LAURA SOFIA RAMOS MENDES CAIN

Entomologia Forense: Identificao Gentica de Espcies em Portugal

FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE COIMBRA 2010

Dissertao elaborada para obteno do Grau de Doutor em Cincias da Sade, ramo de Cincias Biomdicas, apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.

Trabalho realizado no Servio de Gentica Forense da Delegao do Norte, do Instituto Nacional de Medicina Legal, I.P. (Presidente: Professor Doutor Duarte Nuno Vieira) sob a orientao do Professor Doutor Francisco Corte Real e sob a co-orientao da Professora Doutora Maria de Ftima Pinheiro.

RESUMO

A Entomologia Forense, consiste no estudo da interaco de insectos e outros artrpodes com questes legais. Pode ser dividida em: urbana, referente a produtos alimentares e mdico-legal. Em Entomologia Forense a investigao criminal pode beneficiar dos mtodos moleculares de genotipagem, como a identificao do cadver atravs do contedo gstrico larvar ou a identificao gentica da espcie, de uma prova entomolgica. Este estudo teve como objectivos: a comparao de diferentes mtodos de extraco de DNA, utilizados em

Entomologia Forense Molecular, a anlise das principais diferenas, relativas ocorrncia de espcies encontradas em distintas condies ambientais e climticas em cadveres humanos, em Portugal e a elaborao de uma base de dados entomolgicos. O DNA dos 314 espcimes que fizeram parte deste estudo e dos contedos gstricos larvares, foi extrado atravs de diferentes processos, de modo a possibilitar a comparao entre mtodos. Para o estudo de microssatlites humanos, a partir do contedo gstrico larvar, foi utilizado um sistema multiplex. Na reaco de amplificao para DNA mitocondrial foram utilizados primers especficos para as diferentes regies estudadas (citocromo b e citocromo oxidase I). Os diferentes mtodos de extraco de DNA utilizados no aparentaram revelar diferenas significativas entre si. Contudo, o mtodo de extraco orgnica foi o que demonstrou maior sensibilidade nas amostras utilizadas para anlise do contedo gstrico larvar (obteno de DNA humano).

Foram identificadas um total de oito espcies, sendo que a maior diversidade de espcies foi encontrada em cadveres cujo aparecimento ocorreu durante os meses que apresentavam temperaturas elevadas. Relativamente aos diferentes habitats, foi observada uma maior diversidade de espcies em cadveres encontrados em espao aberto. Este estudo no inclui todas as espcies que podero ser encontradas num cadver, mas poder ser representativo da ocorrncia das principais espcies de interesse forense em Portugal, pois constitui o incio de uma base dados entomolgicos.

ABSTRACT

Forensic entomology consists in the study of the interaction of insects and other arthropods with legal issues. It can be divided into three subcategories the urban, questions relating to food stuffs, and medico-legal. In forensic entomology, criminal investigations can benefit from the use of molecular methods of genotyping, such as the identification of cadavers from the larval gastric contents or the genetic identification of species of entomological evidences. This studys objectives were: to compare different methods of DNA extraction used in the field of molecular forensic entomology; to analyse the principal differences in the occurrence of species encountered in human cadavers in Portugal depending on the environmental and climatic conditions; and to develop a related entomological database. The DNA of the 314 specimens that made up this study and the larvae gastric contents was extracted using various different processes in such a way as to allow comparison between the different methods. A multiplex system was used for the study of human microsatellites through the gastric larval contents. For the amplification of mitochondrial DNA specific primers were used relating to the different regions studied (cytochrome b e

cytochrome oxidase I).

No significant differences were shown between the different methods of DNA extraction used. However, the method of organic extraction was the one that demonstrated greatest sensitivity in the samples used for analyses of larval gastric contents (in terms of the human DNA obtained). In all, a total of eight species were identified among which the greatest diversity of species were found in cadavers which arose in the months characterised by the highest temperatures. In relation to different habitats, the largest diversity of species was found in cadavers located in open spaces. This study does not include all the species that can be found in cadavers but it does document the occurrence of the principal species of forensic interest in Portugal and thus can constitute the beginnings of an entomological database.

AGRADECIMENTOS

Ao Senhor Professor Doutor Francisco Corte Real, certa de no dispor de palavras suficientes para exprimir a minha gratido por toda a sua orientao, sensatez e rigor com que sempre me aconselhou.

Senhora Professora Doutora Maria de Ftima Pinheiro, Directora do Servio de Gentica e Biologia Forense da Delegao do Norte do I.N.M.L., I.P., o meu profundo reconhecimento, pelo apoio, disponibilidade e amizade.

Ao Senhor Professor Doutor Duarte Nuno Vieira, Presidente do I.N.M.L., I.P. e Senhora Professora Doutora Teresa Magalhes, Directora da Delegao do Norte do I.N.M.L., I.P., pelas facilidades concedidas para realizao deste trabalho de investigao.

Aos Senhores Drs. Bessa Oliveira e Pedro Rezende, pela indispensvel colaborao nas colheitas dos exemplares e

informao, imprescindveis para a prossecuo deste estudo.

Senhora Professora Doutora Marta Saloa, na qualidade de entomloga, pela identificao clssica dos exemplares.

Senhora Dra. Eduarda Matos, pela realizao da anlise estatstica.

Aos Senhores Professores Doutores Marian de Pancorbo e Agostinho Santos, pelo excelente esprito crtico ao longo de todo este trabalho.

Gabi, pela pacincia e auxlio tcnico e a todos os outros meus colegas, pelo bom ambiente de trabalho que me

proporcionaram.

Ao

Antnio,

por

estar

presente,

com

toda

sua

compreenso, em especial nas horas em que tudo parecia esmorecer e ao Martim Maria, simplesmente por existir.

INDCE

1. JUSTIFICAO DO ESTUDO E OBJECTIVOS .............................................. 2 2. INTRODUO ............................................................................................. 4 2.1 BREVE RESUMO HISTRICO DA ENTOMOLOGIA FORENSE ................. 4 2.2 FENMENOS CADAVRICOS PUTREFACTIVOS ..................................... 7 2.3 PRINCIPAIS ESPCIES DE INSECTOS DE INTERESSE FORENSE .............. 10
2.3.1 Famlia Calliphoridae ........................................................................... 10 2.3.2 Famlia Sarcophagidae ....................................................................... 13

2.4 ESTIMAO DO INTERVALO POST MORTEM ........................................ 14 2.5 MTODOS DE IDENTIFICAO BASEADOS NA ANLISE DE DNA..... 16
2.5.1 Identificao gentica da espcie ................................................... 17 2.5.2 Anlise do contedo gstrico larvar .................................................. 20

3. MATERIAL E MTODOS ............................................................................. 23 3.1 COLHEITA E PRESERVAO DE AMOSTRAS ......................................... 23 3.2 EXTRACO DO DNA ............................................................................. 28
3.2.1 Amostras utilizadas para identificao da espcie ......................... 30 3.2.1.1 Extraco orgnica ...................................................................... 31 3.2.1.2 DNeasy Tissue Kit .......................................................................... 32 3.2.1.3 BioRobot EZ1 ................................................................................. 33 3.2.2 Amostras utilizadas para anlise do contedo gstrico larvar........ 34 3.2.2.1 Chelex 100 .................................................................................... 34

3.3 AMPLIFICAO DO DNA ........................................................................ 35

3.3.1 Microssatlites - AmpFSTR Identifiler PCR Amplification Kit .......... 36 3.3.2 DNA Mitocondrial ................................................................................. 37

3.4 PURIFICAO DO DNA MITOCONDRIAL ............................................. 39 3.5 SEQUENCIAO DO DNA MITOCONDRIAL ........................................ 40

ix

3.6 SEPARAO E DETECO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS .......... 41 3.7 DESIGNAO ALLICA (MICROSSATLITES) ........................................ 42 3.8 ANLISE DAS SEQUNCIAS DE DNA MITOCONDRIAL ........................ 43
3.8.1 Determinao da espcie.................................................................. 43 3.8.2 Anlise filogentica ............................................................................. 44

3.9 ANLISE ESTATSTICA ................................................................................ 44 4. RESULTADOS ............................................................................................. 47 4.1 EXTRACO DO DNA ............................................................................. 47
4.1.1 Identificao da espcie.................................................................... 47 4.1.2 Anlise do contedo gstrico larvar (DNA humano) ....................... 49

4.2 IDENTIFICAO DA ESPCIE................................................................... 52

4.2.1 Primers C1-J-2495/C1-N-2800 - TL2-N-3014, C1-J-1687/ TY-J-1460 ................ 53 4.2.2 Primers C1-N-2191/C1-J-1718 .................................................................. 56

4.3 DISTRIBUIO DA ESPCIE ...................................................................... 57 4.4 ANLISE DAS SEQUNCIAS ...................................................................... 60 4.5 ANLISE ESTATSTICA ................................................................................ 67 5. DISCUSSO ............................................................................................... 70 5.1 EXTRACO DO DNA ............................................................................. 70
5.1.1 Identificao da espcie.................................................................... 70 5.1.2 Anlise do contedo gstrico larvar (DNA humano) ....................... 71

5.2 IDENTIFICAO E DISTRIBUIO DA ESPCIE ..................................... 76 5.3 ANLISE DAS SEQUNCIAS ...................................................................... 79 5.4 ANLISE ESTATSTICA ................................................................................ 82 5.5 CONSIDERAES FINAIS ......................................................................... 83 6. CONCLUSES ........................................................................................... 85 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................... 87

1. JUSTIFICAO DO ESTUDO E OBJECTIVOS

JUSTIFICAO DO ESTUDO E OBJECTIVOS

1. JUSTIFICAO DO ESTUDO E OBJECTIVOS

identificao

detalhada

da

entomofauna

da

rea

geogrfica, onde uma determinada morte ocorreu, essencial para uma aproximao correcta da estimativa do tempo decorrido aps a morte. Em Portugal, existiu at 2009 uma total ausncia de dados entomolgicos, sobre as principais espcies de interesse forense que colonizam cadveres humanos. Deste modo, este estudo justificado pela necessidade de elaborao de uma base de dados das referidas espcies.

Os objectivos deste trabalho foram:

- Comparar diferentes mtodos de extraco de DNA, utilizados em Entomologia Forense Molecular.

- Analisar e comparar as principais diferenas, relativas ocorrncia de espcies encontradas em diferentes condies climticas e ambientais.

- Efectuar o estudo da colonizao cadavrica (ordem Dptera) em cadveres humanos, de modo a iniciar uma base de dados entomolgicos, em Portugal.

2. INTRODUO

INTRODUO

2. INTRODUO

A Entomologia Forense consiste no estudo da interaco de insectos e outros artrpodes com questes legais, podendo ser dividida em trs reas principais: a urbana, a referente a produtos alimentares e a mdico-legal (Byrd e Castner, 2001). A primeira diz respeito a disputas relativas ao meio ambiente que envolvam insectos e inclui aces de negligncia relacionadas com infestaes, por exemplo, de enfermarias (hospitais) ou de cadveres (agncias funerrias), com larvas de insectos. A segunda relaciona-se com a presena de artrpodes ou parte deles, em alimentos ou produtos empregues na sua confeco. A Entomologia Mdico-Legal visa, nomeadamente, a utilidade dos insectos na resoluo de casos criminais (Hall, 2001).

2.1 BREVE RESUMO HISTRICO DA ENTOMOLOGIA FORENSE O primeiro caso de Entomologia Forense documentado encontra-se descrito num manual de Medicina Chins, do sculo XIII. O caso descrito refere-se ao homicdio de um agricultor degolado por uma gadanha. Para solucionar o caso foi deliberado que todos os agricultores da regio que pudessem estar

relacionados com o ocorrido, depositassem os seus instrumentos de trabalho em determinado local, ao ar livre, tendo sido constatado que apenas sobre um deles se acercaram moscas.

INTRODUO

Esta constatao levou identificao do assassino, que acabou por confessar o delito; porquanto, as moscas eram atradas pelos vestgios de sangue que ficaram aderentes arma do crime (Benecke, 2001).

