AT

R375 Reis, Sonia Rolim

Manual bsico de bioterismo / Sonia Rolim Reis, Antonia Maria
Ramos Franco. --- Manaus : [s.n.], 2012.
47 p. : il. color.

Elaborao Projeto Fronteiras: Alto Rio Negro; apoio FINEP,
Financiadora de Estudos e Projetos.
Inclui sugesto de referncias para leitura.
ISBN:


1. Biotrios Medida de segurana. 2. Experncia com animais
Medida de segurana. 4. Animais de laboratrio. 5. Biossegurana.
6. Biotica. I. Franco, Antonia Maria Ramos. II. Ttulo.


CDD 19. ed. 636.0885
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Sonia Rolim Reis
Antonia Maria Ramos Franco
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Agradecimentos
Homenagem
Deus!
Aos nossos pais e esposos e
aos nossos flhos, pela pacincia e dedicao,
com muito amor e carinho.
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Sumrio
Introduo...........................................................................................................9
1. As barreiras sanitrias....................................................................................10
2. Espcies mais utilizadas em pesquisas........................................................10
3. Classifcao dos animais quanto ao status sanitrio................................11
4. Fatores ambientais em um biotrio............................................................12
4.1. Temperatura...............................................................................................12
4.2. Umidade......................................................................................................12
4.3. Ventilao e renovao do ar...................................................................13
4.4. Luz e fotoperodo......................................................................................14
4.5. Rudo............................................................................................................14
4.6. Caixas e gaiolas...........................................................................................14
4.7. Cama das gaiolas........................................................................................15
4.8. Alimentao e gua...................................................................................16
4.9. Manejo e comportamento........................................................................16
4.10. Higiene e limpeza.....................................................................................17
5. Normas de segurana...................................................................................18
6. Eutanasia........................................................................................................19
Captulo I Das normas gerais......................................................................20
Captulo II Dos procedimentos..................................................................20
Captulo III Dos mtodos recomendados.................................................20
Anexo I..............................................................................................................22
Bibliografa.........................................................................................................25
Prtica de disseco de febotomneos..........................................................29
Coleta de material para demonstrao direta do parasito...........................33
Prtica de colorao de lmina para diagnstico de leishmaniose............34
Colorao giemsa..............................................................................................36
Isolamento de parasitas em meio de cultura NNN agar sangue...............37
Sugesto de referncias....................................................................................39
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Introduo
Este manual descreve de modo sucinto os aspectos importantes
na utilizao de animais de laboratrio. Aborda os parmetros fsicos, qu-
micos e biolgicos preconizados em biotrio de Experimentao Animal,
bem como, as principais normas de biossegurana que devem ser empre-
gadas.
O livro proporciona o conhecimento das tcnicas e das necessi-
dades bsicas no manejo de animais de laboratrio, enfocando, principal-
mente, a questo da tica, do bem-estar animal. Dessa forma, o manual,
resultado da observao das necessidades principalmente quanto a boas
prticas no manejo com animais de experimentao, oferece uma contri-
buio de grande relevncia, apresentando ao leitor os diversos aspectos
do bioterismo no momento em que se verifca uma profunda mudana
nos padres das pesquisas realizadas no Brasil. Literatura essencial para
profssionais da rea, incluindo os de nvel tcnico e os ps-graduandos
que fazem uso de animais de experimentao no desenvolvimento de suas
pesquisas.
O manejo adequado de animais de laboratrio implica na interao
de diversos fatores sejam estes fsicos, qumicos, biolgicos e da responsa-
bilidade e profssionalismo do bioterista.
Biotrios so as instalaes capazes de produzir e manter espcies
animais destinadas a servir como reagentes biolgicos em diversos tipos
de ensaios controlados, para atender as necessidades dos programas de
pesquisa, ensino, produo e controle de qualidade nas reas biomdicas,
farmacolgicas e biotecnolgicas segundo a fnalidade de cada Instituio.
necessrio que os biotrios sejam construdos amparados em
rgidos critrios de biossegurana e em tambm quanto sua organizao
funcional, espacial, permitindo assim a criao ou a experimentao ani-
mal, dentro dos padres preconizados de higiene, assepsia e segurana,
necessrios obteno ou a utilizao de diferentes espcies animais.
9
1. As Barreiras Sanitrias
As barreiras sanitrias so imprescindveis nos biotrios de Criao
e Manuteno/Experimentao. So defnidas como mecanismos fsicos,
qumicos e biolgicos que difcultam ou minimizam os efeitos da intera-
o entre agentes biolgicos de risco com o homem e o animal e que so
necessrias de acordo com o grau de risco do agente envolvido.
So exemplos de barreiras sanitrias: materiais utilizados na constru-
o dos Biotrios (isolantes trmicos, impermeabilizantes), equipamentos
para a fltrao de ar, autoclaves, higiene pessoal da equipe de funcionrios
do setor e dos usurios de animais, presso diferencial entre ambientes,
compostos qumicos utilizados em desinfeco e esterilizao, etc.
O ambiente do biotrio requer cuidados rigorosos, pois os animais
vivem em ambientes artifciais, recebem dieta padronizada e, na maioria
dos experimentos, as doenas so artifcialmente induzidas. Estes animais
dependem totalmente do tcnico responsvel pelo biotrio para suprir
suas necessidades nutricionais e pelo seu bem estar.
Deve-se tambm obter apenas animais com padro sanitrio def-
