UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Departamento de Cincia dos Alimentos Bacharelado em Qumica de Alimentos Seminrios em Alimentos

Avanos na Cromatografia Lquida

Josiane Kuhn Rutz

Pelotas, 2009

JOSIANE KUHN RUTZ

AVANOS NA CROMATOGRAFIA LQUIDA

Trabalho acadmico apresentado ao Curso de Bacharelado em Qumica de Alimentos da Universidade em Alimentos. Federal de Pelotas, como requisito parcial da disciplina de Seminrios

Orientador: Fabrzio Barbosa

Pelotas, 2009

No deixe que a saudade sufoque, que a rotina acomode, que o medo impea de tentar, pois o medo nos afasta das derrotas, mas das vitrias tambm. (Autor desconhecido)

Resumo RUTZ, Josiane Kuhn. Avanos na cromatografia lquida. 2009. 41f. Trabalho acadmico (Seminrio em Alimentos) - Bacharelado em Qumica de Alimentos. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras tcnicas instrumentais de anlise, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os mtodos analticos modernos, devido a facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de espcies qumicas. Trata-se de um mtodo fsicoqumico e fundamenta-se no deslocamento diferencial dos componentes de uma mistura, devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis (fase mvel e estacionria). Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das tcnicas de separao, a cromatografia lquida de alta eficincia utiliza pequenas colunas, nas quais uma fase mvel lquida que bombeada a alta presso e elui sobre a fase estacionria que est em seu interior, esta formada de partculas com dimetro de 3 a 10m, assim, os solutos com maior afinidade com a fase mvel sero eludos primeiro e posteriormente os que tm maior afinidade com a fase estacionria. Quanto menor o tamanho da partcula, maior ser a eficincia da coluna e maior a resistncia vazo. As fases estacionrias mais utilizadas so as que contm partculas de slica microporosa ligada covalentemente com grupos octadecil (C18H37). O mtodo dispe de diferentes mecanismos de separao podendo ser de: partio, adsoro, fase ligada, troca inica ou excluso de tamanho. Pode ser efetuada em fase normal, fase estacionria polar e fase mvel apolar, ou em fase reversa, fase estacionria apolar e fase mvel polar. O equipamento dotado de um sistema de abastecimento e programadores da fase mvel, podendo esta ser isocrtica ou de gradiente, bombas de alta presso, injetor, coluna, e detectores, sendo o registro dos dados feito por um registrador, integrador ou mesmo um microcomputador, que tambm utilizado na programao de todas as etapas do processo. Palavras-chave: Cromatografia. HPLC. Anlise Quantitativa. Separao

Lista de Figuras Figura 1 - Tipos de cromatografia..................................................................... Figura 2 - Etapas da cromatografia lquida clssica......................................... Figura 3 - Etapas da cromatografia lquida de alta eficincia........................... Figura 4 - Estrutura esquemtica da slica gel.................................................. Figura 5 - Reao de silanizao de um cloro-silano substitudo com silanol.. Figura 6 - Esquema de troca inica da cromatografia por troca inica............ Figura 7 - Esquema do cromatgrafo lquido.................................................... Figura 8 - Programador de fase mvel a baixa presso................................... Figura 9 - Programador de fase mvel a alta presso...................................... Figura 10 - Bomba pneumtica......................................................................... Figura 11 - Bomba recproca............................................................................ Figura 12 - Bomba do tipo seringa.................................................................... Figura 13 - Medidor de presso Bourbon ........................................................ Figura 14 - Medidor de presso do tipo transdutor de presso........................ Figura 15 - Vlvula rotatria de amostragem para HPLC................................. Figura 16 - Tipos de colunas utilizadas em HPLC............................................ Figura 17 - Cromatograma tpico da separao dos tocoferis em amorapreta (Rubus sp) cv. Tupy, por HPLC, com coluna de fase reversa e detector de fluorescncia a 290nm de excitao e de 330nm de emisso.................... 37 9 13 14 17 21 24 26 27 28 29 30 31 31 32 33 33

Lista de Tabelas Tabela 1 - Principais caractersticas da CG e HPLC........................................ Tabela 2 - Tipos de fases estacionrias para HPLC........................................ Tabela 3 - Fases mveis e estacionrias mais utilizadas na CLL.................... Tabela 4 - Principais radicais R utilizados nas fases estacionrias de 15 18 20

cromatografia lquida com fase ligada.............................................................. 21 Tabela 5 - Classificao das colunas de separao......................................... 35 Tabela 6 - Detectores utilizados na HPLC........................................................ 36

Sumrio 1 Introduo................................................................................................... 2 Cromatografia............................................................................................. 2.1 Conceito e histrico.................................................................................. 2.2 Tipos de cromatografia............................................................................. 3 Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)........................................ 3.1 Histria e Conceito................................................................................... 3.2 Diferenas entre HPLC e a cromatografia lquida clssica (CLC)........... 3.3 Comparao da HPLC com a cromatografia gasosa (CG)..................... 3.4 Fases........................................................................................................ 3.4.1 Fase Mvel (FM)................................................................................... 3.4.2 Fase Estacionria (FE).......................................................................... 3.5 Mecanismos da HPLC.............................................................................. 3.5.1 Lquido-lquido ou partio ................................................................... 3.5.2 Lquida com fase ligada........................................................................ 3.5.3 Lquido-slido ou absoro................................................................... 3.5.4 Cromatografia por troca inica.............................................................. 3.5.5 Cromatografia por excluso.................................................................. 3.6 Equipamentos.......................................................................................... 3.6.1 Sistema de abastecimento da fase mvel ............................................ 3.6.2 Programadores de fase mvel.............................................................. 3.6.3 Sistema de bombeamento.................................................................... 3.6.4 Medidores e controladores de presso................................................. 3.6.5 Sistema de injeo da amostra............................................................. 3.6.6 Coluna................................................................................................... 3.6.7 Detectores............................................................................................. 3.6.8 Registro de dados................................................................................. 3.7 Aplicaes................................................................................................ 4 Concluso................................................................................................... Referncias.................................................................................................... 7 8 8 9 12 12 13 14 15 15 16 19 19 20 22 23 24 25 26 27 28 31 32 33 35 36 38 39 40

1 Introduo Desde o incio do sculo passado a cromatografia vem sendo utilizada como tcnica analtica, tendo seus mtodos aperfeioados com o passar dos anos. Inicialmente era usada para separao de substncias coradas, de onde lhe deriva o nome, mas atualmente a tcnica utilizada para separar uma grande variedade de

compostos, que s ocasionalmente apresentam colorao (LANAS, 1993; GONALVES, 2001). Diferentes critrios so utilizados para distinguir os mtodos cromatogrficos, estes podem ser separados quanto ao mecanismo de separao, tcnica empregada, tipo de fase utilizada e tipo de superfcie na qual ocorre a separao, podendo ser cromatografia em coluna, quando ocorre dentro de um tubo, ou cromatografia planar, quando ocorre em uma superfcie plana (LANAS, 1993). A cromatografia em coluna divide-se em cromatografia gasosa, cromatografia com fludo supercrtico e cromatografia lquida, podendo esta ltima ser classificada em cromatografia lquida clssica e cromatografia lquida de alta eficincia, tema que ser abordado no presente trabalho (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998). Somente por volta dos anos 60 que a tecnologia permitiu o uso de colunas empacotadas com partculas de dimetro da ordem de 3 a 10m, sendo fabricados aparelhos sofisticados que trabalhassem a alta presso, ao contrrio do que acontecia com as colunas de vidro simples da cromatografia lquida clssica, em que a eluio da fase lquida era devido somente a ao da gravidade. Desde ento o nome cromatografia lquida de alta eficincia comeou a ser utilizado para distinguir esta nova tcnica dos mtodos bsicos, que ainda so usados em anlise preparativa (GONALVES, 2001). Apresentar o histrico, assim como os mecanismos de separao, equipamentos e aplicaes da cromatografia lquida de alta eficincia so os principais objetivos deste trabalho.