Durante muito tempo manteve-se a crena de que as larvas que surgiam no cadver eram geradas espontaneamente a partir do prprio cadver. Tal convico foi mantida at que um naturalista do Renascimento, Francisco Redi, demonstrou que as larvas procediam de insectos, que depositavam os ovos no cadver. Redi fez experincias com diversos tipos de tecidos musculares e descreveu o observado. Assim, concluiu que os ovos eram depositados nos fragmentos de tecidos, aos quais eram atradas distintas espcies de insectos que se transformavam em larvas, depois em pupas, de onde saam os insectos adultos (Magaa, 2001).

Em 1831, Orfila, um mdico francs, assistiu a um grande nmero de exumaes, observou que os corpos eram habitados por diversos artrpodes e relatou o importante papel das larvas na decomposio cadavrica.

O primeiro caso de Entomologia Forense moderna que incluiu uma estimativa do intervalo post mortem (IPM) da autoria do mdico francs Bergeret, em 1855 (Bergeret, 1855). No entanto, este revela nos seus trabalhos uma ausncia de conhecimento relativo sucesso dos artrpodes nos cadveres.

INTRODUO

Em

1894, Mgnin

utilizando

os seus

quinze

anos de

experincia mdico-legal com cadveres, publica La faune des cadveres: application de lentomologie a la mdecine lgale, um clssico que d incio aplicao da Entomologia Forense na resoluo de percias no mbito mdico-legal. Nesta obra, Mgnin refere como estimar o IPM atravs do estudo das diferentes sucesses de espcies de artrpodes encontradas num cadver em decomposio.

Muito posteriormente, surge a Entomologia Forense moderna com os trabalhos de vrios autores como Leclerq (Leclerq, 1978), Smith (Smith, 1986), Catts e Haskell (Catts e Haskell, 1990), entre outros. Este grande hiato temporal foi devido, provavelmente, ao reduzido nmero de casos, falta de entomlogos especializados no estudo da entomofauna cadavrica e no cooperao entre estes e os peritos em Medicina Legal.

Recentemente, trabalhos experimentais corpos carbonizados e (Avila e 1999), Goff,

efectuados em sepultados e

1998),

(VanLaerhoven

Anderson,

submersos

(Hobischak

Anderson, 2001; Anderson e Hobischak, 2004) e com leses provocadas por disparo de arma de fogo (Roeterdink, 2004), estabelecem parmetros, susceptveis de serem aplicados a situaes similares reais. So disso exemplo os estudos realizados em diversas reas geogrficas, como a Austrlia (Wallman e Adams, 2001), (Harvey, 2003), ustria (Grassberger, 2003),

Alemanha (Schroeder, 2003a), Espanha (Arnaldos, 2004), Japo

INTRODUO

(Saigusa, 2005), Uruguai (Lyra, 2005), China (Wang, 2008), Portugal (Cain, 2009).

2.2 FENMENOS CADAVRICOS PUTREFACTIVOS Os fenmenos post mortem podem ser divididos em abiticos, evidentes aps o cessar das funes vitais e transformativos, responsveis pelas extensas modificaes da morfologia e estrutura do cadver. Estes ltimos podem ser destrutivos, originando o decaimento da matria orgnica (autlise e putrefaco) ou conservadores, causadores das transformaes ocorridas no cadver de acordo com as condies ambientais (saponificao, mumificao e corificao).

A putrefaco, sendo o processo destrutivo que ocorre com maior frequncia, de consiste origem num tipo de no decomposio qual ocorre a

fermentativa,

bacteriana,

desintegrao das molculas atravs de reaces de reduo e oxidao.

Os microrganismos responsveis pela putrefaco produzem enzimas que actuam selectivamente sobre os compostos

orgnicos, originando modificaes profundas, que conduzem destruio do cadver. Os microrganismos existentes no sistema digestivo desempenham as principais aces responsveis por este processo, que tem incio com a actividade das bactrias aerbias que absorvem o oxignio.

INTRODUO

Esta aco permite, posteriormente, o desenvolvimento de microrganismos aerbios facultativos e anaerbios. Estes ltimos desempenham a mxima aco de desintegrao.

A evoluo dos fenmenos putrefactivos pode ser subdividida em quatro perodos: colorao (cromtico), produo de gs (enfisematoso), liquefaco e reduo esqueltica. O estudo destas modificaes putrefactivas, conjugado com as influncias ambientais (humidade, temperatura e arejamento) e com os factores individuais (idade, estrutura fsica, causa de morte), podem constituir marcadores orientativos do diagnstico do tempo de morte. No entanto, convm realar que as modificaes putrefactivas podem variar de cadver para cadver, de ambiente para ambiente e at mesmo em distintas regies corporais do mesmo cadver.

O perodo cromtico tem incio com o aparecimento da mancha verde, que consiste na primeira manifestao objectiva e visvel da putrefaco. A mancha verde originada pela aco do cido sulfdrico, produzido pela putrefaco dos tecidos, sobre a hemoglobina na presena de oxignio (Calabuig e Caadas, 2003). Esta mancha pode ser observada numa fase inicial na parte inferior do abdmen, frequentemente com incio na fossa ilaca direita, ao nvel do cego, onde a flora intestinal mais abundante, geralmente 24 a 48 horas aps a morte ter ocorrido, dependendo das referidas influncias ambientais e individuais.

INTRODUO

A colorao esverdeada progride de modo gradual para a restante regio abdominal e, posteriormente, escurece, tornandose cinzento-esverdeada.

Durante

perodo

enfisematoso,

caracterizado

pelo

desenvolvimento de grande quantidade de gases, a infiltrao gasosa invade o tecido subcutneo (enfisema putrefactivo). As bactrias responsveis pela putrefaco colonizam o sistema venoso, originando a hemlise do sangue, tornando, deste modo, evidente a rede venosa superficial, devido deslocao de sangue cadavrico para a periferia.

No

perodo

de

liquefaco,

epiderme

sofre

um

desprendimento de restos tecidulares resultantes do destacamento da derme, formando flictenas de dimenses variveis, contendo lquido soro-hemtico. Nesta fase os rgos apresentam uma consistncia muito amolecida e uma colorao vermelho-rosa. A presso originada no interior do cadver devida formao de gases no abdmen, vai sendo libertada atravs da expulso dos mesmos, e este vai perdendo o aspecto que apresentava no perodo enfisematoso. Aps vrias semanas, o cadver pode apresentar uma colorao prxima ou at mesmo, negra. Internamente, a decomposio progride de modo mais lento que na superfcie (Knight, 1996).

INTRODUO

Paulatinamente, no perodo de reduo esqueltica os tecidos moles e rgos so desintegrados pelo processo de liquefaco, restando os rgos mais slidos como o tero, corao e prstata e os elementos mais resistentes tais como tecidos fibrosos, ligamentos e cartilagens (Knight, 1996). Neste perodo podem, eventualmente, desaparecer todos os tecidos, ficando o cadver reduzido esqueletizao total.

2.3 PRINCIPAIS ESPCIES DE INSECTOS DE INTERESSE FORENSE

A ordem Diptera compreende cerca de 86000 espcies conhecidas (Byrd e Castner, 2001), sendo uma das maiores ordens de insectos. As espcies que fazem parte desta ordem podem ser encontradas em quase todos os habitats. Sob o ponto de vista morfolgico apresentam apenas um par de asas, encontrando-se o segundo par reduzido a halteres, utilizado na estabilizao do voo, e um par de olhos compostos. As larvas dos dpteros possuem corpo de consistncia mole, de tonalidade creme e sem membros de locomoo, no se encontrando a cabea diferenciada.

2.3.1 Famlia Calliphoridae A famlia Calliphoridae contm mais de 1000 espcies (Byrd e Castner, 2001) e compreende as mais importantes espcies

10

INTRODUO

capazes de fornecer informao relativa a uma determinao do IPM. Estas espcies so atradas por matria orgnica em decomposio e por excrementos, deste modo constituem os primeiros insectos a localizar e colonizar cadveres. As larvas desta famlia so caracterizadas pela sua

capacidade energtica e voracidade, pois segregam fludos digestivos que contm enzimas proteolticas que facilitam e aceleram a decomposio dos tecidos.

Os adultos depositam sucessivas e significativas quantidades de massas de ovos que produzem novas geraes de larvas. Esta deposio efectuada preferencialmente nos orifcios naturais expostos do cadver e nas possveis leses transformativas abertas existentes na superfcie corporal. A eventual perda de tecido e a desidratao tornam o cadver um hospedeiro pouco atractivo para a deposio de ovos e por esta razo, mesmo os estdios avanados de decomposio no apresentam larvas desta famlia. A dimenso dos adultos pode variar entre 6 a 14 milmetros (mm) de comprimento e as larvas maturas podem variar entre 8 a 23 mm.

As

espcies

Calliphora

vicina

(Robineau-Desvoidy)

Calliphora vomitoria (Linnaeus), vulgarmente denominadas de moscas azuis, podem atingir dimenses variveis entre 7 a 14 mm. Estas moscas possuem um abdmen robusto, com plos e de tonalidade azul metlico. O trax possui riscas escuras longitudinais na superfcie dorsal da base das asas.

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INTRODUO

As moscas azuis desempenham um papel fundamental na decomposio da matria orgnica, uma vez que os adultos so fortemente atrados por matria em putrefaco. De distribuio praticamente mundial, colonizam habitats urbanos e rurais, sendo muito comum a sua presena em cadveres humanos. O seu desenvolvimento fica completo entre duas a trs semanas.

A distino morfolgica entre as duas espcies de C. vicina e C. vomitoria feita com base na tonalidade da parte inferior da cabea, imediatamente por baixo dos olhos, que na primeira espcie de tom avermelhado e na segunda negra.

Os indivduos do gnero Lucilia (Meigen), comummente denominadas moscas verdes, apresentam uma variao no comprimento entre 6 a 12 mm. O abdmen e o trax possuem uma tonalidade verde metlica. Os adultos so atrados por tecidos animais e humanos frescos e, ocasionalmente, por excrementos. Alguns espcimes vivem de modo parasita sobre ferimentos de animais de sangue quente (Reichholf-Riehm, 1990). As larvas tm preferncia por matria fecal e em

putrefaco (Byrd e Castner, 2001). A sua distribuio mais frequente na Europa e sia (Sibria) (Reichholf-Riehm, 1990).

12

INTRODUO

Os indivduos adultos pertencentes ao gnero Chrysomya apresentam corpos pouco robustos e cabea de grandes dimenses, com olhos bastantes proeminentes de tom

avermelhado. So atrados no s por matria orgnica em decomposio e de odor adocicado, mas tambm por

excrementos lquidos e slidos.

2.3.2 Famlia Sarcophagidae Esta famlia compreende cerca de 2000 espcies (Byrd e Castner, 2001), distribudas mundialmente pelas regies tropicais e temperadas.

Os indivduos desta famlia so frequentemente observados em habitats interiores ou em condies adversas que impossibilitam o voo a outros insectos. Por esta razo, encontram-se entre os primeiros insectos a localizar restos cadavricos, logo a seguir aos indivduos da famlia Calliphoridae. Os adultos so atrados, preferencialmente, por substncias adocicadas, embora possam tambm ser encontrados associados aos primeiros e ltimos estdios de decomposio. As larvas so fortemente atradas por matria em putrefaco.

13

INTRODUO

Os espcimes desta famlia apresentam uma dimenso mdia que pode variar entre 2 a 14 mm (Byrd e Castner, 2001). Os adultos possuem olhos de tom avermelhado e o corpo com cerdas. Possuem no trax, frequentemente, riscas longitudinais, de cor cinza e negro e um padro em mosaico no abdmen. Os exemplares desta famlia so muito semelhantes entre si, quer no estado adulto, quer larvar. Tal facto torna estes espcimes bastante difceis de identificar ao nvel da espcie atravs dos mtodos clssicos.

As fmeas desta espcie depositam, ao invs das frequentes massas de ovos, o primeiro estdio de desenvolvimento larvar nos restos em decomposio. Por este motivo as massas de ovos habitualmente observadas em cadveres no podero ser atribudas a espcies desta famlia. O perodo de tempo necessrio ao desenvolvimento dos ovos no dever ser levado em linha de conta aquando da estimativa do IPM.

