UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA LABORATRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZO-ASAMI

Nereide Stela Santos Magalhes Recife, 2004

EVOLUO DA NANOTECNOLOGIA FARMACUTICA

LIPOSSOMAS LIPOSSOMAS, NANOPARTCULAS NANOPARTCULAS
STEALTH

CONVENCIONAL

LIPOSSOMAS NANOPARTCULAS STIO-ESPECFICOS

- Metacrilatos - Alquilcianoacrilatos - Biodegradveis Polmeros pr-formados PLA PLGA PCL Nanocpsulas Nanoesferas

PLA-PEG PLGA-PEG PCL-PEG Nanocpsulas Nanoesferas Lipossomas

Lipossomas-PEGLectina Nanocpsulas Nanoesferas

2000
Dex- PLA Dex- PCL

1990
Groupo SLC/UFPE Convencional Nanocpsulas Lipossomas

Polimerizao in

situ

1980

DextranaPCL-Lectina

Nanopartculas

1970

Lipossomas

Descritos inicialmente em 1965

Alec D. Bangham

Vesculas esfricas formadas por bicamadas lipdicas com capacidade de incorporar compostos hidroflicos e hidrofbicos.

LIPOSSOMAS

Estrutura das Membranas Biolgicas

Figura 1. Arquitetura supramolecular das membranas

Leningher, 2000

Fosfolipdeos

Agregao em gua

Estruturas Lipdicas

Figura 2. Agregados de lipdeos anfipticos dispersos em gua

Leningher, 2000

Movimentos dos Lipdeos na Estrutura das Membranas Biolgicas

Leningher, 2000

Estruturas Lipdicas
Monocamadas e micelas
Em meio aquoso, os lipdeos formam espontaneamente estruturas. Monocamadas (baixas concentraes) Micelas (altas concentraes)
CMC = concentrao crtica micelar)

Bicamadas lipdicas Vesculas

Lipossomas

Lipossomas
Compartimento interno aquoso

Micela

Bicamada

Lipossoma

www.cm.utexas.edu/.../overheads-2/ ch12_lipid-bilayer.jpg

Interaes no covalentes nas bicamadas lipdicas

As bicamadas lipdicas possuem tendncia inerente a serem extensas As bicamadas lipdicas podem fecharem-se sobre si mesmas e formar vesculas. As bicamadas lipdicas so auto-selantes, pois um orifcio na bicamada energeticamente desfavorvel.

Interaes no covalentes nas bicamadas lipdicas

Hidrofbicas Foras atrativas de van der Waals
Caudas hidrocarbonadas

Atraes eletrostticas Pontes de hidrognio

Cabeas polares gua Molculas de gua so liberadas das caudas hidrocarbonadas dos lipdeos quando essas caudas ficam sequestradas no interior apolar da bicamada.

Transio de Fases em Bicamadas

As transies de fases so sempres endotrmicas; o calor absorvido enquanto a temperatura aumenta durante a transio. Fosfolipdeos apresentam temperaturas de transio de fase especficas Tm: aumenta com o comprimento da cadeia aliftica, diminui com a insaturao e depende da natureza do grupo polar da cabea.

Transio de Fases em Membranas

T<Tm
Bicamada organizada com cadeias alifticas relativamente imobilizadas (conformao extendida mxima), rea superficial / lipdeo mnima Espessura da bicamada mxima

T>Tm
Fase cristalina lquida (mobilidade das cadeias alifticas intermediria entre os estados slido e lquido de alcanos). rea superficial / lipdeo aumenta. Espessura da bicamada diminui de 10 a 15%.

Transio de Fases em Bicamadas

Em bicamadas de fosfolipdeos puros, a transio ocorre em faixa estreita de temperatura. Ex:
Tm dimiristoilfosfatidilcolina = 0,2oC.

Membranas biolgicas apresentam faixa larga de transio de fase e dependem fortemente da composio dos lipdeos e protenas.

Transio de Fases em Bicamadas

Para certas bicamadas de lipdeos, uma modificao no estado fsico, chamada de pr-transio, ocorre de 5 a 15oC abaixo da Tm. Estas pr-transies envolvem inclinao das cadeias hidrocarbonadas. Geralmente a fase de transio est relacionada com uma modificao de volume. A transio de fase da bicamada muito sensvel presena de solutos que interagem com os lipdeos, tais como ctions divalentes, substncias lipossolveis, peptdeos e protenas.

Lipossoma

Internalizao de lipossomas por clulas

LIPOSSOMAS
DEFINIO So vesculas aquosas, de dimetro entre 0,1 e 0,5 m, contitudas de uma ou mais membranas fosfolipdicas de origem natural. O princpio ativo pode estar encapsulado na fase aquosa (hidroflico) ou ser retido pela membrana (lipoflico).