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2 Cromatografia 2.1 Conceito e histrico Devido a facilidade em efetuar a separao, identificao e quantificao de espcies qumicas, a cromatografia ocupa um lugar de destaque entre os mtodos analticos modernos, podendo ser utilizada isoladamente ou em conjunto com outras tcnicas instrumentais de anlise (COLLINS,1997). Sendo a cromatografia um mtodo fsico-qumico, ela fundamenta-se na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido a diferentes interaes entre duas fases imiscveis, sendo uma fase fixa que tem uma grande rea superficial chamada fase estacionria, e a outra um fluido que se move atravs da fase estacionria sendo chamada de fase mvel (LANAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998). Atribuida ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett, a descoberta da cromatografia como tcnica analtica ocorreu em 1906, quando este descreveu sua experincia na separao dos componentes de extrato de folhas. Neste estudo o botnico conseguiu separar pigmentos de cloroplastos em folhas verdes de plantas, onde usou uma coluna de vidro recheada com carbonato de clcio como fase estacionria e ter de petrleo como fase mvel, ocorrendo a separao de componentes em faixas coloridas, este fato deu origem ao nome de cromatografia (chrom = cor e grafie = escrita) embora o processo no dependa da cor. Apesar de estudos semelhantes terem sido desenvolvidos, Tswett foi o primeiro a compreender e interpretar este processo como aceito atualmente, empregando o termo cromatografia para descrever as zonas coloridas que se moviam dentro da coluna (LANAS, 1993; DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998). A tcnica cromatogrfica foi praticamente ignorada at a dcada de 30 quando foi redescoberta por Kuhn e Lederer que apefeioaram a cromatografia em coluna, separando e identificando as xantofilas da gema de ovo, utilizando um experimento semelhante ao de Tswett, com carbonato de clcio como fase estacionria e ter de petrleo como fase mvel. Apartir da a cromatografia foi

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aperfeioada e em conjunto com os avanos tecnolgicos esta foi levada a um alto grau de sofisticao que resultou no seu grande potencial de aplicao em muitas reas (LANAS, 1993; COLLINS,1997). 2.2 Tipos de Cromatografia A classificao dos mtodos cromatogrficos pode ser quanto ao mecanismo de separao, quanto a tcnica empregada e em relao ao tipo de fase utilizada. No entanto, a classificao mais popular a que leva em considerao o tipo de superfcie na qual ocorre a separao (Fig.1), sendo dividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar (LANAS, 1993).

Cromatografia

Planar Camada delgada Papel Lquida

Coluna Fludo Supercrtico Gasosa

Clssica Figura 1 - Tipos de cromatografia. Fonte: DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998.

HPLC

2.2.1 Cromatografia em coluna A separao ocorre no interior de um tubo de vidro ou metal. De acordo com o estado fsico da fase mvel distingui-se a cromatografia gasosa, cromatografia lquida e a cromatografia de fludo supercrtico (LANAS, 1993).

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2.2.1.1 Cromatografia gasosa Neste mtodo a fase estacionria pode ser slida, com uma grande rea superficial, ou lquida, onde uma pelcula delgada lquida recobre um slido inerte; e a fase mvel um gs denominado gs de arraste, sendo este inerte tem a finalidade de transportar as molculas a serem separadas. Assim, uma corrente de gs elui continuamente pela coluna e quando a amostra vaporizada ela se introduz nesta corrente sendo arrastada atravs da coluna (LANAS, 1993; BONATO, 1997). 2.2.1.2 Cromatografia lquida A fase estacionria utilizada neste mtodo, como na cromatografia gasosa, pode ser um slido ou um lquido e como fase mvel utiliza-se um lquido no qual o soluto est dissolvido, assim, enquanto a fase mvel elui sobre a fase estacionria os solutos so separados de acordo com a interao destes com as fases, sendo eludo primeiro os que tm maior afinidade com a fase mvel e posteriomente os que tm maior afinidade com a fase estacionria. A cromatografia lquida pode ser dividida em: Cromatografia lquida clssica (CLC): este mtodo utiliza colunas com dimetros relativamente grandes, empacotadas com fases estacionrias finamente divididas, pelas quais passam as fases mveis sob ao da gravidade. Separa misturas bastante complexas, porm demorada e necessita que seja feito exame qumico ou espectroscpico das fraes coletadas (VOGEL, 2002). Cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC): Utiliza colunas fechadas que contm partculas muito finas que proporcionam separaes muito eficientes, so utilizadas altas presses para forar a passagem do solvente e assim diminuir o tempo da anlise (HARRIS, 2005). 2.2.1.3 Cromatografia com fludo supercrtico (CSC) Neste mtodo um gs ou um lquido no estado supercrtico utilizado como fase mvel, possuindo propriedades do solvente que se situam entre as de um lquido e de um gs. Acima do ponto triplo existe uma presso na qual o lquido e o vapor esto como fases separadas, acima do ponto crtico, independente da

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presso, existir apenas uma fase que chamada de fludo supercrtico. Quando comparada com a cromatografia lquida este mtodo proporciona um aumento na resoluo e na velocidade, pois o coeficiente de difuso do soluto maior em fludos supercrticos, j em relao cromatografia gasosa este tem menor resoluo e velocidade, mas capaz de dissolver solutos no-volteis (LANAS, 1993; HARRIS, 2005). 2.2.2 Cromatografia planar A separao ocorre em uma superfcie plana, geralmente uma placa de vidro ou metal, impregnado com a fase estacionria ou ento em uma folha de papel embebida com um solvente apropriado. Este mtodo divide-se em cromatografia em camada delgada e cromatografia em papel (LANAS, 1993). 2.2.2.1 Cromatografia em camada delgada A separao consiste no deslocamento diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfcie plana. O processo de separao fundamenta-se na adsoro, mas quando so utilizadas fases estacionrias tratadas pode ocorrer partio ou troca inica, podendo ento ser utilizada tanto na separao de substncias hidrofbicas como hidroflicas (LOPES, 1997). 2.2.2.2 Cromatografia em papel Classificada como cromatografia de partio, na qual a separao dos componentes est relacionada com as diferentes solubilidades relativas destes componentes nas fases mveis e estacionria. Os componentes que tm maior solubilidade na fase estacionria so seletivamente retidos se movimentando mais lentamente ao longo do papel, enquanto que os componentes com maior solubilidade na fase mvel se movem mais rapidamente. Esta utiliza pequena quantidade de amostra, tem boa capacidade de resoluo e preferencialmente aplicada na separao e identificao de componentes polares (BRAGA, 1997).