nido, adotando-se barreiras sanitrias efcientes no biotrio, para diminuir
as chances de contaminao, pois isto poderia ocasionar doena ou morte
destes animais propiciando falhas nos resultados das pesquisas.
necessrio o monitoramento cuidadoso da sade dos
animais e dos tcnicos a fm de se evitar doenas que podem
ser transmitidas do homem para os animais e vice-versa.
Quanto mais efcientes so as barreiras sanitrias dos biotrios, sejam
estes de Criao ou Manuteno/Experimentao, menores as chances de
contaminao dos animais e do homem.
2. Espcies mais utilizadas em pesquisa
As espcies mais utilizadas em pesquisas so:
10
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
o Ces (Canis familiaris);
o Camundongos (Mus musculus domesticus);
o Cobaia ou porquinho-da-ndia (Cavia porcellus);
o Coelho (Oryctolagus cunicullus);
o Hamster chins (Cricetelus griseus);
o Hamster srio (Mesocricetus auratus);
o Macaco Rhesus (Macaca mulatta); e
o Rato (Rattus norvegicus).
3. Classifcao dos Animais quanto ao Status
Sanitrio
O manejo na criao e manuteno de animais de laboratrio pode ser
atravs de tcnicas que resultaro em animais livres de qualquer forma de
vida associada (vrus, bactrias, fungos, protozorios, helmintos, etc).
De acordo com o status sanitrio que apresentam os animais de labo-
ratrio estes podem ser classifcados como:
- Gnotobiticos Possuem uma microbiota associada conhecida.
- Germ Free Animais totalmente isentos de germes.
- Specifc Patogen Free (SPF) Animais isentos de Agentes Patognicos
Especfcos.
- Animais Convencionais Animais que possuem microbiota indefnida.
Fatores como temperatura, umidade, ventilao e qualidade do ar, luz e
rudo devem ser controlados o mximo possvel (Fig. 1).
11 10
Figura 1. Sala de manuteno de animais de experimentao, mantidos em ambientes
com climatizao controlada. Fonte: Marcel Frajblat, 2003
4. Fatores ambientais em um biotrio
4.1. Temperatura
A temperatura ideal para quase todas as espcies de animais em
biotrios de 21 C (3). Para evitar situaes de estresse trmico que
levariam a queda da resposta imune dos animais e conseqentemente al-
teraes nos dados dos experimentos esses animais devem ser mantidos
constantemente em sua zona de conforto trmico, o que implica no con-
trole rigoroso da temperatura.
4.2. Umidade
Umidade relativa do ar recomendada para a maioria dos animais de
laboratrio de 55%( 15).
A maioria dos animais de laboratrio apresenta sudorao insigni-
fcante e usa a taquipnia como mecanismo de adaptao frente ao calor.
Assim, o excesso de umidade interfere na dissipao de calor destes ani-
mais.
12
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
4.3. Ventilao e renovao do ar
Os animais esto constantemente perdendo calor e umida-
de e eliminando CO
2
, alm de outros produtos resultantes de rea-
es metablicas. Os biotrios devem ter um mecanismo de reno-
vao de ar, a fm de evitar o acmulo de substncias txicas nas salas.
O uso de exaustores e condicionadores de ar , portanto, indispensvel.
Em relao ao ambiente de trabalho, alguns odores animais so
agressivos para seres humanos. Grande parte destes odores produzida
pela decomposio bacteriana dos excrementos, porm no se devem usar
produtos que os mascare, pois, podem ser extremamente nocivos aos ani-
mais. Esses odores devem ser controlados por procedimentos rotineiros
de limpeza e ventilao adequados. As pessoas que trabalham nestes am-
bientes obrigatoriamente devem usar mscaras.
O mais comum e mais srio dos contaminantes ambientais dos
biotrios o amonaco (NH
3
), que se forma pela ao das bactrias (urease
positiva) sobre os excrementos. A concentrao do amonaco infuen-
ciada por muitos fatores, como: ventilao, umidade relativa, nmero de
animais por gaiola, alimentao, etc. Atualmente existem sistemas de es-
tantes que comportam certo nmero de animais e gaiolas em um ambiente
ventilado e climatizado (Fig.2).
Figura 2. Tipo de estante ventilada e climatizada.
Fonte: Marcel Frajblat,2003
Estantes ventiladas
13 12
4.4. Luz e fotoperodo
A intensidade luminosa e o foto perodo infuenciam o metabo-
lismo e o ciclo estral dos animais, alterando suas respostas biolgicas. O
fotoperodo consiste na quantidade de luz que estes animais recebero du-
rante o dia (10h, 12h, etc.). Recomenda-se o isolamento total do biotrio
em relao luz natural, permitindo o controle da intensidade luminosa e
do fotoperodo.
Deve-se preferir o uso de luzes fuorescentes brancas, em virtude
de menor emisso de calor. A intensidade luminosa no deve ultrapassar
a 300 Lux, na sala, a um metro do cho, e, o interior das gaiolas, no deve
exceder a 60 Lux. Outras variveis devem ser consideradas, como a lumi-
nosidade dentro das gaiolas, uma vez que, como estas esto dispostas em
prateleiras, gaiolas das prateleiras superiores tendem a receber mais luz do
que as situadas nas prateleiras inferiores.
4.5. Rudo
O rudo um fator de grande infuncia sobre o bem estar dos
animais de biotrio, principalmente considerando-se que os ouvidos dos
roedores possuem a capacidade de escutar freqncias mais altas (ultras-
sons), inaudveis pelos ouvidos humanos. Frente a sinais de estresse dos
animais, deve-se verifcar se h alguma fonte de rudo (por exemplo, um
equipamento que possa estar emitindo ultrassons) que esteja perturbando
os animais, mas que no seja perceptvel pelo tratador. Notar tambm que
rudos contnuos so menos estressantes do que um rudo repentino. Al-
guns autores recomendam o uso de msica para minimizar o estresse por
rudo. recomendado rudo com at cerca de 45 Db (decibis).
4.6. Caixas e gaiolas
Existem vrios modelos de dimenses variadas e de gaiolas e cai-
xas (Tab. 1) que so utilizadas para a manuteno de animais em biotrios,
sendo mais indicadas as de policarbonato ou polipropileno, por serem
14
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
autoclavveis (Fig. 3). As gaiolas devem ser periodicamente higienizadas e
autoclavadas.
Tabela 1. Nmero de animais por caixa, para as principais espcies de
laboratrio.
4.7. Cama das gaiolas
Os materiais que podem ser utilizados so: vermiculita e a palha
de arroz, contudo, o mais adequado a maravalha (serragem grossa) de
Pinus. A serragem esterilizada por autoclavagem a mais indicada, e deve
ser trocada regularmente. Seu descarte deve ocorrer em sacos plsticos fe-
chados, com o status de lixo contaminado, recolhido por servio especial
de coleta.
Figura 3. Gaiola para camundongos
Fonte:www insightltda.com.br
Fonte: LUCA et al, 1996.
espcie peso(gr) dimenses (cm) n de animai s
largura profundidade altura
cobaias 250-300 20-35 30-50 20-20 1-4
coelhos 4000 45 60 40 1
ratos e hamsters 150-200 20-35 30-50 20-20 3-10
camundongos 20 20-30 30-45 12-12 10-20