GLICEROFOSFOLIPDEOS
FOSFOLIPDEOS
Principais constituintes das membranas biolgicas

cido fosfatdico Fosfatidilcolina (lecitina) Fosfatidiletanolamina Fosfatidilglicerol Difosfatidilglicerol (cardiolipina) Fosfatidilserina Fosfatidilinositol

COMPOSIO DOS LIPOSSOMAS

Lipdeos
Fosfatidilcolina de ovo Diestearilfosfatidilcolina Dipalmitoilfosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina Lisofosfatidilcolina Colesterol

Caractersticas
constituinte principal e o mais utilizado menos permevel fase aquosa fosfolipdeo sinttico totalmente saturado utilizado em imunolipossomas aumenta a permeabilidade lipossomal pode aumentar a fuso lipossoma-clula reduz a permeabilidade dos lipossomas Incorporao mxima: 50 mol% com relao aos fosfolipdeos totais confere carga positiva aos lipossomas confere carga negativa aos lipossomas confere carga negativa aos lipossomas utilizado em imunolipossomas lipdeos antignicos utilizados em imunolipossomos

Estearilamina Dicetilfosfato cido fosfatdico Esfinomielina Cardiolipdeos

VANTAGENS
So biodegradveis No possuem antigenicidade Protegem as drogas contra a ao enzimtica Reduz a toxicidade das drogas Podem ser direcionados ao local de ao pela adio de sinais moleculares, anticorpos monoclonais, hormnios ou glicolipdeos

Classificao

SUV
20-100 nm 0,5 a 1,0

LUV
> 100 nm 5 a 15

MLV
> 0,5m 35 a 65

Vesculas multilamelares: MLV (Multilamellar Vesicles) Vesculas pequenas unilamelares: SUV (Small Unilamellar Vesicles) Vesculas grandes unilamelares: LUV (Large Unilamellar Vesicles)

LIPOSSOMAS

www.drugdeliveryparternships.com/html

MTODOS DE PREPARAO DE LIPOSSOMAS

Mtodos mecnicos de Disperso de fosfolipdeos Hidratao de filme lipdico Homogeneizao por ultra-som Homogeneizao por extruso Microfluidificao Disperso de lipossomas liofilizados Disperso de lipossomas congelados

MTODOS DE PREPARAO DE LIPOSSOMAS

Mtodos mecnicos de Disperso de soluo orgnica de fosfolipdeos
Evaporao em fase reversa Injeo em soluo etanlica Infuso em ter

Disperso de micelas mistas

Eliminao de detergente

Metodologia
Preparao de Lipossomas

Filme lipdico

Lipids

Solvent evaporation

Ultrasound

Liposomes

MLVs

Aqueous phase SUVs

+ -glu-SO4

Metodologia
Preparao de Lipossomas
CHCl3 : MeOH Fosfatidilcolina de soja - Epikuron 200 Colesterol Estearilamina (Acido snico) Filme lipdico Hidratao com Tampo Fosfato pH 7,4

MLVs

SUVs

Sonicao
www.avantilipids.com/ PreparationOfLiposomes2B

Lipossomas Branco

Lipossomas c.Usnico

CONSERVAO DE LIPOSSOMAS
Mtodos de Conservao
Atmosfera de nitrognio ou argnio Temperatura 4C Abrigo da luz Liofilizao

CONSERVAO DE LIPOSSOMAS
Alteraes morfolgicas e fsicoqumicas
Oxidao e hidrlise de fosfolipdeos Interaes do tipo Van der Waals
Agregao Presena de cargas negativas ou positivas

CARACTERIZAO DE LIPOSSOMAS
Obteno de uma preparao homognea Determinao do tamanho das vesculas Taxa de encapsulao Estabilidade fsico-qumica Cintica de liberao in vitro Estabilidade em fluidos biolgicos Interao com clulas Biodisponibilidade

CARACTERIZAO DE LIPOSSOMAS
Estabilidade Fsico-qumica Aspecto macroscpico Aspecto microscpico Dimetro das partculas Viscosidade Condutividade pH Potencial de superfcie (zeta) Temperatura de conservao Doseamento do frmaco

CARACTERIZAO DE LIPOSSOMAS
Estabilidade Fsico-qumica Aspecto macroscpico
Observao visual
Cor Cremagem Exsudato Precipitado Separao de fase

CARACTERIZAO DE LIPOSSOMAS
Estabilidade Fsico-qumica Aspecto microscpico
Microscopia tica (LUV, MLV) Microscopia Eletrnica
Varredura (observao tridimensional da vescula) Transmisso (observao de MLV) Fora atmica (caracterizao da superfcie)

TITULO

Lipossomas

Lipossomas cido Usnico

Aspecto microscpico de lipossomas contendo cido snico: Partculas uniformes bem distribudas com tamanho de aproximadamente 130 nm.