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3 Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) 3.1 Conceito e histrico Sendo um dos mais novos e mais importantes membros das tcnicas de separao, a cromatografia lquida de alta eficincia tem sua aplicao considerada indispensvel em vrios laboratrios. Ela utiliza equipamentos muito sofisticados que podem ser totalmente automatizados. Neste mtodo so utilizadas pequenas colunas, nas quais uma fase mvel lquida elui sobre a fase estacionria que est em seu interior, sendo esta formada de materiais especialmente preparados; emprega-se alta presso na separao dos componentes da amostra sendo capaz de completar a anlise em alguns minutos (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003). Inicialmente a cromatografia lquida utilizava colunas de vidro com dimetro de 1 a 5cm e comprimento de 50 a 500cm, sendo o dimetro das partculas das fases estacionrias slidas geralmente entre 150 a 200m, nessas condies as vazes eram muito baixas, da ordem de alguns dcimos de milmetros por minuto, tornando os tempos de separao muito longos. Na tentativa de acelerar o processo foi utilizado bombeamento e aplicadas bombas de vcuo, o que no foi eficiente, pois o aumento da vazo fazia com que aumentasse tambm a altura dos pratos tericos. Alguns cientistas j haviam percebido, no incio do desenvolvimento da cromatografia, que a diminuio das partculas da fase estacionria poderia aumentar a eficincia da coluna, mas somente nos anos 60 foi possvel rechear as colunas com partculas pequenas, necessrias para aumentar a resoluo, e tambm, adquirir equipamentos que funcionam a alta presso, o que necessrio para uma boa velocidade de eluio (COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). O avano considervel da cromatografia lquida se deu por volta de meados dos anos 60, sendo o primeiro cromatgrafo lquido de uso prtico construdo em 1964 por Csaka Horvath na Universidade de Yale. Este operava em presses de at 1000psi (6897kPa ou 6897bar), com fase mvel em gua tamponada passando por colunas de 1mm de dimetro interno e com detector de espectrmetro de

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ultravioleta. As primeiras misturas separadas continham cidos nuclicos associados funo da tireide (VOGEL, 2002). 3.2 Diferenas entre a HPLC e a cromatografia lquida clssica (CLC) A cromatografia lquida clssica utiliza-se de um equipamento barato no qual o empacotamento da coluna descartado, pois parte da amostra pode se adsorver de forma irreversvel; a coluna deve ser cheia a cada separao acarretando desperdcio de material e de mo-de-obra; o analista deve ser experiente; a eluio feita pela ao da gravidade tornando o processo demorado; a quantificao e deteco so feitas pela anlise manual das fraes individuais, o que requer muito tempo devido ao grande nmero de fraes coletadas, tambm pode ser usada alguma tcnica que auxilie neste processo, como, espectrofotometria, anlise qumica ou registro gravimtrico e os resultados so registrados em forma de cromatograma, um grfico da concentrao da amostra versus o nmero da frao. Essas etapas podem se vistas na Fig. 2 (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003).
Preparao de coluna Aplicao de Amostra Eluio Deteco e Quantificao
Evaporar para pesagem Anlise Qumica Espectrofotomtrica Etc

Figura 2 - Etapas da cromatografia lquida clssica Fonte: COLLINS; GUIMARES, 1997. Na cromatografia lquida de alta eficincia (Fig.3) a coluna fechada, podendo ser utilizada inmeras vezes; as colunas utilizadas so bastante eficientes, mas oferecem resistncia vazo da fase mvel necessitando aplicao de sistemas de bombas de alta presso, isso faz com que a velocidade da eluio aumente. As anlises so mais precisas, pois a vazo da fase mvel facilmente controlada. A injeo feita com microsseringas ou atravs de vlvulas de injeo e

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diversos tipos de detectores podem ser utilizados. Este mtodo no necessita tanta experincia do operador; tem alta resoluo, sensibilidade e reprodutibilidade, mas dispe de equipamentos caros e de alto custo de manuteno e operao (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003).

Figura 3 - Etapas da cromatografia lquida de alta eficincia Fonte: COLLINS; GUIMARES, 1997. 3.3 Comparao da HPLC com a cromatografia gasosa (CG) Na cromatografia gasosa as amostras devem ser volteis, para que possam passar pela coluna na forma de vapor, e termicamente estveis, a fim de que no se decomponham nas condies da separao. Isso faz com que somente gases e cerca de 20% dos compostos orgnicos possam ser analisados por este mtodo sem que suas estruturas sejam modificadas para aumentar sua volatilidade. A amostra no deve interagir com a fase mvel, por este motivo que a fase mvel um gs inerte tendo como funo somente carregar a amostra volatilizada. Neste mtodo os equipamentos so mais baratos e o tempo de anlise reduzido (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003; ARAJO, 2004). Na HPLC as amostras no precisam ser volteis nem termicamente estveis, basta que sejam solveis na fase mvel, por isso tem uma maior aplicao. A amostra interage com as duas fases, o que faz com que tenha maior variedade de mecanismos de separao, enquanto que na CG a amostra s interage com a fase estacionria. Este mtodo possui maior versatilidade, pois pode ocorrer a variao tanto na fase mvel como na fase estacionria, o que ocorre no na CG, pois a fase mvel sempre um gs inerte. As principais caractersticas de ambos os mtodos esto descritos na tab.1 ( CECCHI, 2003; ARAJO, 2004).

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Tabela 1 - Principais caractersticas da CG e HPLC Parmetros Fase mvel Fase estacionria Tamanho da coluna Fase do composto - Injetado - Detectado Temperatura da coluna Identificao dos picos Quantidade mnima detectvel Detectores mais usados CG Gs inerte Lquida ou slida 1,0 a 100,0m Gs ou lquido Gs 100 a 300C Tempo de reteno 10-12g Ionizao em chama HPLC Lquida Lquida ou slida Menor que 30,0cm Lquido Lquido Ambiente a 65C Tempo de reteno 10-9g Absorbncia do UV 500 a 25.000

ou captura de eltrons Pratos tericos por coluna 2.000 a 3000.000 Fonte: COLLINS; GUIMARES, 1997; ARAJO, 2004. 3.4 Fases 3.4.1 Fases Mveis (FM)

Para que um solvente possa ser utilizado como fase mvel na HPLC este deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fcil purificao; deve dissolver a fase mvel sem decompor seus componentes, para que estes sejam transportados pela coluna sem que haja modificao; no deve dissolver a fase estacionria; deve ser compatvel com o detector; no ser txico e deve ter baixa viscosidade, pois isso ir interferir diretamente na eficincia da separao, devido ao fato de solventes viscosos alm de dificultarem a transferncia de massa entre a fase mvel e a fase estacionria, tambm influenciarem na intensidade da vazo (COLLINS; GUIMARES, 1997). Se durante a separao for empregado um nico solvente de composio constante a eluio chamada de isocrtica. Mas algumas amostras que so formadas de componentes que necessitam de uma separao por gradiente, para que esta seja mais eficiente, requerem mudana na composio da fase mvel durante a anlise, com a variao da proporo entre os solventes, que geralmente diferem entre si na polaridade. A separao por gradiente tem as vantagens de reduzir o tempo de anlise, aumentar a resoluo e reproduzir picos mais finos e mais simtricos. Mas tambm apresenta as desvantagens de aumentar o custo, j