15
a) Filete de maravalha de 2 cm ( ratos )
Figura 4. Gaiolas com dois tipos de cama diferentes.
Fonte: Marcel Frajblat, 2003
b) Filete de maravalha de 3 cm (camun-
dongos)
4.8. Alimentao e gua
A dieta deve atender os requisitos nutricionais de cada espcie, tan-
to quantitativa quanto qualitativamente. Geralmente as raes comerciais
de animais de laboratrio so apresentadas em pellets, pois a maioria
dos animais necessita estar roendo diariamente para desgastar os dentes.
Ratos e camundongos se alimentam da mesma rao. Dietas so normal-
mente superestimadas (Protena: 140-227 g/kg).
Ter cuidado na estocagem da rao para no haver contaminao
por fungos, bactria, insetos etc. Ela deve estar armazenada em local lim-
po, seco e ventilado.
A gua oferecida em bebedouros ou atravs de sistema autom-
tico usando vlvulas. Os bebedouros devem ser lavados e autoclavados. A
gua fltrada e tratada, podendo ser esterilizada com a adio de 01 mL/
litro de cido clordrico.
4.9. Manejo e comportamento
necessrio submeter os animais climatizao padronizada para
que eles se habituem ao ambiente que sero criados e mantenham sua ho- ho-
16
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
meostase. Os tcnicos que trabalham em biotrio devem estar treinados
para que se habituem a observar os animais e anotarem qualquer alterao
comportamental. Os animais de laboratrio conhecem o seu tratador pelo
odor e se estressam menos quando manipulados por tratadores com quem
j tenham tido contato anterior. No recomendado trocar o pesquisa-
dor/ tcnico durante o experimento, pois isto pode alterar o metabolis-
mo devido ao estresse dos animais. Tambm comprovado que pessoas
estranhas na sala de experimentao podem resultar em um aumento de
temperatura corprea do animal por estresse. Esse cuidado de especial
importncia quando um experimento est sendo realizado.
4.10. Higiene e limpeza
A efcincia de qualquer procedimento de limpeza depende do zelo
do executor. A higiene pessoal constitui uma importante barreira contra
infeces. O hbito de lavar as mos antes e aps manipular qualquer ani-
mal, reduz o risco de disseminar doenas, bem como o de auto-infeco.
obrigatrio o uso de luvas para qualquer procedimento nos
biotrios (criao e experimentao). Ao manipular agentes patognicos,
em biotrios experimentais, utilizar luva dupla. Uniforme completo
(Jaleco de mangas compridas e longo, cala exclusiva para uso no biotrio,
mscara, gorro, pantufas, etc). Aventais, jalecos ou uniformes so vesti-
mentas de proteo usada nas reas de animais, devendo ser retiradas an-
tes de sair do ambiente.
As roupas de laboratrio usadas em reas de risco devem ser au-
toclavadas antes de serem lavadas. O material descartado (proveniente de
necrpsia, carcaas de animais infectados, etc) deve ser identifcado e au-
toclavado. Se possvel incinerado.
Equipamentos e superfcies de trabalho devem ser descontamina-
das com desinfetante apropriado, em uma rotina bsica, aps o trmino
do trabalho com materiais infecciosos e especialmente aps derrame, go-
tejamento ou outra forma de contaminao com material infeccioso.
importante conhecer as caractersticas das substncias
17 16
empregadas na higienizao para que seja efcaz e segura. Ler com ateno
o modo de utilizao de cada desinfetante. Utilizar a dose recomendada
pelo fabricante.
5. Normas de biossegurana
Todos os bioteristas ou estudantes/pesquisadores que trabalham
com animais infectados ou no devem ter treinamentos especfcos e se-
rem informados sobre todos os riscos a que esto sujeitos, bem como as
maneiras de se proteger e evit-los.
Fumar, comer ou beber no permitido dentro dos biotrios ou
em qualquer outra rea em que existam microorganismos patognicos.
Gabinetes de fuxo laminar, contenes fsicas e/ou equipamentos
de proteo individual (respiradouros, mscaras faciais) devem ser usados
sempre que procedimentos com alto potencial de formao de aerossis
so realizados.
Qualquer ferimento na pele do tcnico, ou estudante, ou pessoal
de apoio, deve ser devidamente protegido antes de se iniciar a manipula-
o de animais e agentes patognicos.
Se agentes altamente infecciosos ou nocivos so usados, o animal
deve ser isolado em unidade de fuxo laminar ou mesmo em isoladores,
nos quais o ar que entra e sai convenientemente fltrado, atravs de fltros
absolutos.
Necrpsias de animais infectados com organismos altamente con-
tagiosos devem ser feitas em gabinetes ventilados, que permitam a fltra-
gem do ar.
Avaliao sorolgica peridica do pessoal, considerando o agente
de risco.
O acesso para estudantes, pesquisadores, visitantes dever ser limi-
tado ao horrio em que os bioteristas estiverem presentes.
Os biotrios devem ter um programa de segurana que inclui equi-
18
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
pamentos de combate a incndio, instrues para o uso correto de equipa-
mentos e treinamento de primeiros socorros.
Tabela 2. Nveis de Biossegurana recomendados no uso de animais in-
fectados.
imprescindvel a notifcao IMEDIATA de possveis acidentes que venham
ocorrer nos biotrios.
6.Eutansia
Defne-se como eutansia a morte serena, sem dor ou sofrimento.
Aps a realizao dos experimentos os animais envolvidos devem ser sub-
metidos eutansia, no entanto, eles no optaram por morrer e no tem
conscincia que vo morrer. A eutansia um procedimento emocional e
tico que deve ser executado por um mdico veterinrio segundo resolu-
o do Conselho Federal de Medicina Veterinria n 714, de 20 de junho
de 2002. Os pontos mais importantes da resoluo esto descritos abaixo:
Nvel de biossegurana