2.4 ESTIMATIVA DO INTERVALO POST MORTEM

O conhecimento da sucesso de insectos, aquando da colonizao cadavrica, numa determinada rea geogrfica permite, atravs da anlise da entomofauna do cadver, fazer uma estimativa do tempo decorrido depois da morte (Anderson, 2001).

14

INTRODUO

A estimativa do IPM efectuada segundo um de dois mtodos. Um dos mtodos, geralmente utilizado nas primeiras fases do processo de decomposio cadavrica, usa informao relativa estimativa da idade dos estdios imaturos que aproveitam o cadver como fonte de alimento. Os insectos utilizados para esta estimativa so geralmente dpteros pertencentes s famlias, Calliphoridae e Sarcophagidae.

Uma vez que estes dpteros se consideram como sendo os primeiros a depositar ovos no cadver alguns minutos aps a morte ter ocorrido, a estimativa da idade dos ovos, das larvas ou das pupas mais antigos fornecer um IPM mnimo (Catts, 1990; Anderson, 1995).

Este mtodo no proporciona dados relativos estimativa do IPM mximo, dado que existe uma ausncia de conhecimento do perodo decorrido entre a morte e a deposio dos ovos.

O outro mtodo baseia-se na progressiva sucesso de artrpodes encontrados no cadver (Catts e Goff, 1992) e no facto de cada fase da decomposio cadavrica atrair selectivamente determinadas espcies. A anlise desta sucesso poder, deste modo, fornecer informao sobre o tempo decorrido aps a morte, com estimativas dos intervalos mnimos e mximos de IPM.

15

INTRODUO

Para aplicar este mtodo necessrio elaborar uma precisa base de dados da sucesso de insectos que ocorre numa determinada rea geogrfica. Esta base geralmente construda atravs de modelos animais (Wells e LaMotte, 2001) e servir para posterior comparao.

No entanto, diversas variveis, tais como os factores ambientais e geogrficos, podem influenciar a entomofauna de uma determinada regio e consequentemente, afectar a

determinao do IPM. Ou seja, estas variveis quando no consideradas podem ter um efeito pernicioso numa precisa estimativa do IPM.

Apesar da existncia de trabalhos publicados sobre a sucesso faunstica cadavrica humana em diversos locais

geogrficos, Portugal, at ao ano de 2009 (Cain, 2009), apresentava uma total ausncia de dados entomolgicos.

2.5 MTODOS DE IDENTIFICAO BASEADOS NA ANLISE DE DNA

Em Entomologia Forense a investigao pode beneficiar de diversos mtodos moleculares de genotipagem, sendo o mais comum a identificao gentica da espcie.

16

INTRODUO

Outras aplicaes podem incluir a identificao do cadver atravs do contedo gstrico larvar ou a caracterizao da estrutura gentica populacional de um determinado grupo de insectos com interesse forense.

Nas clulas superiores o DNA (cido desoxirribonucleico) constitui o depsito fundamental da informao gentica e encontra-se fundamentalmente, no ncleo, fazendo parte dos cromossomas (DNA nuclear). Existe tambm uma pequena quantidade mitocondrial). no citoplasma, dentro das mitocndrias (DNA

A maioria das tcnicas utilizadas em sistemtica molecular animal baseiam-se no estudo da molcula do DNA mitocondrial (DNAmt). O seu elevado nmero de cpias por clula, tornam a amplificao mais sensvel e a sua configurao circular diminui a propenso degradao.

2.5.1 Identificao gentica da espcie A identificao precisa da espcie de uma prova

entomolgica representa um passo crucial na anlise forense. Espcies taxonomicamente relacionadas podem divergir

substancialmente nas taxas de crescimento, diapausa (estado fisiolgico no qual os insectos apresentam uma actividade reduzida) e hbitos ecolgicos.

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INTRODUO

O diagnstico da espcie baseado nas caractersticas morfolgicas/anatmicas do espcime pode revelar-se intil na distino de estdios imaturos, quer devido a estes, no raras vezes, serem morfologicamente indistinguveis, quer devido inexistncia de chaves para a sua classificao.

A utilizao do DNA na caracterizao destes estdios encontra-se amplamente descrita na literatura cientfica, sendo a equipa Sperling (Sperling, 1994) pioneira no seu uso. Esta descrio pode ser encontrada, no s para insectos adultos e larvas, mas tambm para puprios vazios (Mazzanti, 2010).

Vrias regies do DNA foram propostas para a supramencionada caracterizao, tais como os RAPDs (Randomly Amplified Polymorphic DNA) (Benecke, 1998), os AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphisms), (Picard, 2010), o gene para a subunidade ribossmica 28S do rRNA (Stevens, 2001), a subunidade 5 da NADH desidrogenase (Zehner, 2004b), ou a regio ITS2 (internal transcribed spacer 2) do rRNA (Song, 2008), (Nelson, 2008), no existindo no entanto uniformidade na escolha de um locus. Contudo, a seleco de um nico locus exige precaues adicionais na distino de espcies geneticamente prximas (Wells, 2007a).

A identificao da espcie em seres vertebrados poder ser efectuada com base na regio D-loop da molcula do DNAmt, contudo, para a maioria dos animais o gene de eleio o citocromo b (Parson, 2000), (Branicki, 2003), da referida regio.

18

INTRODUO

Embora este gene tenha sido utilizado com sucesso na determinao da espcie de insectos (Simmons e Weller, 2001), (Pancorbo, 2004), a regio codificante do DNAmt, citocromo oxidase I (COI ou cox 1) parece ser a eleita na maioria dos estudos envolvendo a classe Insecta (Malgorn, 1999), (Vincent, 2000), (Wells e Sperling, 2001b). Este gene apresenta vrias vantagens aplicveis identificao gentica de espcies, tais como, a facilidade com que isolado, o elevado nmero de cpias na clula e a sua sequncia e estrutura que se mantm conservadas atravs dos taxa, o que faz com que seja, frequentemente, analisado pela maioria dos investigadores.

A sua principal limitao reside na incapacidade de, por vezes, distinguir espcies geneticamente prximas como as do gnero Calliphora. No entanto, para as espcies C. vicina e C. vomitoria, o estudo deste gene seguido de uma digesto com a enzima de restrio SfcI, tornam possvel esta diferenciao de modo rpido e fivel (Ames, 2006).

As espcies da famlia Calliphoridae apresentam variaes intra-especficas no hapltipos de DNAmt, deste modo, a

validao de testes moleculares na populao de insectos da rea geogrfica que se pretende estudar imprescindvel (Wells e Williams, 2007b).

19

INTRODUO

Espcies provenientes de novas localidades podem no coincidir na sua totalidade com as sequncias de DNAmt publicadas, o que suscita questes relativas aos nveis aceitveis, de variao, aquando da identificao gentica (Harvey, 2008).

2.5.2 Anlise do contedo gstrico larvar

Aquando da colheita de larvas utilizadas para estimativa do IPM frequentemente assumido que estas se alimentaram/ desenvolveram no cadver, uma vez que a colheita efectuada directamente no cadver ou num local muito prximo do mesmo. No entanto, a associao larva-cadver nem sempre possvel de observar. Situaes como a remoo do cadver da cena do crime, ou a presena de uma fonte alternativa de alimento, podem exigir a comprovao da referida associao (Wells, 2001a).

A obteno de DNA humano a partir de insectos pode ser utilizada para diversas finalidades, tais como a identificao de um suspeito numa agresso sexual (Lord, 1998), ou a genotipagem de indivduos a partir de mosquitos (Kreike, 1999).

Para identificao de DNA humano no contedo gstrico larvar e posterior comparao com uma amostra de referncia do cadver, poder ser estudado o DNA nuclear (microssatlites)

20

INTRODUO

(Zehner, 2004a) ou, na impossibilidade da sua anlise, o estudo do DNAmt (Linville, 2004).

Os microssatlites, tambm designados de STR (short tandem repeats) foram pela primeira vez utilizados como marcadores polimrficos em 1989 (Litt e Luty, 1989).

Podem ser definidos como pequenas sequncias de DNA, de 2 a 7 pares de bases (pb) de tamanho, repetidas em tandem e dispersas pelo genoma, com uma frequncia estimada de aproximadamente um STR por cada 300-500 kilobases (Edwards, 1992).

Como o tamanho dos alelos dos loci STR relativamente pequeno, menor do que 350 pb (Brinkmann, 1996), a sua anlise bastante sensvel e rpida, podendo ser estudados a partir de amostras com quantidades muito pequenas de DNA.

No entanto, em amostras muito degradadas, como as provenientes do contedo gstrico larvar, o estudo dos STR no permite a obteno de resultados, o que conduz ao estudo das regies hipervariveis (HVI e HVII) da regio controlo (displacement loop, D-loop) da molcula do DNAmt. Esta regio no codificante, responsvel pela regulao da replicao e da transcrio de todo o DNAmt e apresenta alta variabilidade devido, no s ausncia de histonas protectoras e de um sistema de reparao do DNA, mas tambm elevada sensibilidade ao stress oxidativo causado pelos radicais livres, com efeito mutagnico.

21

3. MATERIAL E MTODOS

MATERIAL E MTODOS

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 COLHEITA E PRESERVAO DE AMOSTRAS Os 314 espcimes que fizeram parte deste estudo foram colhidos em 42 cadveres, no Instituto Nacional de Medicina Legal, aquando da realizao das autpsias mdico-legais, no perodo de Junho de 2003 at Janeiro de 2009.

Fizeram parte deste estudo, no s larvas em diferentes estdios de desenvolvimento quando observados durante a colheita, mas tambm, insectos adultos identificados atravs dos mtodos clssicos (morfolgicos). Os insectos adultos colhidos no foram utilizados para o estudo molecular. Estes serviram para posterior comparao da espcie obtida, atravs dos mtodos moleculares.

As

amostras

foram

colhidas

com

pinas

descartveis,

acondicionadas em tubos individuais, identificadas e preservadas em etanol absoluto, a -80C.

Quanto ao tipo de amostras de referncia colhidas aos cadveres, estas dependeram do estado de decomposio cadavrica. Preferencialmente procedeu-se realizao de mancha de sangue. Esta foi efectuada directamente sobre carto (Whatman) prprio para o efeito, identificadas e secas temperatura ambiente.

23

MATERIAL E MTODOS

Na impossibilidade da realizao de mancha de sangue foi colhida uma das seguintes amostras: fragmento de osso longo (preferencialmente fmur), dente ou unha.

Todas as amostras de referncia depois de colhidas foram preservadas a -80C e, quando necessrio, foram processadas e utilizadas para comparao com o contedo gstrico larvar.

Por cada processo foi preenchida uma ficha de colheita (Figura 1) no s com dados relativos ao cadver como autpsia mdico-legal (Tabela I), mas tambm dados referentes aos espcimes obtidos e ao exame de local.

24

MATERIAL E MTODOS

Figura 1 Ficha de colheita utilizada na recolha de dados.

25

MATERIAL E MTODOS

Tabela I Dados referentes aos 42 cadveres e exemplares colhidos. EXEMPLARES COLHIDOS

CASO

LOC

MS

CPM

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

M --M M M M M M M M M M M M M M M M M M

88 --64 72 58 50 62 59 22 38 32 69 59 71 48 55 F 35 43 35

CS - Coimbra --- - Leiria CM - Porto CS - Porto CS - Porto CS - Porto CM - Guarda CM Porto CM Porto CS - Porto CS - Porto CM - Porto CS - Porto CM - Porto CS- Porto CS- Porto CM- Porto CM - Porto CS - Porto CS - Porto

08 08 01 02 03 03 03 05 06 07 08 10 12 12 05 06 07 07 08 08

IDT --AVC Natural Natural AVC IDT IDT TCE IDT IDT TCE IDT IDT IDT IDT --IDT IDT ASF

LII LIII LIII LIII LIII + IA LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII

S sexo; I idade; LOC local de aparecimento do cadver; CPM causa provvel de morte; CS casa; CM campo; LII estdio larvar II; LIII estdio larvar III; IA insecto adulto; AVC acidente vascular cerebral; IDT indeterminada; TCE traumatismo crnio enceflico; F - feto; ASF asfixia.