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que necessita de bomba com misturador; no ser compatvel com todos os detectores, como por exemplo, com o detector de ndice de refrao; ter menor estabilidade da linha de base pela variao da fase mvel e tambm pode degenerar a coluna, sendo necessrio fazer a sua regenerao, pois a mudana na fora da fase mvel no incio e no final da cromatografia grande (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; CECCHI, 2003). Uma fase mvel adequada indispensvel para a HPLC, por isso necessrio examinar fatores que determinam sua escolha, como a polaridade desta, que determina seu poder de eluio juntamente com a polaridade da fase estacionria e com a natureza dos componentes da amostra. Se a separao for com fase normal, o poder de eluio aumenta com o aumento da polaridade, se a separao for em fase reversa, o poder de eluio diminui com o aumento da polaridade. Outros fatores que tambm devem ser considerados so o ponto de ebulio, a viscosidade, a compatibilidade com o detector e a toxidez (VOGEL, 2002). 3.4.2 Fases Estacionrias (FE) As fases estacionrias a serem utilizadas na HPLC devem ter alta resoluo entre os componentes da amostra, devem ser de fcil introduo na coluna, ter dimetro uniforme, partculas porosas ou peliculares e serem slidos rgidos, semirgidos ou no rgidos (COLLINS; GUIMARES, 1997; CECCHI, 2003). As partculas da fase estacionrias podem ser classificadas quanto ao seu tamanho em: macropartculas, quando apresentam dimetro entre 20 e 40m; intermedirias, quando tem entre 20 e 10m; e micropartculas, de 3 a 10m. Quanto menor for a partcula, maior ser a eficincia da separao, melhorando assim o processo de difuso das molculas da amostra dentro e fora das partculas, pois partculas menores reduzem a distncia de contato do soluto com as fases estacionria e mvel, facilitando o equilbrio e, consequentemente, melhorando a eficincia da coluna. Elas podem ser de formato esfrico, tambm chamado de regular, e de formato irregular, sendo que as regulares so mais eficientes por oferecerem um enchimento mais uniforme e mais reprodutvel da coluna e por esse motivo so mais caras (CECCHI, 2003; ARAJO, 2004).

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De acordo com a natureza das fases mvel e estacionria pode-se classificar o processo como: cromatografia em fase normal e cromatografia em fase reversa. Cromatografia em fase normal: neste mtodo a fase estacionria utilizada polar e a fase mvel apolar, em relao eluio, os solutos mais apolares so eludos primeiramente, enquanto que os polares so retidos pela fase estacionria e so eludos depois (VOGEL, 2002). Cromatografia com fase reversa (FR): a fase estacionria apolar e a fase mvel polar, portanto os compostos polares so eludos primeiro e os mais apolares eludos posteriormente (VOGEL, 2002). Sendo o material mais utilizado como empacotamento de colunas a slica, que consiste principalmente em dixido de silcio (SiO2) com o tomo de silcio no centro de um tetraedro, sendo a valncia remanescente na superfcie ocupada por uma hidroxila (-OH) (Fig. 4). Esta no deve ser utilizada em pH acima de 8,0, pois isso acarretaria sua dissoluo, ento, para a cromatografia de compostos bsicos com pH entre 8,0 e 12,0 recomenda-se o uso de compostos polimricos como poliestireno, ligado covalentemente a fase estacionria (ARAJO, 2004; HARRIS, 2005).

Figura 4 - Estrutura esquemtica da slica gel. Fonte: HARRIS, 2005. Uma superfcie de slica tem cerca de 8mol de grupos silanol (Si-OH) por metro quadrado, em pH entre 2,0 e 3,0 estes se encontram completamente protonados e em uma ampla faixa de pH acima de 3,0 se dissociam em Si-O-, que se ficarem expostos podem reter fortemente bases protonadas (como RNH3+), provocando a formao de caudas nos picos (HARRIS, 2005).

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A slica sozinha pode ser usada como fase estacionria para a cromatografia de adsoro, j para sua utilizao na cromatografia de partio esta deve estar quimicamente ligada, na qual dependendo do radical R esta pode ser utilizada como fase normal ou fase reversa. A fase estacionria de octadecil (C18) a mais utilizada na cromatografia lquida de alta eficincia, sendo representada por ODS (octadecilsilano) (HARRIS, 2005). Alguns tipos de fases estacionrias para HPLC esto descritos na tab.2. Tabela 2 - Tipos de fases estacionrias para HPLC Descrio Octadecil (C18) Octil (C8) Etil (C2) Metil (C1) Fenil (PH) Cicloexano (CH) Cianopropil (CN) Diol ( 2 OH) Slica (Si) cido Carboxlico (CBA) cido Propilsulfnico (PRS) cido Benzenossulfnico (SCX) Aminopropil (NH2) Amina Primria/Secundria (PSA) Dietilaminopropil (DEA) Amina Quaternria (SAX) cido Fenilbornico (PBA) Fonte: ARAJO, 2004. Polaridade/ interao Altamente apolar Moderadamente apolar Fracamente apolar Fracamente apolar Moderadamente apolar Moderadamente apolar Moderadamente apolar/polar Polar Polar Troca catinica fraca Troca catinica forte Troca catinica forte Troca aninica fraca/polar Troca aninica fraca/polar Troca aninica fraca/polar Troca aninica forte Covalente

Como fase estacionria, alm da slica, podem ser utilizados slidos semirigdos, que geralmente, so constitudas de partculas porosas de poliestireno entrecruzado com divinilbenzeno. Estes podem ser usados em HPLC por excluso com fase mvel orgnica e ainda so muito utilizados na cromatografia por troca inica (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006). Na cromatografia lquido-slido pode ser utilizada a alumina, alm da slica, podendo esta tambm ser utilizada na cromatografia lquido-lquido, assim como o vidro de porosidade controlada, carbono grafitizado, titnia, zircnia e slica recoberta com zircnio (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

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3.5 Mecanismos da HPLC 3.5.1 Lquido-lquido ou partio Com a finalidade de obter a separao de aminocidos, Martin e Synge, em 1941 desenvolveram a cromatografia lquido-lquido (CLL), utilizando como fase estacionria gua em slica e como fase mvel clorofrmio (COLLINS, 1997). Este mtodo preferencialmente utilizado na separao de compostos no-inicos, polares e que apresentem de baixo a moderado peso molecular, sendo este geralmente inferior a 3000 (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). O mtodo consiste de uma fase lquida (estacionria) que por adsoro fsica retida na superfcie da coluna empacotada geralmente com slica e de uma fase mvel, tambm lquida, que passa sobre esta fase estacionria sendo uma destas polar e a outra apolar. A separao baseia-se na solubilidade da amostra em relao ao solvente (fase mvel) e a fase estacionria, sendo assim os componentes da amostra que so mais solveis na fase mvel so eluidos primeiro enquanto os que tm maior afinidade com a fase estacionria so seletivamente retidos por ela (COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; VOGEL, 2002). A desvantagem da CLL, que pode acarretar a deteriorao da coluna, a solubilidade da fase estacionria na fase mvel, ocasionando a no reprodutibilidade nas separaes repetitivas. A fim de solucionar este problema pode-se saturar a fase mvel com a fase estacionria atravs de uma pr-coluna que contenha um percentual elevado da substncia que compe a mesma, disposta antes do injetor; ou tambm ligar a fase estacionria quimicamente ao material de suporte. (COLLINS; GUIMARES, 1997). A CLL pode ser dividida em cromatografia lquido-lquido normal (onde a fase estacionria polar e a fase normal e apolar) e em cromatografia com fase reversa (fase estacionria apolar e fase mvel polar). As fases mveis e estacionrias mais utilizadas nestes mtodos esto descritas na tab. 3 (VOGEL, 2002). Tabela 3 - Fases mveis e estacionrias mais utilizadas na CLL Fases estacionrias Fases mveis Normal , -oxidipropionitrila Carbowax Hidrocarbonetos saturados:

hexano

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(400, 600, 750, etc. Glicis (etileno, dietileno) Ciano-etil-silicone

heptano; solventes aromticos: tolueno e xileno; hidrocarbonetos saturados misturados (at 10%) com dioxano, metanol, etanol, clorofrmio,cloreto de metileno. Fase reversa gua e misturas lcool-gua; acetonitrila e misturas acetonitrila-gua

Esqualano Zipax-HCP Ciano-etil-silicone Fonte: VOGEL, 2002.