Prticas e tcnicas

Equipamentos de segurana Instalaes

1. Baixo risco individual e
comunitrio.


Manejo padro para colnias
convencionais

Bsi cas
2. Moderado risco individual
e comunitrio podendo
causar patologias ao homem
ou ao animal.
Uso obrigatrio de jal eco e
luvas, descontaminao dos
dejetos infectados e das gaiolas
dos animais antes da
higienizao, acesso limitado e
sinalizao para al ert a de
riscos.
Barrei ra parcial (gui ch de desinfeco),
uso de EPIs (mscara, culos protetor,
et c.) para a manipulao de agent es ou
animais infect ados que produzem
aerossis.



Bsi cas
3. Risco individual elevado,
risco comunitrio baixo
Prti cas do nvel 2, mais:
uniforme especial e acesso
cont rolado
Os do nvel 2, porm, devem ser usados
para todos os tipos de manipulaes com
animais infect ados.

Alta segurana
4. Elevado risco individual e
comunitrio
Prti ca do nvel 3, mais: troca
de roupa de rua por uniforme
especi al em vestirio, ducha na
sada, descontaminao de
todos os dejetos antes de sua
retirada do infectrio.
Barrei ras mximas, isto , cl asse III de
segurana biolgi ca ou barrei ra parcial em
combinao com: Proteo total do
corpo com uma pea ni ca dotada de
ventilao e presso positiva, gaiolas
dotadas de filtros, estantes com fluxo
laminar, et c