26

MATERIAL E MTODOS

Tabela I (cont.) Dados referentes aos 42 cadveres e exemplares colhidos. EXEMPLARES COLHIDOS

CASO

LOC

MS

CPM

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

M M M F --M M M M M M M F M M M M F F M M F

41 66 66 66 --54 55 40 51 74 56 23 69 70 51 51 63 36 77 43 37 47

CS - Porto CM - Porto CS - Porto CS - Porto --- - Porto CS - Porto CS - Porto CS - Porto CM - Porto CS - Porto CS - Porto CM - Porto CS - Porto CS - Porto CM - Porto CS - Porto --- - Porto CM - Porto CS - Porto CS - Porto CS - Porto CS - Porto

08 08 08 08 10 04 05 05 05 01 02 03 03 04 07 10 12 12 03 03 03 03

IDT IDT ASF IDT --IDT IDT IDT IDT Natural IDT TCE Natural Natural IDT Natural IDT IDT IDT IDT IDT IM

LIII + IA LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LIII LII + IA LIII LIII LIII LIII + IA LIII LIII LIII + IA LIII LIII LIII LIII

S sexo; I idade; LOC local de aparecimento do cadver; CPM causa provvel de morte; CS casa; CM campo; LII estdio larvar II; LIII estdio larvar III; IA insecto adulto; AVC acidente vascular cerebral; IDT indeterminada; TCE traumatisco crnio enceflico; F - feto; ASF asfixia; IM intoxicao medicamentosa.

27

MATERIAL E MTODOS

3.2 EXTRACO DO DNA Todas as larvas foram retiradas dos contentores onde tinham sido depositadas aquando da colheita e colocadas numa soluo de lixvia a 20%, de modo a eliminar potenciais contaminantes externos, tal como o DNA do cadver, de acordo com Linville (Linville, 2002). Cada espcime submetido a estudo foi colocado sobre uma placa de Petri descartvel e estril e seccionado com uma lmina de bisturi descartvel atravs de uma inciso ventral. Foi utilizado o tero inferior da larva, sendo o restante preservado a -80C. A partir dos exemplares colhidos em cinco cadveres, foram seleccionadas larvas no estdio II, s quais foi removido o saco gstrico (Figura 2), sendo este depois utilizado para obteno de DNA humano.

Quanto seleco das larvas estudadas, foram unicamente analisadas larvas em estdio II, cujo saco gstrico media cerca de 1mm, uma vez que em larvas muito jovens a disseco e a remoo deste foram procedimentos que, por vezes, se revelaram impossveis de realizar, dada a dificuldade de retirar intacto o saco gstrico. Em relao s larvas mais maduras, um dos motivos para a sua no seleco, foi o facto do processamento de alimento ter tendncia a cessar em estdios mais avanados, encontrando-se muitas vezes o saco gstrico vazio.

28

MATERIAL E MTODOS

Outro dos motivos, o facto de estas larvas possuirem, geralmente, grandes concentraes de lpidos (Campobasso, 2005) o que, posteriormente, pode afectar a amplificao de DNA.

A escolha desta pea anatmica interior deveu-se por um lado, ao facto de o contedo do saco gstrico, provavelmente, no se encontrar totalmente digerido, como o do estmago ou do intestino e, por outro, diminuio da probabilidade de

contaminao do exterior da larva com o material cadavrico. O remanescente larvar foi preservado a -80C. Nos insectos adultos apenas foi utilizado o abdmen, sendo as restantes partes anatmicas preservadas para posterior

identificao morfolgica da espcie.

Nos cadveres em que foram colhidas larvas para posterior obteno de DNA humano foi, tambm, colhida uma amostra de referncia do cadver.

O DNA foi extrado atravs de diferentes processos, de modo a possibilitar a comparao entre mtodos. Todos os procedimentos de extraco realizados foram efectuados na sala de extraco e incluram um controlo negativo.

29

MATERIAL E MTODOS

Figura 2 Visualizao do saco gstrico na larva.

3.2.1 Amostras utilizadas para identificao da espcie A identificao da espcie da larva foi realizada em 314 amostras que foram submetidas a um dos seguintes mtodos de extraco: com solventes orgnicos, atravs da utilizao do kit DNeasy Tissue Kit (Qiagen) e usando o aparelho BioRobot EZ1 (Qiagen). A identificao gentica da espcie foi confirmada, sempre que a remoo do saco gstrico no impediu a identificao morfolgica, por mtodos clssicos, tarefa que foi efectuada por um entomlogo, recorrendo a chaves dicotmicas e guias entomolgicos (Smith, 1986; Chinery, 1986; Gonzlez-Mora e Peris, 1988; Peris e Gonzlez-Mora, 1991), conforme o defendido por diversos autores.

30

MATERIAL E MTODOS

3.2.1.1 Extraco orgnica Este mtodo facilita a remoo de protenas dos cidos nucleicos, utilizando solventes orgnicos, seguida de uma

precipitao com etanol absoluto.

No final deste tipo de extraco possvel obter DNA de alto peso molecular, com elevado grau de pureza e de longa durao. O protocolo de extraco orgnica utilizado neste estudo foi modificado a partir do protocolo proposto por Maniatis, 1982, que utiliza os solventes fenol e clorofrmio/lcool isoamlico (24:1). As principais alteraes ao referido protocolo consistiram em:

Adicionar ao contedo do saco gstrico 470 microlitros

(l) de tampo de extraco: 10 milimolar (Tris-HCl) (mM) a pH trishidroximetilaminometano 8.0, 2 mM EDTA (cido

hidroclorado

etilenodiaminotetractico); - 10 mM NaCl (cloreto de sdio), 1% SDS (sdio dodecil sulfato); - 10 mg/ml DTT (ditiotreitol), 0.5 mg/ml de proteinase K. Colocar as amostras em banho a 56C, durante cerca de

3 horas (h), agitar durante 5 segundos (s) e centrifugar (Eppendorf Centrifuge 5415 C) por 3 minutos (m) a 14000 rotaes por minuto (rpm);

31

MATERIAL E MTODOS

Retirar o sobrenadante, transferi-lo para um novo tubo e

adicionar 400l de fenol-clorofrmio-lcool isoamlico (25:24:1) (USB Corporation); Agitar durante 30s, centrifugar 5m a 14000 rpm e depois

retirar a fase superior para novo tubo (rejeitar o precipitado); Adicionar 600l de etanol absoluto frio e inverter

suavemente (esta precipitao vai permitir a concentrao do DNA), de seguida colocar as amostras a -20C durante 30m; Centrifugar por 15m a 14 000 rpm e no final decantar o

etanol. Secar durante 1h no DNA Speed Vac (Savant); Adicionar 25l de gua desionizada (dH2O) autoclavada; Congelar o DNA extrado a -80C, at posterior utilizao.

3.2.1.2 DNeasy Tissue Kit A extraco utilizando o kit DNeasy Tissue Kit permite uma lise celular directa, seguida de uma ligao selectiva do DNA a uma membrana de slica-gel, sem recorrer extraco orgnica ou precipitao atravs do etanol. A extraco foi efectuada de acordo com as instrues do manual DNeasy Tissue Handbook (Qiagen, 2003a), referentes ao protocolo de purificao de DNA a partir de tecidos animais.

32

MATERIAL E MTODOS

3.2.1.3 BioRobot EZ1 Este aparelho efectua de modo automtico a extraco e purificao de cidos nucleicos. A sua tecnologia envolve o uso de cartuchos isolados, que contm, entre outros componentes, partculas magnticas de slica, s quais os referidos cidos se ligam. Estas partculas, so depois separadas por uma fonte magntica, que posteriormente sofrem um processo de lavagem. Numa fase final, o DNA eludo numa soluo de baixa fora inica.

A extraco foi realizada de acordo com as indicaes do manual EZ1 DNA Handbook (Qiagen, 2004), referentes ao protocolo de purificao do DNA genmico a partir de tecidos, utilizando o carto pr-programado EZ1 DNA Forensic Card e seleccionando o volume final de eluio de 50l.

Nos estudos publicados por Montpetit, 2005 e Anslinger, 2005 so descritas as reduzidas possibilidades de contaminao entre amostras utilizando o BioRobot EZ1. Por esse motivo, neste procedimento negativos. de extraco no foram includos controlos

33

MATERIAL E MTODOS

3.2.2 Amostras utilizadas para anlise do contedo gstrico larvar (DNA humano)

O saco gstrico foi removido, efectuando uma inciso ventral na larva (em estdio II), tendo o seu contedo sido utilizado para obter DNA humano (microssatlies e DNAmt). Os mtodos efectuados para a extraco do DNA foram: extraco orgnica (descrito em 3.2.1.1), utilizao do aparelho BioRobot EZ1 (descrito em 3.2.1.3) e Chelex 100.

Cada mtodo foi efectuado em duplicado, para cada um dos cinco cadveres.

3.2.2.1 Chelex 100 O Chelex 100 uma resina quelante com grande afinidade para ies polivalentes que, por este motivo, previne a degradao do DNA em presena de ies metlicos a altas temperaturas e em condies de baixa fora inica. Segundo o protocolo de Walsh, 1991, o DNA obtido atravs desta metodologia de curta durao e de cadeia simples.

Uma vez retirado o saco gstrico larvar foi efectuado sobre ele uma inciso de modo a permitir a libertao de todo o seu contedo, o qual foi depois submetido ao seguinte procedimento:

34

MATERIAL E MTODOS

Efectuar uma mancha, em carto Whatman, a partir do

contedo gstrico larvar e deixar secar temperatura ambiente; Cortar um fragmento de aproximadamente 3mm2 dessa

mancha, adicionar 1ml de dH2O autoclavada e deixar repousar 30m. No final, centrifugar por 3m a 14000 rpm; Eliminar o sobrenadante, exceptuando apenas cerca de

30l, onde permanecer a mancha. Adicionar 170l de Chelex100 a 5% e, de seguida, colocar em banho a 56C durante 30m; Agitar durante 5s e incubar 8m em gua a ferver; Furar as tampas dos tubos com uma agulha estril; Agitar durante 5s, centrifugar durante 3m a 14000 rpm, e

congelar o DNA extrado a -80C, at posterior utilizao.

3.3 AMPLIFICAO DO DNA A amplificao enzimtica in vitro de sequncias especficas de DNA, foi efectuada pelo mtodo de reaco em cadeia da polimerase, Polymerase Chain Reaction (PCR) (Mullis, 1986). Todas as reaces de amplificao incluram um controlo negativo, decorreram num termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) e foram realizadas na sala de pr-PCR. Todos os controlos negativos includos nos procedimentos de extraco e de amplificao foram sujeitos PCR.

35

MATERIAL E MTODOS

3.3.1 Microssatlites - AmpFSTR Identifiler PCR Amplification Kit

Para o estudo de microssatlites humanos a partir do contedo gstrico das larvas, foi utilizado um sistema multiplex para amplificar quinze loci e um fragmento do gene da amelogenina. A amplificao deste fragmento gera produtos de diferentes

tamanhos dos cromossomas X e Y, sendo, por isso, utilizada para diferenciar sexos.

Os loci amplificados no sistema AmpFSTR Identifiler PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) foram: D8S1179 (Oldroyd, 1995), D3S1358 (Li, 1993), vWA (von Willebrand) (Kimpton, 1992), D21S11 (Sharma e Litt, 1992), D16S539 (Cooperative Human Linkage Center), D18S51 (Urquhart, 1995), D5S818 e D13S317 (Hudson, 1995), D7S820 (Green, 1991), TH01 (tirosina hidroxilase) (Edwards, 1992), TPOX (tiride peroxidase) (Anker, 1992), CSF1PO (c-fms protooncogene para o receptor CSF-1) (Hammond, 1994), FGA (alfafibrinognio, FIBRA) (Mills, 1992), D2S1338 (Watson, 1998), D19S433 (Lareu, 1998) e amelogenina (Sullivan, 1993).

