GENOTIPAGEM

A- DE LEVEDURAS (HAPLIDES E DIPLIDES) :

1- Com o auxlio de um palito, semear as leveduras (em pinheirinho) nas placas de meio YPD e meios seletivos. Para determinao do mating-type, realizar cruzamento com as leveduras haplides padres MATa e MAT de acordo com o protocolo de cruzamento de leveduras. 2- Incubar as placas nas temperaturas adequadas. 3- Aps 24 a 48 horas de incubao, as placas para a determinao de mating-type devem ser replicadas com o auxlio de veludo estril em placas de meio SD. Incubar novamente na temperatura adequada por 24 a 48 horas. 4- Ler o resultado da genotipagem.

B- DOS HAPLIDES OBTIDOS NA DISSECO DE TTRADES (utilizar microplaca) :

1- Crescer as clulas haplides provenientes de cada ascsporo - passar cada uma das colnias em uma nova placa de YPD (risquinhos), e incubar a 25C ou 30C por um ou dois dias. 2- Em uma microplaca estril colocar 50L/poo de glicerol 50%. 3- Com um palito, suspender cada haplide em um poo da microplaca e homogeneizar bem. Anotar a ordem em que os haplides so colocados na microplaca. 4- Flambar o replicador e deixar esfriar bem. 5- Transferir os haplides da microplaca para placas de meio YPD e meios seletivos com o auxlio do replicador. No final, transferir os haplides para as placas recm replicadas com as leveduras haplides padres MATa e MAT (o replicador deve ser flambado entre cada aplicao). 6- Incubar as placas nas temperaturas adequadas. 7- Aps 24 a 48 horas de incubao, as placas para a determinao de mating-type devem ser replicadas com o auxlio de veludo estril em placas de meio SD. Incubar novamente na temperatura adequada por 24 a 48 horas. 8- Ler o resultado da genotipagem, anotando em formulrio adequado. Obs: o crescimento no meio que recebeu a levedura padro MATa indica que o haplide de mating-type , e vice-versa.

MEIOS DE CULTURA PARA GENOTIPAGEM:

SC Leu SC Ura SC Trp SC Lys SC Ade SC His o YPD para controle de crescimento (25C ou 30 C) e para determinao de termo-sensibilidade (diversas temperaturas) YPD com MATa YPD com MAT Outros, dependendo dos gentipos analisados (por exemplo, YPD+antibiticos).

Protocolos Sandro R. Valentini