Segurana
mxima

19 18
CAPTULO I DAS NORMAS GERAIS
Art. 2 A eutansia deve ser indicada quando o bem-estar do
animal estiver ameaado, sendo um meio de eliminar a dor, o estresse
ou o sofrimento dos animais, os quais no podem ser aliviados por meio
de analgsicos, de sedativos ou de outros tratamentos, ou, ainda, quando
o animal constituir ameaa sade pblica ou animal, ou for objeto de
ensino ou pesquisa.
Pargrafo nico. obrigatria a participao do Mdico Veterin-
rio como responsvel pela eutansia em todas as pesquisas que envolvam
animais.
CAPTULO II DOS PROCEDIMENTOS
Art. 8 A escolha do mtodo depender da espcie animal envolvida,
dos meios disponveis para a conteno dos animais, da habilidade tcnica
do executor, do nmero de animais e, no caso de experimentao animal,
do protocolo de estudo, devendo ainda o mtodo ser:
I - compatvel com os fns desejados;
II - seguro para quem o executa, causando o mnimo de estresse no ope-
rador, no observador e noanimal;
III - realizado com o maior grau de confabilidade possvel, comprovando-
-se sempre a morte do animal, com a declarao do bito pelo Mdico
Veterinrio.
Art. 10. Os procedimentos de eutansia so de exclusiva responsabilidade
do mdico veterinrio.
Art. 11. Nas situaes em que o objeto da eutansia for o ovo embriona-
do, a morte do embrio dever ser comprovada antes da manipulao ou
eliminao do mesmo.
CAPTULO III DOS MTODOS RECOMENDADOS
Art. 12. Os agentes e mtodos de eutansia, recomendados e aceitos sob
20
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
restrio encontram-se listados, por espcie, no anexo I.
1 Mtodos recomendados so aqueles que produzem consistentemente
uma morte humanitria, quando usados como mtodos nicos de
eutansia.
2 Mtodos aceitos sob restrio so aqueles que, por sua natureza
tcnica ou por possurem um maior potencial de erro por parte do executor
ou por apresentarem problemas de segurana, podem no produzir
consistentemente uma morte humanitria, ou ainda por se constiturem
em mtodos no bem documentados na literatura cientfca. Tais mtodos
devem ser empregados somente diante da total impossibilidade do uso
dos mtodos recomendados constantes do anexo I desta Resoluo.
Art. 13. Outros mtodos de eutansia no contemplados no ANEXO I
podero ser permitidos, desde que realizados sob autorizao do CRMV
ou CFMV.
Art. 14. So considerados mtodos inaceitveis:
I - Embolia Gasosa;
II - Traumatismo Craniano;
III - Incinerao in vivo;
IV - Hidrato de Cloral (para pequenos animais);
V - Clorofrmio;
VI - Gs Ciandrico e Cianuretos;
VII - Descompresso;
VIII - Afogamento;
IX - Exsanguinao (sem sedao prvia);
X - Imerso em Formol;
XI - Bloqueadores Neuromusculares (uso isolado de nicotina, sulfato de
magnsio, cloreto de potssio e todos os curarizantes);
XII - Estricnina.
Pargrafo nico. A utilizao dos mtodos deste artigo constitui-se em
infrao tica.
21 20
Art. 15. Esta Resoluo entra em vigor na data de sua publicao, revo-
gadas as disposies em contrrio.
Anexo I:
Espcie
Recomendados
Aceitos sob Restrio
Anfbios
Barbitricos, anestsicos inalveis
(em algumas espcies), Dixido de
Carbono (CO

), Monxido de
Carbono (CO), metano sulfonato de
tricana (TMS, MS222),
hidrocloreto de benzocana, dupla
seco da medula espinhal.

Pistola de ar comprimido,
pistola, atordoamento e
decapitao, decapitao
e seco da medula
espinhal.
Animais
selvagens de
vida livre
Barbitricos intra-venoso (IV) ou
intra-peritonais (IP), anestsicos
inalveis, cloreto de potssio com
anestesia geral prvia.

CO

, CO, Nitrognio (N

),
argnio, pistola de ar
comprimido, pistola,
armadilhas (testadas
cientificamente)
Animais de
zoolgicos
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, CO, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.

N

, argnio, pistola de ar
comprimido, pistola.
Aves
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, CO, pistola.

N

, argnio, deslocamento
cervical, decapitao.
Ces
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, CO, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.

N

, argnio, pistola de ar
comprimido,
eletrocusso com
sedao prvia.
Cavalos
Barbitricos, cloreto de potssio
com anestesia geral prvia, pistola
de ar comprimido.

Hidrato cloral, (IV, aps
sedao), pistola,
eletrocusso com
sedao prvia.
Coelhos
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, CO, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.
N

, argnio, deslocamento
cervical (<1kg),
decapitao, pistola de ar
23 22
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Cavalos
Barbitricos, cloreto de potssio
com anestesia geral prvia, pistola
de ar comprimido.

Hidrato cloral, (IV, aps
sedao), pistola,
eletrocusso com
sedao prvia.
Coelhos
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, CO, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.

N

, argnio, deslocamento
cervical (<1kg),
decapitao, pistola de ar
comprimido.
Gatos
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, CO, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.

N

, argnio.
Mamferos
marinhos
Barbitricos, hidrocloreto de
etorfina.

Pistola (cetceos <4m de
comprimento)
Peixes
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, tricana metano sulfonato

(TMS, MS222), hidrocloreto de
benzocana, 2-fenoxietanol.

Decapitao e seco da
medula espinhal,
atordoamento e
decapitao ou seco da
medula espinhal.
Primatas no-
humanos
Barbitricos
Anestsicos inalveis, CO

,
CO, N

, argnio.

Rpteis
Barbitricos, anestsicos inalveis
(em algumas espcies), CO

(em
algumas espcies).

Pistola de ar comprimido,
pistola, decapitao e
seco da medula
espinhal, atordoamento e
decapitao
Roedores e
outros pequenos
mamferos
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.
Metoxiflurano, N

,
argnio, deslocamento
cervical (ratos <200g),
decapitao.
23 22

Roedores e
outros pequenos
mamferos
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

, cloreto de potssio com

anestesia geral prvia.

Metoxiflurano, N

,
argnio, deslocamento
cervical (ratos <200g),
decapitao.
Ruminantes
Barbitricos,CO, cloreto de
potssio com anestesia geral
prvia, pistola de ar comprimido.