Foram

utilizados

primers,

marcados

com

molculas

fluorescentes, que permitiram a posterior deteco e observao dos vrios fragmentos nos sequenciadores automticos ABI PRISM 310 e ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

36

MATERIAL E MTODOS

A co-amplificao do fragmento do gene da amelogenina e dos 15 loci foi realizada de acordo com o protocolo referido no manual AmpFSTR Identifiler PCR Amplification Kit Users Manual (Applied Biosystems, 2001).

3.3.2 DNA Mitocondrial Foi utilizado para amplificao de uma regio do gene do citocromo b para posterior identificao da espcie humana, o par de primers L14816 (5-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3) e H17173 (5-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3) (Eurogentec). A metodologia foi realizada de acordo com o referido em Parson, 2000. As sequncias nucleotdicas deste gene, localizado no genoma mitocondrial, so especficas de cada espcie e, como tal, podem ser utilizadas para efectuar a identificao da espcie humana.

Foram utilizados para amplificao de uma regio do gene da citocromo oxidase subunidade I (COI), para posterior

identificao da espcie, os seguintes pares de primers: C1-J-2495 (5-CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG-3) e C1-N-2800 (5-CATTTCAAG CTGTGTAAGCATC-3) ou C1-J-2495 ou e TL2-N-3014 (5-TCCAAT

GCACTAATCTGCCATATTA-3) TCCTCCAATTAT-3) e

C1-J-1687

(5-CAATTTCCAAA

TY-J-1460

(5-TACAATTTATCGCCTAAACTT

CAGCC-3) (Operon Technologies).

37

MATERIAL E MTODOS

O procedimento foi efectuado de acordo com o descrito nos trabalhos de Wells e Sperling, 1999, 2001b. Estes dois trabalhos, permitiram tambm efectuar a seleco dos primers utilizados neste estudo, uma vez que possibilitam a identificao de vrias espcies.

O par de primers C1-J-2495/C1-N-2800 foi o utilizado na totalidade das larvas. Nas sequncias em que foram obtidos resultados no satisfatrios, foram efectuadas novas amplificaes com outro dos pares de primers.

Na reaco de amplificao para DNAmt foram utilizados primers especficos, de acordo com a regio em estudo. O volume final de 25l consistiu em: 2.5l tampo GeneAmp 10X PCR Buffer(Applied Biosystems), 1.5l MgCl2 (soluo 25 Mm) (Applied Biosystems), 0.6l dNTPs (desoxinucletidos) GeneAmp 10 mM dNTP Mix (Applied Biosystems), 0.4l AmpliTaq Gold DNA polimerase 5U (Applied Biosystems), 0.5l primer forward, 0.5l primer reverse, 1l BSA 9.8mg/ml (Bovine Serum Albuminase) (Amersham Biosciences), 17l dH2O e autoclavada e 1l DNA.

Aps as reaces de amplificao o sucesso das mesmas foi comprovado em gel de agarose a 1.5% (SeaKenGTG, FMC BioProducts), ao qual foram adicionados 2ml brometo de etdio (Sigma). Seguidamente, o gel foi colocado sobre um

transiluminador (LKB, Bromma) e visualizado sobre luz ultravioleta.

38

MATERIAL E MTODOS

Para tal, a cada 3ml de produto amplificado foi adicionado 3ml de azul de bromofenol (Amresco). Foi utilizado um marcador de peso molecular de 123 pb (Invitrogen).

Para efectuar a diferenciao das espcies Calliphora vicina e Calliphora vomitoria, aps a amplificao utilizando os primers C1-N-2191 (5-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3) e C1-J-1718 (5-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3) (Operon Technologies), efectuou-se a digesto dos produtos amplificados com a enzima de restrio SfcI (Streptococcus faecium) (New England Biolabs) e a sua posterior incubao durante 1h, a 37C. As amostras foram depois submetidas a electroforese em gel de agarose a 2% com brometo de etdio, tendo os fragmentos obtidos sido corados com azul de bromofenol, visualizados num transiluminador, e comparados com um marcador de peso molecular de 123 pb. O procedimento foi realizado de acordo com o descrito em Ames, 2006.

3.4 PURIFICAO DO DNA MITOCONDRIAL Aps a amplificao, os produtos de reaco foram directamente purificados utilizando MinElute PCR Purification Kit (Qiagen). Este kit, especfico para isolar fragmentos de DNA (atravs de uma ligao selectiva a uma membrana), permite a remoo de contaminantes por lavagem, com recuperao de DNA numa percentagem de cerca de 80% (eluio).

39

MATERIAL E MTODOS

O procedimento foi realizado de acordo com o manual MinEluteHandbook (Qiagen, 2003b), e com o protocolo referente utilizao de microcentrfuga.

3.5 SEQUENCIAO DO DNA MITOCONDRIAL Na sequenciao pelo mtodo enzimtico directo, os didesoxinucletidos (ddNTPs) (terminadores) impedem a

continuao do alongamento da cadeia de DNA. Estes so molculas semelhantes aos dNTPs, aos quais falta o grupo OH no carbono 3 da desoxirribose, impedindo, deste modo, a ligao de outro dNTP. Tal facto, impossibilita o alongamento da nova cadeia de DNA sintetizada. O mtodo utiliza uma polimerase, dNTPs, ddNTPs marcados com fluorescncia e um nico primer (forward ou reverse), que permite a cpia de apenas uma das cadeias de DNA.

No final so produzidas vrias cadeias simples de DNA com terminadores incorporados, com diferentes tamanhos e que constituem a sequncia alvo.

Deste modo, procedeu-se sequenciao directa com ABI PRISM BygDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit, de acordo com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems, 2002). O volume final de 10ml consistiu em: 5.75ml dH2O e autoclavada, 1.5ml Reaction Mix, 0.75ml tampo de sequenciao 5X, 1ml primer, 1ml produto amplificado purificado.

40

MATERIAL E MTODOS

A reaco de sequenciao foi efectuada para ambas as cadeias, forward e reverse e foram utilizados, separadamente, os mesmos primers da PCR.

Os terminadores no incorporados e os excessos de primer e tampo foram directamente removidos da reaco de

sequenciao com DyeEx 2.0 Spin Kit (Qiagen). Esta remoo foi efectuada atravs de um gel de filtrao, uma resina prhidratada que separa as molculas de acordo com o seu peso molecular.

O procedimento foi realizado de acordo com o manual de utilizao DyeEx Handbook (Qiagen, 2002) e com o protocolo referente a DyeE 2.0 Spin Protocol.

3.6 SEPARAO E DETECO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS Durante a electroforese capilar com deteco automtica por fluorescncia, aps uma excitao com um laser de rgon, cada um dos fluorocromos emite o seu mximo de fluorescncia a um comprimento de onda () diferente, detectado depois pelo sequenciador automtico. Durante a recolha de dados, os sinais fluorescentes so separados por difraco de acordo com o comprimento de onda.

41

MATERIAL E MTODOS

A separao dos produtos amplificados e a sua deteco decorreu num dos sequenciadores automticos ABI PRISM 310/ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) de acordo com os manuais do fabricante. Os dados obtidos foram automaticamente recolhidos pelo ABI PRISM Data Collection Software v.3.0.0. Em relao aos microssatlites, a determinao do tamanho dos fragmentos foi automtica, tendo-se utilizado o ABI PRISM GeneScan Software Analysis v.3.7.1, mtodo Local Southern (Elder e Southern, 1987). Na sequenciao a anlise foi efectuada de forma automtica atravs do ABI PRISM DNA Sequencing Analysis Software v.3.7.

3.7 DESIGNAO ALLICA (MICROSSATLITES) A designao allica foi feita automaticamente com Genotyper Software v.3.7 por comparao com o ladder allico includo no kit e em concordncia com as recomendaes da Comisso de DNA da Sociedade Internacional de Gentica Forense (DNA Commission of the ISFH, 1997).

42

MATERIAL E MTODOS

3.8 ANLISE DAS SEQUNCIAS DE DNA MITOCONDRIAL

3.8.1 Determinao da espcie Depois da anlise automtica das sequncias, os

electroforetogramas obtidos foram confirmados. Sempre que necessrio, foram corrigidos e os respectivos ficheiros em formato FASTA (utilizado para representar sequncias) alinhados

manualmente, para permitir a posterior identificao da espcie. Para identificao da espcie, o formato FASTA da

sequncia a analisar foi submetido base de dados genticos (GenBank) disponvel online do National Center for Biotechnology Information (NCBI), utilizando o motor de busca BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Este sistema compara a sequncia que submetida com as que constam na base de dados (sequncias das diversas espcies j identificadas), de modo a estabelecer homologias.

No

final,

os

resultados

so

apresentados em

valores

percentuais, por ordem decrescente de grau de similaridade, Maximum Scoring Segment Pair (MSP), das sequncias existentes com a sequncia submetida. Ou seja, o mximo valor de MSP (100%) ser obtido para a espcie mais homloga com a sequncia submetida.

43

MATERIAL E MTODOS

3.8.2 Anlise filogentica A anlise filogentica permite determinar as relaes evolutivas entre espcies. As sequncias das espcies estudadas foram alinhadas utilizando o software SeaView (Galtier, 1996), atravs do programa MUSCLE, que permite alinhar e comparar mltiplas sequncias em formato FASTA (menu Alignement).

As sequncias com igual tamanho foram ajustadas para posterior obteno da sequncia consenso de cada espcie, utilizando a opo Consensus sequence (menu Edit). As sequncias consenso das espcies estudadas foram alinhadas e comparadas com o software ClustalX (Thompson, 1997).

3.9 ANLISE ESTATSTICA A anlise estatstica foi efectuada atravs do software PASW (ex SPSS) Statistics Base 17. Para a comparao das propores espcie-ms de ocorrncia e espcie-ambiente foi calculado o valor do teste de Qui-quadrado (X2) de Pearson, que avalia a associao existente entre duas variveis categricas no emparelhadas. Foi

considerado um nvel de significncia de 0.05.

44

MATERIAL E MTODOS

Nos casos em que as clulas apresentavam uma frequncia de indivduos inferior a 5 em mais de 20%, as espcies foram agrupadas em trs grupos: as espcies Calliphora vicina e Calliphora vomitoria, foram reunidas no grupo referente ao gnero Calliphora e as espcies Lucilia sericata, Lucilia illustris, Lucilia caesar e Lucilia ampullacea, no grupo referente ao gnero Lucilia. No que diz respeito a Chrysomya albiceps, uma vez que no existia nenhuma outra espcie que com ela pudesse ser agrupada, esta foi colocada isoladamente no grupo referente ao gnero Chrysomya. Em relao a Sarcophaga sp., uma vez que existiam apenas trs exemplares, a sua existncia no foi considerada na realizao dos clculos, por no permitir qualquer interpretao estatstica.

No que diz respeito aos diferentes meios de aparecimento dos cadveres, foram criados dois grupos: o referente a cadveres encontrados no campo (ar livre), e o relativo a cadveres cujo aparecimento se verificou dentro de casa.

45

4. RESULTADOS

RESULTADOS

4. RESULTADOS

4.1 EXTRACO DO DNA Os diferentes mtodos de extraco foram comparados nas amostras utilizadas para identificao da espcie (resultados referentes obteno de sequncias de DNAmt) (Tabela II e Figuras 3-5) e nas amostras utilizadas para anlise do contedo gstrico larvar. Nestas ltimas, os resultados so respeitantes quer obteno de sequncias de DNAmt (Tabela III e Figura 6), quer obteno de perfis de microssatlites (Tabela IV e Figuras 8 e 9). Na Figura 7 possvel visualizar o perfil obtido para a amostra de referncia do cadver.

4.1.1 Identificao da espcie

Tabela II Resultados obtidos (sequncia de DNAmt) segundo os diferentes mtodos de extraco efectuados (n= 314).

MTODO DE EXTRACO

LARVAS ESTUDADAS (n)

OBTENO DE DNAmt

Orgnica DNeasy Tissue Kit BioRobot EZ1

24 50 240

Sim Sim Sim

47

RESULTADOS

Figura 3 Uma das sequncias obtidas por extraco orgnica.