3.5.2 Cromatografia Lquida com Fase Ligada Tendo por objetivo solucionar o problema da perda da fase estacionria da CLL surgiu cromatografia liquida com fase ligada (CLFL), na qual a fase estacionria est quimicamente ligada superfcie de um suporte eliminando, assim, o problema da solubilidade desta na fase mvel (COLLINS; GUIMARES, 1997). Nesta forma de cromatografia as fases monomricas e polimricas se ligam a uma vasta gama de materiais de suporte. As fases ligadas so geralmente preparadas por reaes de silanizao. Na superfcie da slica que foi completamente hidrolisada, por aquecimento com HCl 0,1M por um dia ou dois, forma-se grupos silanis, estes grupos, posteriormente, iro reagir com cloro-silanos substitudos formando as fases estacionrias quimicamente ligadas (sendo clorometil-silano amplamente utilizado), como pode ser visto na Fig. 5 (VOGEL, 2002). CH3 Si OH + Cl Si R Si O CH3 Si CH3 R + HCl

CH3

Figura 5 - Reao de silanizao de um cloro-silano substitudo com silanol. Fonte: VOGEL, 2002. De acordo com o grupo funcional que est ligado ao radical R que se classifica quanto fase normal, quando este de natureza polar, e fase reversa, quando este de natureza apolar, na tab. 4 esto descritas as principais sustncias

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utilizadas como radical R tanto em fase normal como em fase reversa (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). Tabela 4 - Principais radicais R utilizados nas fases estacionrias de cromatografia lquida com fase ligada Fase normal - C2H4CN (ciano) -C3H6OCH2CHOHCH2OH (diol) -C3H6NH2 (amina) -C3H6N(CH3)2 (dimetilamina) Fonte: SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002. Os grupos silanis que no reagiram podem absorver molculas polares, levando a mudanas nas propriedades cromatogrficas da fase ligada na cromatografia com fase reversa, j que esta apresenta a fase estacionria apolar, ou tambm pode ocorrer a formao de caudas nos picos cromatogrficos, particularmente com solutos bsicos. Estes efeitos podem ser reduzidos pela inativao de grupos silanis que so encapados pela reao com trimetilclorosilano, que em funo do seu tamanho menor, tem a capacidade de se ligarem a muitos grupos silanis (VOGEL, 2002; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). Fase reversa Cadeia C8 (- octil) Cadeia C18 (-octildecil)

3.5.3 Lquido-slido ou absoro Sendo introduzida inicialmente por Stwett no incio do sculo XX, a cromatografia lquido-slido (CLS) a forma mais clssica da cromatografia lquida e devido a recentes adaptaes tornou-se o mais importante membro dos mtodos de HPLC (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). Este tipo de cromatografia baseia-se na competio entre as molculas do soluto e do solvente pelos stios ativos do adsorvente, estando relacionada com a interao entre os grupos funcionais das partculas do suporte da fase estacionria e

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os grupos polares das molculas do soluto (ARAJO, 2004). Primeiramente uma molcula da fase mvel passa a ser deslocada da superfcie para que possa ser adsorvida pela fase estacionria, levando em considerao que esta possui uma superfcie polar ela ter pouca afinidade com grupos apolares que no sero retidos por no terem sido deslocados da fase mvel (COLLINS; GUIMARES, 1997). As fases estacionrias devem permitir a interao diferencial com os componentes da amostra a serem separadas. As principais interaes responsveis pela adsoro so as de Van de Waals, eletrosttica, pontes de hidrognio e interaes hidrofbicas. Os grupos que so capazes de formar pontes de hidrognio sero fortemente retidos pela superfcie do adsorvente assim como as molculas polarizveis que iro apresentar a interao dipolo dipolo-induzido, portanto o grau de reteno depende da polarizao de cada molcula ou grupo funcional, sendo que compostos que contm grupos funcionais polares sero fortemente retidos pelo adsorvente polar e, portanto, eludos por ltimo, enquanto que com os solutos apolares ocorrer o contrrio (COLLINS; GUIMARES, 1997; ARAJO, 2004; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). Geralmente se usa como adsorvente, um slido ativo com grande rea superficial, os mais comumente usados so a slica e a alumina. Um aspecto que deve ser considerado que adsorventes muito ativos podem adsorver irreversivelmente o soluto sendo que a slica que ligeiramente cida pode reter fortemente solutos bsicos e a alumina que bsica no deveria ser usada em cromatografia de compostos sensveis a bases (VOGEL, 2002). A escolha do solvente de extrema importncia neste mtodo devido ao fato deste competir com o soluto pelos stios ativos do adsorvente, pois quanto mais forte a interao da fase mvel com a estacionria, menor a adsoro do soluto. Os solventes so classificados de acordo com sua srie eluotrpica, ou seja, sua capacidade de absoro, que so utilizadas na escolha do melhor solvente a ser utilizado para uma determinada separao. Este tambm deve ser puro, pois impurezas podem afetar tanto a eficincia da coluna como a deteco (VOGEL, 2002). Muito apropriada para compostos apolares que tem pesos moleculares menores do que 5000, geralmente mais apropriada para amostras que so solveis em solventes apolares, utilizando fase normal (GONALVEZ, 2001).

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3.5.4 Cromatografia por troca inica Para resolver o problema de separao de terras raras e da concentrao de ons transurnio necessria para o desenvolvimento das primeiras armas nucleares, no incio dos anos 40, foi desenvolvida a cromatografia de troca inica. Sua aplicao em HPLC comeou em 1975 com o desenvolvimento de trabalhos de uma tcnica de suspenso do eluente que tornou possvel a deteco condutomtrica dos ons eludos na Dow Chemical Company (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). A Cromatografia por troca inica um mtodo de absoro que baseia-se na interao eletrosttica entre o soluto e a fase estacionria, buscando o equilbrio de troca entre ons em soluo e ons de mesmo sinal na superfcie de um slido que deve ser insolvel e de alto peso molecular. A amostra a ser separada geralmente uma soluo aquosa contendo ons orgnicos e inorgnicos; na superfcie da fase estacionria ctions e nions so covalentemente ligados e ons so trocados com a fase mvel, separando assim os ons que no interagem com a resina daqueles que se ligam com os grupos carregados (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; ARAJO, 2004). A fase estacionria utilizada neste mtodo, geralmente, uma resina de poliestireno entrecruzada com divinilbenzeno a qual so ligados os grupos inicos. As trocas podem ser catinicas ou aninicas o que depende da natureza da fase estacionria. Os stios ativos mais comuns para as resinas trocadoras de ctions so o grupo cido sulfnico -SO3-H+, um cido forte, e o grupo cido carboxlico -COO -H+, um cido fraco; e para os trocadores de nions so os que contm grupos amina tercirias -N(CH3)3+OH-, base forte, e aminas primrias N3+OH-, base fraca. Os grupos inicos possuem contra-ons que so deslocados por ons de carga similar da fase mvel. Nas trocas catinicas, as resinas possuem stios ativos negativos e contra-ons com carga positiva, de forma que os ctions da resina sejam trocados pelos ctions da amostra; nas trocas aninicas, ocorre o contrrio, os stios ativos da resina tm carga positiva e o contra-on tem carga negativa permitindo a troca destes com a fase mvel. O esquema das trocas catinicas e aninicas pode ser visualizado na Fig.6 (COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; ARAJO, 2004). X+ R+YY+ R+ X- (troca aninica)