Hidrato cloral (IV, aps
sedao), pistola,
eletrocusso, com
sedao prvia.

Sunos
Barbitricos, CO

,CO, cloreto de
potssio com anestesia geral
prvia, pistola de ar comprimido.
Anestsicos inalveis, CO,
hidrato cloral, (IV aps
sedao), pistola,
eletrocusso com sedao
prvia, pancada na cabea
(< 3 semanas de idade).

Vises, raposas,
e outros
mamferos
criados para
extrao do
plo.
Barbitricos, anestsicos inalveis,
CO

(vises requerem altas

concentraes para eutansia sem
agentes suplementares), CO,
cloreto de potssio, com anestesia
geral prvia.

N

, argnio, eletrocusso,
com sedao prvia
seguida de deslocamento
cervical.
24
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Bibliografa:
Animais de Laboratrio Criao e Experimentao- Antenor Andrade
et al, 2002 Ed Fiocruz
Biossegurana em Experimentao animal Um enfoque microbiolgico
Jonas Borges da Silva. 1998.
CECAL - Centro de Criao de Animais de Laboratrio da Fundao
Oswaldo Cruz - http://www.focruz.br/cecal/Bioterismo.htm
CEDEME - Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para
Medicina e Biologia da Universidade Federal de So Paulo - http://www.
unifesp.br/mapageral.htm
Manual para experimentao animal Tnia Arajo Jorge e Solange Lis-
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Procedimento Operacional N 340000.014 /CECAL/FIOCRUZ Bios-
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Revista do Conselho Federal de Medicina Veterinria. Braslia, DF. Ed.
CFMV, 2003.
WWW.http://bioclima.info/pbioterio.php acesso realizado em
12/06/2010.
25
Armadilha luminosa do tipo CDC
Paralelamente sero realizadas capturas manuais (capturador de
Castro ou aspiradores eltricos de 6 Volts) onde sero realizadas buscas
ativas dos vetores nas paredes externa e interna dos domiclios com o au-
xilio de uma lanterna, essas coletas sero realizadas tambm mensalmente
em cada rea de risco, com inicio s 18h e encerradas s 22h, totalizando
4 h / homem/ parede externa ou interna.
Identifcao dos vetores coletados
A identifcao do material ser realizada da seguinte forma:
Pelos municpios ou regies que possurem ncleo de entomolo-
gia, equipado e com funcionrios devidamente treinados pelos ncleos de
referncia.
As amostras coletadas sero enviadas para os laboratrios refe-
rencias, durante o primeiro ano de trabalho em cada municpio.
A partir do segundo ano, credenciar cada municpio para identi-
fcar 50 % das amostras coletadas.
Pelos ncleos de referncia, quando o municpio ou regio no
possuir equipe capacitada para identifcao.
26
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Metodologia
Os febtomos coletados podem ser sacrifcados atravs de diver-
sos meios: lcool 70 % , gelo seco, clorofrmio ou cianureto (morteiros)
ou aquecendo em luz solar direta . Os exemplares sacrifcados com mor-
teiros e luz solar devero ser armazenados entre capas de papel de seda em
pequenos recipientes com tampa.
Diversos mtodos de montagens de febtomos esto disponveis
em diversas referncias relacionadas ao assunto (Forattini, 1974; Ryan e
cols. , 1986; Young e col. 1994) . Descrevemos aqui o mtodo de monta-
gem em Berlese.
Mtodo de Berlese (Hoyer modifcado):
1-3 h em Potassa 10 % (KOH)
2- 20 minutos em cido actico 10 %
3 3 sries de 20 minutos em gua destilada
4 - 24 h em Lactofenol
5 - Montagem em Berlese (Lmina e lamnula)
Formulaes: Lactofenol - Fenol cristalizado(100 mg), cido ltico
(100 ml), Glicerina (100 ml) e gua destilada (100 ml).
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Berlese - Goma arbica (08g) , hidrato de cloral (74g) , xarope
de glicose (5 ml) e gua destilada (10 ml), acido actico (3ml) . Todos es-
tes ingredientes so misturados e aquecidos sem deixar a soluo ferver .
Manter o Berlese em frasco mbar.
Metodologia de Dissecao:
Introduzir o tubo contendo fmeas de febtomos vivas no conge-
lador, por um perodo de 10 minutos, para imobilizao dos exemplares.A
seguir, colocar um exemplar sobre uma lmina de microscopia, ao lado de
uma gota de salina estril, e o conjunto visualizado em lupa estereoscpi-
ca. Com o auxlio de um estilete de ponta recurvada (ngulo de 90), fxar a
cabea do inseto contra a lmina e com outro estilete pressionar levemente
o penltimo segmento do abdmen, retesando em direo ao centro da
gota de salina, de modo a extrair o estomago anterior e posterior, intestino
e tbulos de Malpighi. O conjunto arrumado sobre a lmina, de modo
que, do pr-ventriculo ampola retal sejam claramente visveis. Por lti-
mo, cobrir o conjunto com lamnula e examinar sob microscopia comum
(aumento de 400 vezes).
Tambm pode ser realizado da seguinte forma:
Para examinar Lutzomyia suspeitos de estar com Leishmania, pode-
28
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
mos ter mais dois procedimentos:
a. dissecao: o inseto vivo deve ser imobilizado em salina ou no
frio (colocando-o por alguns minutos no congelador) logo antes do exa-
me; coloc-lo em uma Imina com salina, sob uma lupa e, com o auxlio de
estilete, decapitar o inseto, puxando pelo pescoo as glndulas salivares
e o contedo intestinal; ao microscpio (40x) pode - se ver as promastgo-
tas movimentando-se; com o material pode-se fazer um esfregao, fxar
pelo lcool metlico e corar pelo Giemsa;
b.triturao: imobilizar os insetos como citado antes e colocar al-
guns (trs a cinco) no buraquinho de placa de ELISA contendo um pouco
de salina; com um basto de vidro, triturar o material, que poder ser
examinado em microscpio a fresco, fxado e corado pelo Giemsa ou ino-
culado em focinho ou cavidade peritoneal de hamster.
PRTICA DE DISSECO DE FLEBOTOMNEOS
1. FINALIDADE
Preparo de Lminas de abdomem e intestino de fmea de faboto-
mneos para identifcao da espcie de inseto e procura de promastigotas
de Leishmania.
2. AMOSTRA
As amostras usadas sero coletadas em base de rvore com arma-
dilha de luz do tipo CDC modifcada para aspirao.
29 28
3. MATERIAIS NECESSRIOS
Lmina de vidro.
Lamnulas.
Salina
Estiletes.
Recipiente pequeno com gua e detergente
Estereoscpio
4. PROCEDIMENTO TCNICO
1. Coloca-se os insetos coletados dentro do recipiente com detergen-
te para a retirada do excesso de cerdas;
2. Transfere-se o inseto individualmente para o centro da lmina
contendo uma gota de salina;
3. Observa-se o material em estereoscpio e com o estilete retira-se
o fnal do abdmen da fmea ou do macho e transfere-se para ou-
tra lmina colocando-se uma gota de xilol para clarifcar o material
para a observao do aparelho genital;
4. Do restante do abdmen com muito cuidado retira-se o intestino
utilizando-se o estilete e transfere-se o material para outra lmina
contendo uma gota de salina;
5. Coloca-se uma lamnula sobre o material e observa-se em micros-
cpio de luz em aumento de 100X e 400X para a pesquisa de
fagelados.
30
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
Ciclo biolgico de um febtomo. A) ovo; b) larva de primeiro instar; c) larva de quarto
instar; d)pupa.
Aspectos morfolgicos de Lutzomyia longipalpis: a) cabea do macho; b) cabea da fmea;
c) asa; d) armadura cibarial e faringe da fmea; e) espermateca da fmea; f) genitlia do
macho
31 30
Doena Clnica Espcies de Leishmania Posio Geogrfca
Leishmaniose cutnea
Complexo L. tropica
L. tropica
L. aethiopica
L. major
Complexo L. mexicana
L. mexicana
L. pifanoi
L. amazonensis
L. garnhami
L. venezuelensis
Complexo L. braziliensis
*