DETERMINAO DO TAMANHO DE VESCULAS

MICROFOTOGRAFIA DE LIPOSSOMAS

TCNICA DE CRIOFRATURA

CARACTERIZAO DE LIPOSSOMAS
Determinao do tamanho das vesculas
Contador de partculas Nanosizer
Espectroscopia de auto-correlao de ftons Espalhamento da luz (light scattering)

Determinao do potencial de superfcie Potencial zeta (carga)

NANOSIZER (PCS)

NANOSIZER

CARACTERIZAO DE LIPOSSOMAS
Taxa de encapsulao
Doseamento do frmaco Porcentagem de encapsulao Massa de substncia encapsulada por unidade de massa de lipdeo

Metodologia
Taxa de encapsulao de frmacos em lipossomas

Determinao indireta
A percentagem de incorporao de frmacos em lipossomas pode ser quantificada por HPLC, aps separao do frmaco encapsulado do no encapsulado, atravs de uma ultrafiltrao-centrifugao utilizando unidades filtrantes ultrafree (Millipore).

CARACTERIZAO DE LIPOSSOMAS
Influncia de diferentes fatores sobre a taxa de encapsulao
Caractersticas do frmaco Mtodos deficientes de separao e marcao
Substncias hidrossolveis Substncias lipossolveis e anfiflicas Caso particular de protenas DNA

ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS
Estabilidade Fsico-qumica Acelerada
Centrifugao Ciclos de congelamento-descongelamento (8 h a -18C e 16 h a 25C) Agitao mecnica (150 evolues/min)
Movimento horizontal

ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS
Estabilidade Fsico-qumica A longo prazo Medida de parmetros fsico-qumicos em intervalos de tempo regulares (1, 15, 30, 60, 180, 360, etc dias)
Tamanho das vesculas Doseamento do frmaco
Viscosidade Condutividade pH

Avaliao dos aspectos macroscpico e microscpico

Metodologia
Avaliao da cintica de liberao in vitro
Direta Indireta Dilise Dilise inversa

Meio receptor Tampo

Meio doador Lipossomas

Lipossomas
Avaliao da atividade em clulas
100 80 60 40 20 0 2.5 5 10 20 C once ntration g/ml UA Free Lip Cont Lipos AU

% ce ll viability

% cell viability

100 80 60 40 20 0 2.5 5 10 20 Conce ntration g/ml UA Free Lip Cont Lipos AU

Teste de citotoxicidade em clulas HEp-2

Teste de citotoxicidade em clulas NCIH-292

Citotoxicidade de lipossomas contendo cido snico

LIPOSSOMAS COMO MARCADORES

ENDOCITOSE LIPOSSOMAL

VIAS DE ADMINISTRAO

VIAS de ADMINISTRAO DE LIPOSSOMAS

Parenteral (i.v.; i.m.; s.c.;i.c.) Cutnea Oftlmica Nasal Pulmonar

NANOTECNOLOGIA FARMACUTICA Lipossomas (Injetveis)

Terapia do Cncer
resistncia multi-droga Cardiotoxicidade

Doenas Infecciosas Terapia Gnica

Lipossomas (Tpicos)
Farmacuticos Cosmticos

APLICAES TERAPUTICAS DE LIPOSSOMAS

Antibioticoterapia
Insuficincia respiratria neonatal (surfactante pulmonar) Enzimas Hormnioterapia Produtos de contraste Produtos radiofarmacuticos DNA Vacinas

APLICAES TERAPUTICAS DE LIPOSSOMAS

Antiparasitrios Agentes quelantes Antitumorais Insulina

LIPOSSOMAS ESTERICAMENTE ESTABILIZADOS

PRODUTOS LIPOSSOMAIS
Produto
Cncer DaunoXome Doxil Evacet Annamycin Cisplatin Atragen Edelfosine Infeces AmBisome Nyotran MiKasome Amphotericin B Nistatina Amikacina
NeXstar Aronex NeXstar Aprovado Europa, US Fase III

Frmaco
Daunorubicina Doxorubicina Doxorubicina Anamicin Cisplatin Tretinoina Edelfosina

Companhia Status
NeXstar Sequus (Alza) Liposome Co. Aronex Aronex Aronex Liposome Co. Aprovado Europa, US Aprovado Europo, US Fase III Fase I/II Fase II Fase I/II Fase I

Fase II/III

Targeted

www.cwru.edu/menu/research/drugdelivery.htm

APLICAES DE LIPOSSOMAS
Cosmetologia
Vitaminas hidro e lipossolveis Agentes hidratantes Elastina Colgeno cido hialurnico

APLICAES DE LIPOSSOMAS Cosmetologia

Anti-radicais livres Antioxidantes Agentes rejuvenecedores (remoo de colesterol)

APLICAES DE LIPOSSOMAS
Farmcia de Manipulao
Incorporao de lipossomas pr-fabricados em
Cremes Protetores solares Gel Gel creme Xampu

CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS CONTENDO LIPOSSOMAS

Observao macroscpica
observar a preservao das caractersticas iniciais do produto e detectar sinais de instabilidade

Observao microscpica
detectar a presena dos lipossomas na preparao

Determinao do ativo