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X+

R-Y+

Y+

R- X+ (troca catinica)

Figura 6 - Esquema de troca inica da Cromatografia por Troca Inica Fonte: ARAJO, 2004. Atravs da alterao do pH ou aumento da troca inica, que leva ao enfraquecimento das interaes eletrostticas, a fase mvel deve ser modificada, afim de eluir o soluto da resina (ARAJO, 2004). Geralmente os compostos que so separados por este mtodo so cidos carboxlicos, bases orgnicas, peptdeos e aminocidos, que podem se ionizar em solues com pH devidamente tamponado, bem como nions inorgnicos e ctions metlicos ou complexos (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006). 3.5.5 Cromatografia por excluso Geralmente utilizada na separao de componentes de alto peso molecular, a cromatografia por excluso (CE) baseia-se na separao de acordo com o tamanho efetivo das molculas. Este mtodo subdividido em cromatografia por filtrao em gel (GFC) e cromatografia com permeao em gel (GPC). A GFC utilizada na separao de espcies solveis gua (polares) sendo a fase estacionria hidroflica, na GFC os solventes utilizados so orgnicos apolares e fases estacionrias hidrofbicas, o que torna o mtodo complementar sendo que podem ser analisadas substncias polares e apolares (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; VOGEL, 2002). Pelo fato de no haver interaes fsicas ou qumicas entre o soluto e a fase estacionria, a CE difere dos demais mtodos cromatogrficos. O principal mecanismo de reteno das molculas do soluto a penetrao diferenciada destas no interior das partculas do gel. A coluna empacotada com matria inerte com poros de tamanho controlado, ao entrar em contato com a fase estacionria as molculas pequenas ficam retidas no interior de seus poros apresentando maior tempo de reteno sendo eludas mais lentamente pela fase mvel, enquanto que as molculas maiores, que no conseguiram penetram nos poros, so carregadas pela

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fase mvel, tendo, portanto, menor tempo de reteno (COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; VOGEL, 2002). Utiliza-se este mtodo na separao de materiais orgnicos e inorgnicos, mas sua maior utilidade no estudo de biomolculas ou de compostos com alto grau de polimerizao. O material utilizado no empacotamento da coluna deve ser com estrutura rgida a fim de facilitar o empacotamento, e que sejam capazes de suportar as presses elevadas da cromatografia lquida de alta eficincia. Geralmente o empacotamento da coluna para este mtodo e feito por leito de polmeros e partculas de slica, ambos com dimetro de 5 a 10m (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; VOGEL, 2002). 3.6 Equipamentos A instrumentao bsica de um cromatgrafo lquido consiste nos seguintes componentes (Fig.7): Reservatrio do solvente, bomba de alta presso, misturador de solventes, injetor, microsseringas, loop, coluna, detector, coletor de solvente, registrador e sistema computadorizado para coleta de dados (ARAJO, 2003).
Coletor de solvente

Reservatrio do solvente

Coluna Sistema computadorizado de coletor de dados

Microsseringa

Cmara de mistura Injetor Detector Registrador loop Bomba de alta presso

Figura 7 - Esquema do cromatgrafo lquido. Fonte: ARAJO, 2003. 3.6.1 Sistema de abastecimento da fase mvel O abastecimento da fase mvel equipado com um ou mais reservatrios que podem ser de vidro, o prprio recipiente do solvente; de plstico, desde que este

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seja inerte; ou de ao inoxidvel, sendo que este no apropriado para fases mveis tamponadas em pH baixo, pois poder ocorrer a corroso do recipiente (CECCHI, 1999; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; SCOTT, 2003). Fases mveis como a gua e outros solventes polares tm tendncia em dissolverem gases como oxignio e nitrognio, se estes gases forem libertados dentro do equipamento podem formar bolhas na coluna e no sistema de deteco essas bolhas podem causar o espalhamento de banda e interferir na eficincia do detector, por este motivo os solventes devem ser desgaseificados, o que pode ser feito atravs de sistemas de bomba de vcuo, de sistemas de destilao, de dispositivos de aquecimento e agitao do solvente, sob a ao de ultra-som e tambm atravs do sistema de borbulhamento que geralmente feito com gs hlio, por ser um gs inerte e de baixa solubilidade (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; SCOTT, 2003; POMBEIRO, 2003). Alguns sistemas contem tambm filtros a fim de impedir que a poeira e materiais particulados no solvente que causem danos no sistema de bombeamento e de injeo e entupimento da coluna. No necessariamente os desgaseificadores e filtros devem fazer parte do equipamento, um mtodo bastante eficiente passar os solventes em filtros milipore sob vcuo, antes de introduzi-los no recipiente, o que ocasiona a remoo dos gases e materiais em suspenso (COLLINS; GUIMARES, 1997; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002). 3.6.2 Programadores de fase mvel Quando se utiliza a eluio por gradiente necessria mudana na composio da fase mvel, que feita por programadores de fase mvel. Os solventes utilizados apresentam diferentes polaridades variando a porcentagem destes em mistura binria, ternria ou quaternria, aumentando a fora cromatogrfica da FM, fazendo assim, com que picos retidos eluam mais rapidamente. Tambm podem ser utilizados em misturas isocrticas, em que a fase mvel apesar de ter uma concentrao contnua, formada por mais de um solvente. Para que a programao seja automtica so empregados microcomputadores. Existem dois tipos de programadores: a baixa e a alta presso (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

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Nos programadores de baixa presso (Fig. 8) os reservatrios de solventes esto dispostos em ordem crescente de polaridade e os solventes so misturados antes da bomba. Atravs de uma vlvula ligada ao reservatrio do solvente se faz o gradiente, sendo que esta programada para ficar aberta at que saia o volume desejado dos solventes, que sero misturados presso atmosfrica em uma cmara com agitao magntica, posteriormente so enviados a uma bomba de alta presso, passando pelo injetor, coluna e detector (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006). C
Vlvulas Controlador do sistema Cmara de mistura

Injetor Bomba de alta presso

Reservatrio do solvente

Figura 8 - Programador de fase mvel a baixa presso Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006. Nos programadores de alta presso (Fig. 9) diferentes solventes alimentam diferentes bombas. A vazo de cada bomba modificada para produzir os mais variados tipos de gradientes. Os solventes so liberados pelas bombas estando estes a alta presso e vo para uma cmara de pequeno volume onde so misturados por agitao magntica, sendo encaminhados posteriormente ao injetor, coluna e detector (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).
Controlador do sistema

Injetor Cmara de mistura Bomba de alta presso Reservatrio do solvente

Figura 9 - Programador de fase mvel a alta presso Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.

