 kb Suhu dan waktu denaturasi Penyebab utama gagalnya reaksi PCR adalah tidak sempurnanya proses denaturasi Biasanya: 95 C selama 30 detik atau 97 C selama 15 detik Namun, lebih tinggi mungkin lebih baik terutama DNA yang banyak pasangan GC (Innes et al., 1990)
OPTIMASI PCR
(lanjt.)
Jika denaturasi tidak sempurna, mungkin DNA kembali berikatan ataupun tidak mampu menerima primer yang akan menempel, sehingga sensitifitas turun produk turun. Ini terjadi jika waktu denaturasi terlalu pendek. Jika waktu terlalu lama enzim polimerase akan rusak
Beberapa protokol menganjurkan denaturasi mula-mula 94 C selama 1 10 menit (Ruiz et al., 1997) (Innes et al., 1990) menyebutkan waktu paruh polimerase DNA kurang dari 2 jam untuk 92,5 C, 40 menit untuk suhu 95 C, dan 5 menit untuk suhu 97,5 C
OPTIMASI PCR
(lanjt.)
Jumlah putaran Jumlah tergantung pada konsentrasi DNA mulamula dengan catatan semua parameter sudah dioptimasi Amplifikasi lebih dari 40 putaran akan menghasilkan produk PCR yang salah Terlalu sedikit putaran akan mendapatkan produk yang sedikit Rekomendasi putaran vs konsentrasi mulamula:
Gambar 1. Pola pita RAPD tanaman salak (S. zalacca) jantan (J1-J5) dan betina (B1-B5) menggunakan primer OPA-11. Tanda panah menunjukkan fragmen DNA 360 bp hasil amplifikasi dengan OPA-11 (OPA-11360) tidak spesifik pada satu jenis kelamin. M = marker 100 bp.
Gambar 2. Penanda RAPD (400 bp) spesifik pada tanaman salak (S. zalacca) jantan hasil amplifikasi dengan primer OPP-08 (OPP-08400). B = tanaman betina, J = tanaman jantan, M = marker 100 bp.
Terima Kasih