Figura 4 Uma das sequncias obtidas utilizando DNeasy Tissue Kit.

48

RESULTADOS

Figura 5 Uma das sequncias obtidas utilizando o aparelho BioRobot EZ1.

4.1.2 Anlise do contedo gstrico larvar (DNA humano)

Tabela III Sequncias de DNAmt (citocromo b), obtidas utilizando diferentes mtodos de extraco. A percentagem obtida referente ao grau de similaridade encontrada para a espcie Homo sapiens.

MTODO DE EXTRACO

DNAmt (Citocromo b) MSP

Chelex (n=10) Orgnica (n=10) BioRobot EZ1 (n=10)

97% 100% 100%

49

RESULTADOS

Figura 6 Uma das sequncias obtidas partir de uma amostra de contedo gstrico larvar, aps amplificao de uma regio do gene do citocromo b.

Tabela IV Resultados dos diferentes mtodos de extraco utilizados na anlise do contedo gstrico (kit Identifiler), de larvas colhidas em cinco cadveres. Cada mtodo foi efectuado em duplicado.

MTODO DE EXTRACO

PERFIL COMPLETO (16 LOCI)

PERFIL INCOMPLETO

AUSNCIA PERFIL

Chelex (n=10) Orgnica (n=10) BioRobot EZ1 (n=10)

7 loci (n=1) 9 loci (n=1)

n=9

7 loci (n=2) 6 loci (n=1)

n=6

7 loci (n=1) 8 loci (n=1)

n=8

50

RESULTADOS

D8S1179

D21S11

D7S820

CSF1PO

D3S1358

TH01

D13S317

D16S539

D2S1338

D19S433

vWA

TPOX

D18S51

Amelogenina

D5S818

FGA
22

Figura 7 Loci amplificados com o kit Identifiler a partir da amostra de referncia do cadver, utilizando a extraco orgnica.

D8S1179

D21S11

CSF1PO

D3S1358

D13S317

D16S539

D19S433

vWA

Amelogenina

Figura 8 Loci amplificados (Identifiler) a partir da amostra do contedo gstrico larvar, utilizando a extraco orgnica, analisada no GeneScan com o valor de 50 para o parmetro de limite de deteco.

D8S1179

D21S11

D7S820

CSF1PO

D3S1358

TH01

D13S317

D16S539

D2S1338

D19S433

vWA

TPOX

D18S51

Amelogenina

D5S818

Figura 9 Loci amplificados com o kit Identifiler a partir da amostra do contedo gstrico larvar, utilizando a extraco orgnica, analisada no GeneScan com o valor de 30 para o parmetro de limite de deteco.

51

RESULTADOS

4.2 IDENTIFICAO DA ESPCIE Na identificao da espcie foram utilizados diversos pares de primers a partir dos quais foram identificadas oito espcies de insectos, ou seja, a partir das 314 larvas estudadas foram obtidas sequncias de DNAmt, que foram posteriormente, inseridas na base de dados do BLAST e comparadas, tendo sido obtido um valor de MSP de 100% (Tabela V).

52

RESULTADOS

4.2.1 Primers C1-J-2495/C1-N-2800 - TL2-N-3014, C1-J-1687/ TY-J-1460

Tabela V Resultados obtidos para as 314 larvas, aps submisso das sequncias de no BLAST e posterior obteno de um valor de MSP de 100%.

CASO

LARVAS ESTUDADAS DNAmt (COI) MSP Chrysomya albiceps Chrysomya albiceps Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vomitoria Chrysomya albiceps Chrysomya albiceps Lucilia illustris (n) 7 2 9 6 1 8 6 7 6 1 8 8 10 2 7 1 12 7 2

1 2 3

5 6 7 8 9 10 11

12

Lucilia caesar Calliphora vomitoria

13

Calliphora vicina Calliphora vicina Calliphora vomitoria

14

53

RESULTADOS

Tabela V (cont.) Resultados obtidos para as 314 larvas, aps submisso das sequncias no BLAST e posterior obteno de um valor de MSP de 100%.

CASO

DNAmt (COI) MSP Sarcophaga argyrostoma

LARVAS ESTUDADAS (n) 3 8 1 5 2 2 1 3 1 1 5 10 1 1 1 9 10 7 8 8 2 4

15

Lucilia sericata Calliphora vomitoria

16

Lucilia sericata Calliphora vicina Lucilia sericata

17

Lucilia illustris Lucilia caesar Lucilia sericata

18

Lucilia caesar Chrysomya albiceps

19

Chrysomya albiceps Lucilia sericata Calliphora vicina

20

Lucilia illustris Lucilia ampullacea

21 22 23 24

Lucilia sericata Chrysomya albiceps Lucilia sericata Chrysomya albiceps Calliphora vicina Lucilia sericata

25

54

RESULTADOS

Tabela V (cont.) Resultados obtidos para as 314 larvas, aps submisso das sequncias no BLAST e posterior obteno de um valor de MSP de 100%.

CASO

DNAmt (COI) MSP Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vicina Chrysomya albiceps Chrysomya albiceps Calliphora vicina Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vomitoria Calliphora vomitoria Calliphora vicina Calliphora vicina

LARVAS ESTUDADAS (n) 6 1 4 7 9 6 1 7 6 7 6 7 6 7 7 3 2 6 6 6 314

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Total

55

RESULTADOS

4.2.2 Primers C1-N-2191/C1-J-1718 A amplificao da regio do gene da COI utilizando os primers C1-N-2191/C1-J-1718, produziu um fragmento de 523 pb para as 178 amostras estudadas (Figura 10). As 106 amostras de Calliphora vicina, depois de digeridas com a enzima de restrio SfcI, produziram trs fragmentos de 63, 239 e 273 pb (Figura 10, colunas 2 e 3). As 72 amostras de Calliphora vomitoria, depois de digeridas com a enzima de restrio SfcI, produziram dois fragmentos de 250 e 273 pb (Figura 10, colunas 4 e 5).

Figura 10 Fotografia do gel dos produtos amplificados: 1 - ladder de 123 pb; 2 e 3 - fragmentos digeridos, de Calliphora vicina; 4 e 5 fragmentos digeridos, de Calliphora vomitoria.

56

RESULTADOS

4.3 DISTRIBUIO DA ESPCIE As oito espcies analisadas identificadas relativamente (Grfico 1) foram de

posteriormente

frequncia

aparecimento ao longo dos diferentes meses do ano (Grficos 2-4) e diversos locais de aparecimento dos cadveres (Grfico 5).

60

N de indivduos (n)

40

20

0
Chrysomya Calliphora albiceps vicina Lucilia sericata Calliphora vomitoria Lucilia illustris Sarcophaga Lucilia sp. caesar Lucilia ampullacea

Espcie

Grfico 1 Distribuio da frequncia de indivduos identificados por espcie.

57

RESULTADOS

40
Calliphora vomitoria Calliphora vicina

N de indivduos (n)

30

Lucilia sericata Chrysomya albiceps Sarcophaga sp.

20

Lucilia illustris Lucilia caesar Lucilia ampullacea

10

0 Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez

Meses

Grfico 2 Distribuio da espcie pelos diferentes meses do ano.

40
Calliphora vomitoria Calliphora vicina

30
N de indivduos (n)

20

Lucilia sericata Chrysomya albiceps Sarcophaga sp. Lucilia illustris Lucilia caesar Lucilia ampullacea

10

0 Abr Mai Jun Meses Jul Ago Set

Grfico 3 Distribuio da espcie pelos meses que apresentam temperaturas mais elevadas.

58

RESULTADOS

40
Calliphora vomitoria

30

Calliphora vicina Lucilia sericata

N de indivduos (n)

20

Lucilia illustris Lucilia caesar

10

0 Jan Fev Mar Meses Out Nov Dez

Grfico 4 Distribuio da espcie pelos meses que apresentam temperaturas mais reduzidas.

100 90 80 70
N de indivduos (n)

60 50 40 30 20 10 0
Chrysomya albiceps Calliphora vomitoria Calliphora vicina Lucilia illustris Lucilia caesar Sarcophaga sp. Lucilia sericata Lucilia ampullacea

Casa Ar livre

Espcie

Grfico 5 Distribuio da espcie pelos diferentes meios de aparecimento dos cadveres.

59

RESULTADOS

4.4 ANLISE DAS SEQUNCIAS O estudo foi realizado a partir das sequncias obtidas (200 pb) aps a utilizao do par de primers C1-J-2495/C1-N-2800. Este par permitiu a identificao de seis espcies (MSP de 100%) e o par C1-J-1687/TY-J-1460 possibilitou a identificao de cinco espcies. Dado os melhores resultados que foram conseguidos com o par C1-J-2495/C1-N-2800, este foi o escolhido para a realizao do estudo comparativo.

Deste modo, as espcies comparadas foram Chrysomya albiceps, Calliphora vicina e Calliphora vomitria, Lucilia sericata, Lucilia illustris e Sarcophaga. O par C1-J-2495/ TL2-N-3014 foi apenas utilizado na

confirmao de alguns resultados.

As sequncias consenso obtidas para as seis espcies estudadas, aps utilizao do software SeaView, foram:

60

RESULTADOS

>C_C_Calbiceps_2800_consensus_70_a_276_en_original

CATCTATTGATATTATTTTACATGATACATATTATGTAGTAGCTCA CTTCCATTATGTTCTTTCAATAGGAGCTGTATTCGCTATTATAGCA GGATTCGTTCATTGATTCCCATTATTTACTGGATTAACTCTAAATA ATAAAATACTAAAAAGTCAATTTGCTATTATATTTATTGGAGTAAA TTTAACATTCTTTCCT

>C_Cvicina

CTTCAGTAGACATTATTCTTCATGATACATATTATGTAGTTGCCCA TTTCCATTATGTATTATCTATAGGAGCTGTATTCGCTATTATAGCA GGATTCGTTCACTGATACCCTTTATTTACAGGATTAACTTTAAATG GTAAAATATTAAAAAGTCAATTTACTATTATATTTATTGGGGTTAA TATTACATTCTTCCCT

>C_Cvomitoria

CTTCAGTAGACATTATTCTTCATGATACATATTATGTAGTTGCTCA TTTCCATTATGTATTATCTATAGGAGCTGTATTTGCTATTATAGCA GGATTTGTACACTGATACCCTTTATTTACAGGATTAACTTTAAACG GTAAAATGCTAAAAAGTCAATTTACTATTATATTTATTGGAGTAAA TATTACATTCTTCCCT

>C_C_Lillustris_2800_51_a_278_en_original

CTTCAGTTGATATTATTTTACATGACACATATTATGTAGTAGCTCA CTTTCATTATGTATTATCAATAGGAGCTGTATTTGCTATTATAGCA GGGTTCGTTCATTGATACCCTCTATTTACAGGACTAACTTTAAATG CAAAGATGTTAAAGAGTCAATTTACTATTATATTTATTGGAGTAAA TTTAACTTTCTTCCCT

>C_Lsericata_2800_consensus_47_a_268

CTTCAGTTGATATTATTTTACATGATACATACTATGTAGTAGCTCA CTTCCATTATGTTTTATCAATGGGAGCTGTATTTGCTATTATAGCA GGATTTGTTCACTGATATCCTTTATTTACAGGATTAACTTTAAATA CTAAGATATTAAAAAGTCAATTTGCTATTATATTTATTGGGGTAAA TTTAACATTCTTCCCT

>C_Sarcophaga_2800_consensus_00_a_253

CATCAATTGATATTATTTTACATGATACATATTATGTAGTAGCTCA TTTCCATTACGTACTATCAATAGGAGCTGTATTTGCTATTATAGCA GGATTTGTTCATTGATATCCCCTATTCACTGGATTAACATTAAATA CAAAAATATTAAAAAGTCAATTTACTATTATATTTATAGGAGTAAA CTTAACTTTCTTCCCT

Estas sequncias consenso foram alinhadas e comparadas atravs do software ClustalX (Figura 11).

61

RESULTADOS

Figura 11 Sequncias consenso alinhadas de cada uma das seis espcies estudadas. Os Grficos situados na base (castanho) facilitam a deteco das variaes nucleotdicas entre espcies.