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3.6.3 Sistema de bombeamento Devido ao fato de trabalhar com colunas de partculas muito reduzidas, a cromatografia lquida de alta eficincia necessita que o fluxo da fase mvel seja constante e a alta presso o que se consegue atravs de um sistema de bombeamento eficaz. A utilizao de alta presso necessria, pois partculas exercem alta resistncia ao fluxo da fase mvel e se no fosse utilizada a anlise seria muito lenta. O fluxo deve ser constante para garantir a reprodutibilidade, sensibilidade e resoluo da anlise. Utiliza-se tambm o sistema de bombeamento para fazer gradiente de eluio quando os compostos apresentam fator de separao muito prximo (CECCHI, 2003). Alguns aspectos importantes para o sistema de bombeamento so: presso mxima de 600bars, vazo contnua, intervalos de vazo de 0,1 a 1mL/min, reprodutibilidade e constncia da vazo de 1% e inrcia qumica a solventes comuns (COLLINS; GUIMARES, 1997). Levando em considerao o desempenho e caractersticas de funcionamento, existem basicamente dois tipos de bombas, as pneumticas e as mecnicas (COLLINS; GUIMARES, 1997). 3.6.3.1 Bombas pneumticas Neste tipo de bombas um gs inerte exerce uma presso deslocando o lquido de forma contnua, a presso pode ser diretamente sobre o lquido ou sobre um recipiente onde o mesmo est contido. Essas bombas so baratas e fornecem um fluxo que no sujeito a pulsaes, sendo que o fluxo total depende do fluxo do gs e a presso depende do gs usado e do recipiente. Ela pode ser vista na Fig.10 (PIZZOLATO, 2001).
Para a coluna

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Anel Hermtico

Reservatrio da fase mvel

Gs

Figura 10 - Bomba pneumtica. Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006. 3.6.3.2 Bombas mecnicas As bombas mecnicas podem ser divididas em bombas recprocas e bombas tipo seringa: Bombas recprocas: Consiste de uma pequena cmara na qual o solvente bombeado pelo deslocamento de um pisto controlado por um motor, desloca fluxos de volume constante, porm de forma descontnua, ou seja, em pulsos. Esse tipo de bomba pode ser visto na Fig.11 (PIZZOLATO, 2001; SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002).

Para a coluna

Anel Hermtico

Vlvulas unidirecionais

Do reservatrio da fase mvel

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Figura 11 - Bomba recproca. Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.

Bombas do tipo seringa: Tambm chamadas de bombas de deslocamento contnuo (Fig.12), nessas bombas so formadas por um pisto que se move por ao de um mecanismo de rosca, sustentado por um motor, o fluxo contnuo e sem pulsaes, porm tem capacidade total limitada, devendo parar para o enchimento aps o fornecimento de uma relativamente baixa quantidade de solvente (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 2002; POMBEIRO, 2003).

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Para a coluna

Reservatrio da fase mvel Anel Hermtico

Motor

Figura 12 - Bomba do tipo seringa. Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006. 3.6.4 Medidores e controladores de presso Problemas no equipamento, como entupimentos ou vazamentos, podem ser diagnosticados pelos monitores de presso, que tambm podem ser utilizados para aperfeioar a separao. Dois tipos de medidores de presso podem ser utilizados: Bourbon ou diafragma (Fig.13) e transdutor de presso (Fig.14). Bourbon ou diafragma: no qual um tubo de ao inoxidvel flexvel preenchido com um lquido viscoso abaixa presso, se expande com o aumento da presso da FM que vai da bomba para a coluna, essa expanso desloca o ponteiro acusando o aumento da presso.

Figura 13 - Medidor de presso Bourbon Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006

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Transdutor de presso: Ao ir da bomba para a coluna a fase mvel exerce uma presso em uma membrana, que sentida no transdutor convertendo a presso em corrente eltrica, cujo valor medido.

Figura 14 - Medidor de presso do tipo transdutor de presso. Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006. 3.6.5 Sistema de injeo da amostra Para se obter uma boa eficincia em anlises cromatogrficas, um fator muito importante a se considerar a maneira como se introduz a amostra na coluna. A injeo deve ser reprodutvel e ter grandes variedades de volumes, assim como no deve introduzir bolhas. Esta parte do instrumento necessita de um cuidadoso desenho, pois devem resistir a altas presses e suas cavidades devem ser completamente lavadas pela fase mvel. Duas so as formas de injeo da amostra: com microsseringas e com vlvula rotatria, sendo esta de injeo automtica (PIZZOLATO, 2001; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006). O injetor do tipo seringa apresenta a vantagem de ser mais barato, porm de baixa reprodutibilidade e necessita de um septo para evitar o retorno da amostra e do mbolo para fora do injetor. O sistema de injeo mais utilizado o da vlvula rotatria, pois alm de ser reprodutvel, elimina o problema de retorno da amostra. Neste sistema o volume injetado no necessita ser preciso, pois a vlvula rotatria tem uma ala capilar amostradora (loop) capaz de selecionar volumes de 1 a 100 L de amostra, sendo o excesso levado para fora do equipamento. Na Fig. 15 pode ser visualizado o mtodo de injeo da amostra com a vlvula rotatria. Na posio de carregar (Fig.15 a) um determinado volume de amostra carregado enquanto a fase mvel vai direto para a coluna, a rotao da posio geralmente feita manualmente, assim na posio injetar (Fig.15 b), mudam-se as conexes, fazendo com que a fase mvel passe pela ala de amostragem e arraste a amostra para a coluna (CECCHI, 2003; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

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a: posio para carregar b: posio para injetar

Figura 15 - Vlvula rotatria de amostragem para HPLC. Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006.

3.6.6 Coluna Em um cromatgrafo lquido podem ter trs tipos de colunas, a coluna se saturao, a coluna de guarda e a coluna analtica, como pode ser visto na Fig. 16.

Coluna de saturao

Coluna de guarda

Coluna analtica

Figura 16 - Tipos de colunas utilizadas em HPLC. Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006. 3.6.6.1 Coluna de saturao Tambm chamada de pr-coluna, colocada entre a bomba e o injetor sendo usada pra condicionar a fase estacionria. Muito empregada no passado