L. peruviana
L. guyanensis
L. panamensis
L. lainsoni
L. colombiensis
L. infantum
L.chagasi

Velho Mundo



Novo Mundo




Velho Mundo






Novo Mundo
Novo Mundo
Leishmaniose
Complexo L. braziliensis
*

L. braziliensis
L. guyanensis
L. panamensis
L. mexicana
L. tropica L. major
Novo Mundo


Novo Mundo
Velho Mundo
Leishmaniose visceral
Complexo L. donovani
L. donovani
L. infantum
L. chagasi
L. tropica
L.amazonensis


Velho Mundo
Velho Mundo
Novo Mundo
Velho Mundo
Novo Mundo
*
Os membros do complexo L. braziliensis so considerados como um subgnero, Vian-
nia, separado de todas as outras Leishmania, que pertencem ao subgnero Leishmania. Os
organismos do complexo L. braziliensis desenvolvem-se no intestino posterior do febo-
tomneo (peripilria). Os do sub-gnero Leishmania desenvolvem-se na regio anterior
do febotomneo (suprapilria).
33 32
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
COLETA DE MATERIAL PARA DEMONSTRAO DI-
RETA DO PARASITO:
Visando obter uma amostra vivel para um diagnstico confvel,
alguns cuidados so necessrios: o primeiro deles o preparo do local de
onde ser coletado o material (lceras recentes so mais ricas em parasi-
tos).
Deve ser feita uma limpeza vigorosa do local da leso com gua e
sabo, retirando-se resduos de medicamentos ou outras substncias, se-
guida de antissepsia com lcool a 70%. Quando necessrio, pode-se fazer
um pequeno boto anestsico com lidocana 1 ou 2%.
PROCEDIMENTO TCNICO
O esfregao realizado por escarifcao da borda interna da l-
cera ou da superfcie de leso fechada, utilizando-se lminas de
bisturi estreis ou estilete.
A puno aspirativa pode ser realizada aps injeo de 3mL de
soluo salina estril na borda da leso ou linfonodo, utilizando-se
uma seringa de 5mL e agulha 25x8.
Aps a exciso cirrgica, a tcnica de aposio em lmina (tam-
bm denominada imprint ou touch preparation) pode ser realizada por
meio da delicada compresso de fragmento de tecido, obtido por
bipsia, sobre uma lmina de vidro. Uma boa execuo da tcni-
ca requer que o fragmento seja previamente banhado em soluo
salina estril e o excesso de sangue e lquidos absorvidos em gaze
ou papel de fltro.
O material obtido por qualquer das tcnicas deve ser distendido
em lminas de microscopia previamente limpas, desengorduradas
e secas. Se possvel, empregar lminas de borda fosca para melhor
identifcao do material.
33 32
Aps a confeco do esfregao, as lminas sero coradas com de-
rivados do Romanowsky: Giemsa, Leishman ou corantes rpidos
(este ltimo ainda visto com algumas restries por alguns cien-
tistas) e
Escarifcao da borda de leso cutnea, localizada no membro
superior, com lmina de bisturi e confeco do esfregao em l-
mina de vidro.
PRTICA DE COLORAAO DE LMINA PARA O DIAG-
NTICO DE LEISHMANIOSE
PANTICO RPIDO LB
1. FINALIDADE
Colorao de material de leso para a visualizao de amastigotas