Posteriormente, para os diferentes pares de espcies, foram criadas tabelas no s com as variaes encontradas (Tabela VI), nas bases nucleotdicas das sequncias, mas tambm com a sua localizao (Tabelas VII e VIII).

62

RESULTADOS

Tabela VI Nmero de variaes, nas bases nucleotdicas das sequncias, entre os diferentes pares de espcies.

TRANSIES

TRANSVERSES

TOTAL

(n)
L. sericata/L. illustris C. vicina/C. vomitoria. L. illustris/C. vomitoria L. illustris/C. vicina L. sericata/C. vomitoria L. sericata/C. vicina Sarcophaga sp./C. vomitoria Sarcophaga sp./C. vicina Sarcophaga sp./L. illsutris Sarcophaga sp./L. sericata C. albiceps/C. vomitoria C. albiceps/C. vicina C. albiceps/L. illustris C. albiceps/L. sericata C. albiceps/Sarcophaga sp.

(n) 2 2 10 10 9 9 14 14 4 7 14 14 10 7 11

(n) 18 9 24 25 22 21 29 30 21 21 29 29 25 20 24

16 7 14 15 13 12 15 16 17 14 15 15 15 13 13

supra-mencionado

software

permitiu

tambm

construo de dendogramas, no s das sequncias obtidas para as seis espcies identificadas (Figura 12), mas tambm destas em relao s sequncias (COI) depositadas no GenBank (Figura 13). Nestes dendogramas, o valor de bootstrap foi de 10000 iteraes e a espcie Caenorhabditis elegans foi a eleita como outgruop.

63

RESULTADOS

Tabela VII Transies existentes entre as bases nucleotdicas das sequncias e sua localizao (nmero da posio), entre os diferentes pares de espcies.
6 11 18 26 32 44 47 50 56 60 68 80 95 98 104 109 110 113 114 L. sericata/L. illustris C. vicina/C. vomitoria L. illustris/C. vomitoria L. illustris/C. vicina L. sericata/C. vomitoria L. sericata/C. vicina Sarcophaga/C. vomitoria Sarcophaga/C. vicina Sarcophaga/L.illsutris Sarcophaga/L.sericata C. albiceps/C. vomitoria C. albiceps/C. vicina C. albiceps/L.illustris C. albiceps/L.sericata C. albiceps/Sarcophaga
Total 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 5

5 5 8

Tabela VII (cont.) Transies existentes entre as bases nucleotdicas das sequncias e sua localizao, entre os diferentes pares de espcies.
114 119 126 132 137 138 139 140 143 146 147 152 162 179 185 197
L. sericata/L. illustris C. vicina/C. vomitoria L. illustris/C. vomitoria L. illustris/C. vicina L. sericata/C. vomitoria L. sericata/C. vicina Sarcophaga/C. vomitoria Sarcophaga/C. vicina Sarcophaga/L.illsutris Sarcophaga/L.sericata C. albiceps/C. vomitoria C. albiceps/C. vicina C. albiceps/L.illustris C. albiceps/L.sericata C. albiceps/Sarcophaga
Total

1 1 1

1 1 1 1 1 1

1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1

1 1 1

1 1 1 1 1

1 1

1 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1

1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1

1 1

1 1 1

1 1 1

64

RESULTADOS

Tabela VIII Transverses existentes entre as bases nucleotdicas das sequncias e sua localizao (nmero da posio), entre os diferentes pares de espcies.
2 5 8 20 41 59 62 65 101 109 113

L. sericata/L. illustris C. vicina/C. vomitoria L. illustris/C. vomitoria L. illustris/C. vicina L. sericata/C. vomitoria L. sericata/C. vicina Sarcophaga/C. vomitoria Sarcophaga/C. vicina Sarcophaga/L.illsutris Sarcophaga/L.sericata C. albiceps/C. vomitoria C. albiceps/C. vicina C. albiceps/L.illustris C. albiceps/L.sericata C. albiceps/Sarcophaga Total

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

8 5 8 8

Tabela VIII (cont.) Transverses existentes entre as bases nucleotdicas das sequncias e sua localizao (nmero da posio), entre os diferentes pares de espcies.
113 122 131 139 140 176 182 186 188 191

L. sericata/L. illustris C. vicina/C. vomitoria L. illustris/C. vomitoria L. illustris/C. vicina L. sericata/C. vomitoria L. sericata/C. vicina Sarcophaga/C. vomitoria Sarcophaga/C. vicina Sarcophaga/L.illsutris Sarcophaga/L.sericata C. albiceps/C. vomitoria C. albiceps/C. vicina C. albiceps/L.illustris C. albiceps/L.sericata C. albiceps/Sarcophaga Total

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

65

RESULTADOS

Figura 12 Dendograma das sequncias obtidas para as seis espcies estudadas.

Figura 13 Dendograma das sequncias obtidas para as seis espcies estudadas em relao com as sequncias das mesmas espcies, depositadas no GenBank.

66

RESULTADOS

4.5 ANLISE ESTATSTICA Nos Grficos 6 e 7 possvel observar quer a distribuio dos gneros pelos diferentes meses e locais de aparecimento dos cadveres, quer o resultado obtido para o valor de X2 para estas duas variveis.

(Abril -Setembro)

(Outubro - Maro)

Grfico 6 Distribuio do gnero pelos diferentes meses (teste de Qui-quadrado de Pearson, X2=126,6; graus de liberdade=2; p<0,001).

67

RESULTADOS

Casa

Campo

Grfico 7 Distribuio do gnero pelos diferentes locais de aparecimento dos cadveres (X2=7,922; graus de liberdade=2; p<0.019).

68

5. DISCUSSO

DISCUSSO

5. DISCUSSO

5.1 EXTRACO DO DNA

5.1.1 Identificao da espcie Os diferentes mtodos de extraco de DNA utilizados (orgnica, DNeasy Tissue Kit e BioRobot EZ1), no aparentaram revelar diferenas significativas entre si no que respeita identificao das espcies (como se pode constatar nos exemplos das Figuras 3, 4 e 5), ou seja, nos 314 espcimes estudados, para qualquer um dos mtodos utilizados, foi possvel a obteno no s de sequncias de DNAmt (Tabela II), mas tambm a obteno do valor de MSP de 100% (Tabela V).

No entanto, o mtodo escolhido para a maioria das amostras (n=240), foi o que utiliza o aparelho BioRobot EZ1. Esta escolha foi devida no s boa qualidade do DNA obtido, mas tambm ao baixo risco de contaminao que o aparelho apresenta, uma vez que os cartuchos que contm os reagentes so isolados e selados, logo reduzem ao mximo esse risco.

70

DISCUSSO

5.1.2 Anlise do contedo gstrico larvar (DNA humano) A comprovao da existncia de DNA humano, nas amostras obtidas a partir do contedo gstrico larvar, foi efectuada, aps amplificao com o par de primers L14816/H17173, atravs da visualizao de um fragmento de 358 pb do gene do citocromo b. A posterior sequenciao do referido fragmento proporcionou resultados em todas as amostras analisadas. Utilizando o mtodo de extraco orgnico e com o aparelho BioRobot EZ1 foram obtidos valores, aps submisso das

sequncias no BLAST, de 100% de MSP (Tabela III) para a espcie Homo sapiens (Figura 6). O elevado sucesso obtido nestas amostras confirma a eficincia destas duas metodologias de extraco do DNA, na anlise de sequncias de DNAmt.

No que diz respeito ao procedimento que emprega a resina quelante Chelex (Tabela III), foi verificado um decrscimo da qualidade das sequncias obtidas, consequentemente, foi

observada uma diminuio dos valores de MSP (97%). Tal poder ser devido ao facto de o DNA obtido a partir desta metodologia no apresentar, geralmente, um to elevado grau de pureza quanto o obtido com o procedimento anterior.

Foram efectuadas as amplificaes de STR autossmicos, utilizando o kit Identifiler, em trinta amostras, com a finalidade de obter DNA humano, relativamente s quais se obtiveram valores de 100% de MSP (gene do citocromo b) para a espcie humana.

71

DISCUSSO

Relativamente

aos

diferentes

mtodos

de

extraco

empregues nas amostras colhidas aos cinco cadveres, para estudo do contedo gstrico larvar, nenhum dos trs se revelou totalmente eficaz (Tabela IV). No entanto o que apresentou melhores resultados foi a extraco orgnica.

A ineficcia dos mtodos foi demonstrada pela ausncia de perfis completos (16 loci) e inexistncia de perfis em muitas das amostras.

As metodologias referentes utilizao de Chelex e ao BioRobot EZ1 produziram resultados no satisfatrios (Tabela IV). Tais resultados podem ser justificados devido grande quantidade de inibidores reaco de PCR existentes nas amostras estudadas, uma vez que todas as larvas foram colhidas de cadveres em avanado estado de putrefaco (Figura 14) ou podem ter resultado da exgua quantidade de DNA obtido aps a extraco com os mtodos anteriormente mencionados.

72

DISCUSSO

Figura 14 Fotografia de um dos cadveres do estudo, exemplificativa do avanado estado de putrefaco.

A partir da amostra que proporcionou melhores resultados, aps a comparao com uma amostra de referncia (Figura 7) do cadver, foi possvel a obteno de um perfil parcial completo (Tabela IV) para 6 (D8S1179, D21S11, CSF1PO, D3S1358, D13S317, D16S539) dos 16 loci. Este perfil foi obtido aps anlise no GeneScan com o valor de 50 Relative Fluorescent Units (RFU) para o parmetro de limite de deteco (peak amplitude threshold) (Figura 8). No entanto, se este valor for alterado para 30 RFU, possvel observar um acrscimo no nmero de loci completos, de 6 para 14 (D8S1179, D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317, D16S539, D21338, D19S433, vWA, TPOX, D5S818 e amelogenina) (Figura 9). Relativamente ao locus D18S51, este no foi considerado, porque foram obtidos trs picos, sendo que dois deles so coincidentes com o gentipo do cadver.

73

DISCUSSO

Apesar do aumento do nmero de loci completos que se conseguiu ao reduzir o valor do parmetro de limite de deteco de 50 para 30, este procedimento no foi considerado por se entender que 50 RFU o valor mnimo aceitvel para a validao de um perfil em amostras degradadas.

O sucesso obtido nesta amostra poder ser devido no s utilizao do mtodo de extraco orgnico, que geralmente produz uma maior quantidade final de DNA e com elevado grau de pureza, mas tambm, ao facto de o cadver se apresentar num estado de decomposio menos avanado do que os restantes (Figura 15).

Figura 15 Fotografia do cadver, cuja anlise do contedo gstrico larvar proporcionou melhores resultados.

74

DISCUSSO

As amostras colhidas em cadveres num estado mais avanado de putrefaco apresentam vrias caractersticas desfavorveis, que podero ser responsveis pelo insucesso da genotipagem, tais como a inibio da reaco de PCR, a degradao do DNA e as alteraes bioqumicas do DNA. Relativamente a estas alteraes bioqumicas, produzidas geralmente durante a digesto larvar, por enzimas proteolticas que quebram as ligaes peptdicas entre os aminocidos, convm referir que estas no so segregadas directamente para o saco gstrico. Porm, as enzimas presentes na saliva, que tm um papel fundamental na digesto pr-oral, so posteriormente incorporadas no saco gstrico, o que poder explicar alguma da degradao do DNA durante a digesto larvar.

Em trinta das amostras estudadas foram, posteriormente, realizados diversos procedimentos recomendados em Jarreta, 1999 e em Butler, 2005 para amostras difceis com a finalidade de reduzir o insucesso da genotipagem e promover a optimizao dos resultados. Assim, a diluio das amostras, o aumento do nmero de ciclos de 28 para 32, a amplificao com o AmpFSTR MiniFiler PCR Amplification Kit, o aumento da quantidade de DNA polimerase e a adio de albumina srica bovina reaco de PCR foram executados na totalidade das trinta amostras e em duplicado. No entanto, estes procedimentos no produziram qualquer aumento na quantidade e qualidade de resultados, no sendo por este motivo apresentados.