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quando se utilizava a cromatografia lquido-lquido com a finalidade de saturar a fase mvel com o lquido da fase estacionria, no sendo to necessria atualmente devido ao grande desempenho das fases estacionrias quimicamente ligadas. Mas ainda pode ser utilizada quando se usam recheios a base de slica e uma fase mvel que dissolve este material, tendo este efeito aumentado com o aumento da temperatura, polaridade, fora inica e pH da fase mvel, de modo que a fase mvel estando saturada com fase estacionria, no ir reagir com a fase estacionria contida na coluna. Pode ser usada tambm para reter impurezas da fase mvel a fim de preservar a coluna (CECCHI, 2003; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006). 3.6.6.2 Coluna de guarda Colocada entre o injetor e a coluna analtica, esta possui normalmente de 2 a 5cm e tem o mesmo dimetro interno e fase estacionria da coluna analtica. utilizada para prevenir que impurezas e compostos fortemente retidos, contaminem a coluna de separao, aumentando assim seu tempo de uso, portanto a coluna de guarda deve ser renovada com certa freqncia, pois satura rapidamente. Devido ao seu pequeno tamanho, em relao ao tamanho da coluna analtica, o custo das diversas trocas desta ainda muito menor do que uma nova analtica, que deteriorada rapidamente quando no se usa a coluna de guarda (CECCHI, 2003; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006). 3.6.6.3 Coluna analtica Esta deve ser constituda de algum material inerte, de dimetro uniforme, capaz de resistir s presses que sero usadas. O material mais utilizado o ao inoxidvel, mas tambm podem ser constitudas de vidro reforado e slica fundida, sendo esta ltima mais utilizada na confeco de colunas capilares. As mais usadas apresentam dimetro interno de 4,6mm, comprimento de 250mm e so recheadas com partculas porosas com dimetro de 5m. A escolha da coluna feita em funo da sua capacidade, que determinada por suas dimenses, material de empacotamento, comprimento e dimetro interno. Dependo do dimetro interno as colunas podem ser classificadas de diferentes formas, como descreve a tab.5 (CECCHI, 2003; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

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Tabela 5 - Classificao das colunas de separao Nome Colunas Rpidas Convencional ou analtica Small bore ou microbore Capilar recheada Capilar Comprimento (cm) 3-10 5-30 10-100 20-200 10-10.000 Dimetro interno (mm) 2-6 2-6 1-2 0,1-0,5 0,02-0,1 Vazo (l min-1) 1.000-5.000 1.000-3.000 5-200 0,1-20 0,1-2 0,05-2 >1.000 Tamanho de partcula (m) 3 3; 5; 10 1; 3; 5 1; 3 1; 3 a >10

semipermevel Capilar aberto 100-10.000 0,01-0,075 Preparativa >20 >10 a: Filme lquido ligado nas paredes. Fonte: JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006. 3.6.7 Detectores

Tendo como funo monitorar o fluxo da fase mvel na sada da coluna, o detector mede de forma contnua propriedades fsicas ou fsico-qumicas da amostra, ou da soluo que a contm enviando um sinal para registro que , geralmente, diretamente proporcional concentrao do componente na amostra. O detector ideal aquele que apresenta as seguintes caractersticas: amostra; concentrao da amostra; uma leitura contnua; resposta universal: capaz de trabalhar com todos os tipos ser estvel: insensvel a variaes de temperatura e de linearidade: o sinal deve manter uma relao linear com a fluxo, no caso de eluies com gradiente; ter alta sensibilidade: detectar pequenas quantidades de

de amostra (PIZZOLATO, 2001; JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006).

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Os detectores dividem-se em duas grandes classes: detectores de propriedades macroscpicas, que so aqueles que medem as alteraes de propriedades fsicas provocadas pelo soluto na fase mvel; e detectores de propriedades do soluto, que so aqueles que respondem a uma dada propriedade qumica ou fsica do soluto e so, idealmente, independentes da fase mvel. Os tipos de detectores esto descritos na tab.6. Em HPLC os detectores mais empregados so os de espectrofotomtricos (UV ou fluorescncia), condutomtricos e refratomtricos (VOGEL, 2002; NETO; NUNES, 2003). Tabela 6 Detectores utilizados na HPLC Detector Ultravioleta ndice de refrao Espalhamento de luz Eletroqumico Fluorescncia Espectrometria de massas Infravermelho com Limite de deteco (ng) 0,1-1 100-1000 0,1-1 0,01-1 0,0001-0,01 0,1-1 1000 Gradiente Sim No Sim No Sim Sim Sim Aplicao Seletivo Universal Alta massa molar Seletivo Seletivo Universal Seletivo

transformada de Fourier Fonte: VOGEL, 2002; HARRIS, 2005. 3.6.8 Registro de dados Os dados obtidos pelos detectores, podem ser registrados ou manipulados atravs de um registrador, um integrador ou um microcomputador. O integrador fornece o tempo de reteno de cada pico, a rea de cada um e a rea total de todos eles. Para aumentar a versatilidade, exatido e preciso da cromatografia lquida de alta eficincia utilizam microcomputadores, que alm de processar os dados obtidos pelo detector, armazenado-os, podem controlar a composio da fase mvel, a vazo que sai da bomba, a injeo da amostra, a temperatura da coluna, podendo diagnosticar possveis problemas (JARDIM; COLLINS; GUIMARES, 2006). 3.6.8.1 Identificao e quantificao A identificao dos componentes de uma amostra feita atravs da comparao dos cromatogramas obtidos com padres, nestes padres o

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componente em questo eludo nas mesmas condies da amostra a ser analisada, tendo a formao de um pico em um determinado tempo chamado de tempo de reteno, sendo assim os componentes so identificados pelo tempo de reteno. Os cromatogramas (Fig. 17) so grficos do tempo em minutos pela resposta do detector.

Figura 17 Cromatograma tpico da separao dos tocoferis em amora-preta (Rubus sp) cv. Tupy, por HPLC, com coluna de fase reversa e detector de fluorescncia a 290nm de excitao e de 330nm de emisso. Fonte: CHIM, 2008. Os padres so obtidos comercialmente e so analisados em diferentes concentraes, formando assim uma curva de calibrao, esta trata-se de um grfico da concentrao do componente pela rea do pico obtido. Atravs desta pode-se quantificar os componentes da amostra quando se obtm a rea dos picos.

3.7 Aplicaes

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A cromatografia lquida de alta eficincia tem uma ampla aplicao na anlise de alimentos na quantificao de compostos. Alguns exemplos mais comuns so: 2008). Vitaminas lipossolveis, como -tocoferol, precursor da Vitamina E; caroteno, precursor da vitamina A e a vitamina K (JAKOB; ELMAFDA, 2000; OTLES; CAGINDI, 2005; GIMENO et al, 2000) Antocianinas (LIMA et al., 2006) Carotenides (DELLA LUCIA, et al., 2008) Compostos fenlicos (ABE et al., 2007) Lipdios (VILA NOVA, 2005; BAGGIO; BRAGAGNOLO, 2008) Acares (DRUZIAN; DOKI; SCAMPARINI, 2005) Hidrolisados proticos (BIZZOTTO, 2006; BIASUTTI, 2008) Vitaminas hidrossolveis como as do Complexo B como B5, B1, B2, B6 e niacina (MORESCHI; MURADIAN, 2007; PRESOTO; ALMEIDA-MURADIAN,

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4 Concluso A cromatografia lquida de alta eficincia um dos mais modernos mtodos cromatogrficos, que se destaca entre os demais devido ao fato de ser capaz de quantificar uma ampla variedade de compostos que, por exemplo, no poderiam ser analisados utilizando a cromatografia gasosa, devido ao fato de que estes necessitam apenas ser solveis na fase mvel, o que o torna de fato extremamente vantajoso na anlise de alimentos. Ela vem sendo aprimorada com o passar dos anos a fim de se tornar um mtodo cada vez mais eficaz na separao e quantificao de compostos. Seus equipamentos so de alto custo, mas se for levado em considerao quantidade de anlises que se pode efetuar, um investimento que trs retorno, sendo assim seu emprego em vrios laboratrios vem se tornando indispensvel.

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REFERNCIAS
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