2. INTRODUO
O Pantico Rpido LB baseia-se no princpio de colorao
hematolgica estabelecida por Romanowsky, atuando em 15 segundos.
3. AMOSTRA
A amostra usada consiste em lminas com extenses de material
retirado da borda das leses.
O material submetida a ao de um fxador e duas solues
corantes, por meio de imerses de 5 segundos em cada, e ao fnal da ltima
35 34
MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
imerso encontra-se pronta para leitura.
4. REAGENTES
- Pantico rpido n 1: compe-se por uma soluo de triarilmeta- rpido n 1: compe-se por uma soluo de triarilmeta- triarilmeta-
no a 0,1%.
- Pantico rpido n 2: compe-se por uma soluo de xantenos a
0,1%
- Pantico rpido n 3: compe-se por uma soluo de tiazinas a
0,1%
5. PROCEDIMENTO TCNICO
a) Preparar as extenses sangneas e deixar secar em temperatura
ambiente;
b) Preencher 3 recipientes com as solues nmero 1, 2 e 3 respec-
tivamente;
c) Submergir as lminas na soluo nmero 1 mantendo-se um mo-
vimento contnuo de cima para baixo ou para os lados durante 5
segundos (5 imerses de 1 segundo cada) e deixar escorrer bem;
d) Submergir as lminas na soluo nmero 2 mantendo-se um mo-
vimento contnuo de cima para baixo ou para os lados durante 5
segundos (5 imerses de 1 segundo cada) e deixar escorrer;
e) Submergir as lminas na soluo nmero 3 mantendo-se um mo-
vimento contnuo de cima para baixo ou para os lados durante 5
segundos (5 imerses de 1 segundo cada) e deixar escorrer bem;
f) Lavar com gua deionizada recente (de preferncia tamponada a
pH 7,0), secar ao ar na posio vertical e com o fnal da extenso
voltado para cima.
35 34
COLORAO GIEMSA
1. FINALIDADE
Colorao de material de leso para a visualizao de amastigotas
2. PRINCPIO
Os corantes para esfregaos sanguneos, tambm chamados de
pancrmicos, so uma mistura de corantes de caractersticas neutras,
dependentes do pH da soluo corante, que em condies apropriadas
coram os componentes nucleares e citoplasmticos dos leuccitos, com
predominncia de tons vermelhos (quando cidos) e azulados diversos
(quando bsicos).
3. AMOSTRA
A amostra usada consiste em lminas com extenses de material
retirado da borda das leses.
4. REAGENTES
Corante Giemsa, em p 8g
Glicerol 500mL
Metanol (tamponado pH 6,8) q.s.p. 1000mL
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MANUAL BSICO DE BIOTERISMO
5. MATERIAIS NECESSRIOS
Suporte para colorao.
Cronmetro.
Lminas.
gua tamponada.
Metanol.
5. PROCEDIMENTO TCNICO
a) Fixar o esfregao, cobrindo-o com 15 a 20 gotas de metanol por
5 minutos.
b) Escorrer o lcool metlico e, sem lavar ou deixar secar.
c) Cobrir a lmina com soluo de uso de Giemsa diludo (2 gotas de
soluo me para 1mL de gua tamponada).
d) Proceder colorao por 10 minutos.
e) Lavar a lmina em gua corrente e deix-la secar em posio ver-
tical.
ISOLAMENTO DE PARASITAS EM MEIO DE CULTURA
NNN AGAR SANGUE
1. FINALIDADE
Isolar parasitas de insetos em meio especfco para estudo e diag-
nstico
37 36
38
2. AMOSTRA
A amostra usada ser retirada de fmeas de febotomneos infecta-
dos
3. MATERIAIS NECESSRIOS
Meio de cultura NNN Agar sangue
Estilete estril
.
4. PROCEDIMENTO TCNICO
a) Aps a leitura da lmina positiva o intestino retirado com um
estilete e transferido para tubo de ensaio com meio NNN.
b) O tubo ento fechado e colocado em estufa de BOD a tempe-
ratura de 24
o
C.
38 39
SUGESTO DE REFERNCIAS
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Apoio Financeiro:
Universal proc. No. 2108354408954041
Laboratrio de Leishmaniose e Doena de Chagas/INPA
Secretaria de Sade do Estado do Amazonas (SUSAM)
Fundao Nacional de Sade
Escola Agrotcnica de So Gabriel da Cachoeira
Exrcito Brasileiro












































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