75

DISCUSSO

5.2 IDENTIFICAO E DISTRIBUIO DA ESPCIE Nos 42 cadveres estudados, foram identificadas um total de oito espcies (Tabela V). Todas, excepto famlia Calliphoridae: Sarcophaga sp., albiceps

pertencentes

Chrysomya

(Wiedemann), Calliphora vicina (Robineau-Desvoidy), Calliphora vomitoria (L.), Lucilia sericata (Meigen), Lucilia illustris (Meigen), Lucilia caesar (L.) and Lucilia ampullacea (Villeneuve). Estas espcies foram encontradas em estudos de

entomofauna cadavrica humana, em Itlia (Vanin, 2008) e em modelos animais (Prado e Castro, 2005), em Portugal. No presente estudo as espcies Chrysomya albiceps,

Calliphora vicina e Calliphora vomitoria foram as mais constantes (Grfico 1).

O par de primers C1-J-2495/C1-N-2800 foi utilizado na totalidade das larvas. No entanto nas espcies Chrysomya albiceps, Calliphora vicina, Calliphora vomitoria, Lucilia sericata e Lucilia caesar os resultados foram confirmados com os primers C1-J2495/TL2-N-3014. Na diferenciao das espcies Calliphora vicina e Calliphora vomitoria, utilizando os pares de primers supra-mencionados, por vezes, no foi possvel a obteno de um valor de MSP de 100%. Nestes casos foram utilizados em alternativa os primers C1-N2191/C1-J-1718 (Figura 10).

76

DISCUSSO

Com o par de primers C1-J-1687/TY-J-1460 foi possvel obter um valor de MSP de 100% para as espcies Chrysomya albiceps, Calliphora vicina, Lucilia caesar, Lucilia sericata e Lucilia

ampullacea.

Tal

como

descrito

noutros

estudos

(Schroeder,

2003b;

Arnaldos, 2004), a maior diversidade de espcies foi encontrada em cadveres cujo aparecimento ocorreu durante os meses que apresentam temperaturas elevadas (Grfico 2). Durante o perodo de Abril a Setembro, as oito espcies identificadas neste estudo puderam ser observadas na sua totalidade (Grfico 3), sendo a espcie Chrysomya albiceps a mais constante. A espcie Lucilia sericata foi a segunda mais frequente nos meses que apresentam temperaturas mais elevadas, o que est em conformidade com o descrito por Schroeder, 2003b. No entanto, foi possvel observar esta mesma espcie no ms de Janeiro (Grfico 4). Tal pode ser devido fenologia exibida por esta espcie, uma vez que existem registos da sua existncia na poca de Vero, em Itlia (Raffone, 2005) e, paralelamente, a sua colheita em cadveres humanos no Inverno, em Espanha (Arnaldos, 2005).

Deste modo, a colheita de evidncias entomolgicas pertencentes a esta espcie no dever ser utilizada durante os meses que apresentam temperaturas mais elevadas, uma vez que esta espcie tambm se encontra activa durante os meses considerados mais frios.

77

DISCUSSO

A semelhana das espcies encontradas em zonas com proximidade geogrfica, como Portugal e Espanha, durante os mesmos meses, sugere que podero ser tidos em conta os dados entomolgicos para comparao de ambos os pases, tendo em considerao as espcies anteriormente referidas.

Em cadveres encontrados durante os meses que exibem baixas temperaturas, apenas cinco, das oito espcies identificadas, foram observadas, sendo a espcie Calliphora vicina a mais frequente (Grfico 4). As espcies Lucilia ampullacea, Sarcophaga sp. e

Chrysomya albiceps no foram possveis de observar durante este perodo. No entanto, de modo diferente do que aconteceu neste estudo, a espcie Chrysomya albiceps foi observada com frequncia, durante os meses que apresentam temperaturas mais reduzidas em Espanha (Arnaldos, 2005).

Neste

estudo, dos

em

relao foi

aos

diferentes

locais uma

de

aparecimento

cadveres,

observada

maior

diversidade de espcies em cadveres encontrados no campo (ao ar livre) (Grfico 5). Neste habitat, predominantemente rural, a espcie Calliphora vomitoria foi a mais observada e as espcies Lucilia illustris, Lucilia caesar e Lucilia ampullacea foram exclusivas deste meio ambiente. A espcie Calliphora vicina foi a predominante em

cadveres encontrados dentro de casa. Estes dados so consistentes com os obtidos no estudo de Anderson, 1995.

78

DISCUSSO

Espcies sinantrpicas como Calliphora vicina e Lucilia sericata foram maioritariamente identificadas no estudo de Vanin, 2008, em cadveres que se encontravam dentro de casa.

A colheita de outras espcies sinantrpicas como Lucilia caesar e Lucilia illustris em cadveres encontrados ao ar livre, foi tambm verificada no estudo do referido autor. Este autor explica que tal pode ser devido grande densidade populacional das zonas rurais onde os cadveres foram encontrados. Explicao anloga pode ser considerada para Portugal e para este estudo. Estas observaes conferem grandes implicaes de

interpretao dos dados entomolgicos colhidos em regies rurais com caractersticas urbanas, uma vez que estes dados no podero ser utilizados para confirmar ou infirmar o transporte e/ou a mudana de um local para outro de um determinado cadver, dentro de uma mesma rea geogrfica.

5.3 ANLISE DAS SEQUNCIAS A comparao das sequncias consenso das seis espcies estudadas pode ser visualizada na Figura 11 e o nmero de variaes nucleotdicas existentes em cada par de espcies, na Tabela VI. Da anlise da Figura 11 e da Tabela VI possvel observar que o par composto pelas espcies Calliphora vicina e Calliphora vomitoria apresenta nove variaes, sendo que sete delas correspondem a transies e duas delas a transverses.

79

DISCUSSO

As transies podem ser visualizadas nas posies 44, 80, 98, 137, 146, 147, 179 e as transverses nas posies 101 e 182 (Tabelas VII e VIII). O par Lucilia sericata e Lucilia illustris exibe dezoito variaes formadas por dezasseis transies localizadas nas posies 26, 32, 50, 68, 95, 98, 104, 110, 114, 126, 138, 140, 146, 152, 162, 179 e duas transverses nas posies 59 e 191 (Tabelas VII e VIII). Em relao ao par Chrysomya albiceps e Sarcophaga sp. possvel observar vinte e quatro variaes compostas por treze transies observadas nas posies 47, 56, 80, 98, 109, 110, 114, 119, 132, 147, 162, 185, 197 e onze transverses, nas posies 5, 59, 62, 113, 131, 139, 140, 176, 186, 188 e 191. O maior nmero de variaes existente neste par em relao aos pares anteriores poder ser explicado pelas diferenas morfolgicas e genticas existentes entre estas duas espcies.

Aps a visualizao das Tabelas VII e VIII possvel verificar que o nmero de transies superior ao de transverses e que nas posies 109, 113, 139 e 140 podem ser observados ambos os tipos de variaes.

O valor de bootstrap permite confirmar o significado dos resultados da anlise filogentica. Assim, aps visualizao do dendograma (Figura 12) possvel observar que a fora dos grupos reduzida, excepto no n referente s espcies Calliphora vicina e Calliphora vomitoria, no qual foi obtido um valor de 9968.

80

DISCUSSO

As espcies irms Lucilia sericata e Lucilia illustris, apesar de morfologicamente semelhantes, encontram-se distantes entre si. Uma vez que cada uma das espcies contm variaes prprias, possvel considerar que as sequncias consenso obtidas neste estudo so especficas da espcie em questo. Esta especificidade possui um elevado valor em Gentica Forense, uma vez que as sequncias podem ser utilizadas como sequncias de referncia para a identificao de qualquer espcime cuja identificao no tenha sido possvel de realizar, mediante os mtodos clssicos,

No dendograma onde possvel visualizar a comparao das sequncias obtidas neste estudo, com as sequncias das mesmas espcies includas no GenBank (Figura 13), podemos constatar que os valores de bootstrap obtidos entre os pares homlogos foram muito elevados. Sendo que, nas espcies Chrysomya albiceps, Lucilia sericata e Sarcophaga sp. atingiu o valor mximo de 10000. Para as espcies Calliphora vicina e Calliphora vomitoria, este valor foi de 9999 e para a espcie Lucilia illustris de 9933. Estes valores so fortes indicadores de que as sequncias do gene da COI se encontram altamente conservadas e, como tal, so adequadas para a identificao de espcies entomolgicas. As sequncias dos exemplares contidos na base de dados do GenBank, possuem diferentes procedncias geogrficas.

81

DISCUSSO

Deste modo, o elevado valor de coincidncia entre as sequncias consenso das espcies submetidas no GenBank e as espcies que fizeram parte deste estudo, reala as escassas diferenas que existem entre populaes com origens geogrficas distintas.

5.4 ANLISE ESTATSTICA Verificou-se a existncia de diferenas significativas do gnero de acordo com o ms (X2=126, 6; graus de liberdade (g.l.)=2; p<0.001). Os gneros Lucilia (79,4%) e Chrysomya (98,6%) ocorrem, maioritariamente, nos meses que apresentam

temperaturas mais elevadas e o gnero Calliphora (73,6%) pode ser encontrado mais facilmente nos meses considerados mais frios. Nos meses que exibem temperaturas mais altas este gnero apenas ocorre 26,4% (Grfico 6). Nos meses que apresentam temperaturas reduzidas, os gneros Lucilia (20,6%) e Chrysomya (1,4%) so menos frequentes.

Em relao varivel meio de aparecimento do cadver, foi observada a existncia de diferenas significativas dos gneros, de acordo com o local (X2=7, 922; g. l.=2; p<0.019). Assim, nos cadveres encontrados dentro de casa o gnero Chrysomya foi o encontrado com maior frequncia (80%), seguido dos gneros Calliphora (64%) e Lucilia (58,7%) (Grfico 7).

82

DISCUSSO

5.5 CONSIDERAES FINAIS Este estudo no inclui todas as espcies que podero ser encontradas durante a realizao da autpsia mdico-legal, mas poder ser representativo da ocorrncia das principais espcies de interesse forense em Portugal.

Devero ser efectuadas colheitas adicionais, de modo a aumentar o conhecimento sobre as espcies existentes nesta rea geogrfica, de modo a que possam ser utilizadas para a estimativa do IPM.

Os mtodos filogenticos e de genotipagem encontram-se profusamente descritos e so com frequncia utilizados por geneticistas moleculares e peritos forenses em DNAmt, na resoluo de percias (Wells, 2007b). No entanto, a colaborao de entomlogos forenses nas percias que envolvam evidncias entomolgicas dever ser constante e privilegiada.

Este trabalho poder servir como estrutura inicial de uma base de sequncias de DNAmt das principais espcies com interesse forense em Portugal.

Estes dados entomolgicos podero ser utilizados em percias forenses, de modo a optimizar a sua celeridade, uma vez que os mtodos clssicos pressupem um perodo mais prolongado de tempo, de estudo e, consequentemente, um conhecimento dos resultados mais demorado.

83

6. CONCLUSES

CONCLUSES

6. CONCLUSES
1 Os diferentes mtodos de extraco de DNA utilizados com a finalidade de identificar a espcie no revelaram diferenas significativas entre si. Todavia, o mtodo de extraco orgnica foi o que demonstrou maior sensibilidade nas amostras utilizadas para anlise do contedo gstrico larvar (DNA humano).

2 A diversidade e especificidade de espcies colhidas nos cadveres encontrados durante os meses que apresentam temperaturas mais elevadas so significativas relativamente aos cadveres encontrados durante os meses mais frios.

3 Os cadveres encontrados em espao aberto apresentaram espcies especficas e mais diversificadas, em relao aos cadveres encontrados dentro de casa.

4 Este estudo estabeleceu uma base de dados entomolgicos de sequncias de DNAmt das principais espcies de Dpteros, que colonizam cadveres humanos em Portugal.

Este

trabalho

permite

acrescentar

dados

entomolgicos

relevantes ao conhecimento da entomofauna em Portugal e poder ser utilizado em percias forenses.

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