Apostila Microbiologia Como Fazer Analise Microbiologica

ISO 17025
SUMRIO
1 Tcnica de membranas filtrantes..............................................2

2 - Avaliao da qualidade microbiolgica da gua.....................4
2.1 - Bactrias Heterotrficas..................................................4
2.2 - Clostridium perfringens...................................................6
2.3 - E.coli / Coliformes totais..................................................8
2.4 Enterococos....................................................................11
2.5 - Pseudomonas aeruginosa..............................................12
3 Tempo de incubao das placas..............................................14
KITLABOR Comrcio de Produtos de Laboratrios Ltda. Rua Eurico Hosterno, 300 Sala 03 Santa Mnica Florianpolis/SC. 1
Fone/Fax: (48)3233-3013, contato@laboratoriobiologico.com.br - CNPJ: 09.164.441/0001-01.
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1 - TCNICA DE MEMBRANAS FILTRANTES

A tcnica de membrana filtrante um mtodo rpido e preciso para isolamento
e identificao de colnias de bactrias. Esta tcnica recomendada pelo Standart of
Methods for the Examination of Water and Wasterwater, referncia internacional em
anlises em guas.
Antes de comear as anlises, esterilize a capela com lcool 70% e ligue a
lmpada germicida por 10 minutos. Obs: Desligar a lmpada germicida antes do
incio das anlises. Se estiver ligada, a lmpada germicida esterilizar sua
amostra e poder ocasionar danos sade se ficar exposto por longos perodos.
Etapas:
1 Com auxlio de bomba a vcuo, filtrar 100 mL de amostra atravs de uma
membrana filtrante de 47 mm de dimetro e 0,45 m de porosidade estril, utilizando
equipamento de filtrao fornecido pela KITLABOR;
2 Remover assepticamente a membrana do equipamento de filtrao, com
auxlio de uma pina e coloc-la sobre a superfcie da placa contendo o Agar desejado.
Obs: antes de usar a pina, esteriliza-la flambando na chama.
3 Incubar a placa a ser analisada invertendo-a.
Observaes:
Antes do incio de trabalho, o funil deve estar auto clavado;
Rinsar (limpar) o funil de filtrao com 20 a 30 ml de gua destilada aps a
troca de amostra a ser filtrada;
Abaixo, encontram-se fotos exemplificando os passos:
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2 - AVALIAO DA QUALIDADE MICROBIOLGICA DA GUA

A gua contm uma srie de microorganismos, alguns naturais do
ecossistema aqutico e outros, microorganismos transitrios, provenientes do solo e de
dejetos industriais e domsticos.
O controle dessa populao bacteriana de fundamental importncia, visto
que densidades elevadas de microorganismos na gua podem determinar a
deteriorao de sua qualidade, com desenvolvimento de odores e sabores
desagradveis e produo de biofilmes. Alm disso, quantidades elevadas de bactrias
podem apresentar risco sade dos consumidores, pois algumas delas podem atuar
como patgenos oportunistas, especialmente problemticas para indivduos debilitados
imunologicamente.
2.1 - Bactrias Heterotrficas
Apesar de ser virtualmente impossvel a determinao de todas as bactrias

presentes em uma gua, a determinao de bactrias heterotrficas de fundamental
importncia, seja em gua bruta ou tratada ou mineral.
A determinao da quantidade de bactrias heterotrficas em guas um
importante instrumento auxiliar no controle bacteriolgico para avaliao das condies
higinicas e de proteo dos poos e fontes.
A presena de bactrias heterotrficas em quantidades elevadas pode impedir
a deteco de coliformes, seja devido a produo de fatores de inibio, seja por um
desenvolvimento mais intenso.
No h na legislao um valor mximo permitido para a quantidade
de
bactrias heterotrficas, mas de extrema importncia a determinao da densidade

delas, pois assim podemos determinar possveis causas de deteriorao da qualidade
da gua.
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A composio em g/L (gramas por litro) do agar contendo o meio de bactrias

heterotrficas a seguinte:
Digerido pancretico de casena: 5,00
Extrato de levedura: 2,50
Dextrose: 1,00
Agar: 15,00
As colnias iro desenvolver uma colorao amarela-esbranquiada, como por
exemplo, s que esto ilustradas na foto abaixo. O tempo de incubao de 48 horas
a 36C.
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2.2 - Clostridium perfringens
A determinao de esporos de Clostridium perfringens em gua uma

importante avaliao de contaminao fecal remota, til em situaes onde outros
indicadores de menor resistncia, tais como E. coli, j no se encontrariam mais
presentes.
O Clostridium perfringens uma bactria anaerbia em forma de bastonete,
sulfito redutora, amplamente distribuda na natureza e considerada como parte da
microbiota intestinal do homem e de animais. Os esporos so eliminados nas fezes e
dessa forma chegam ao meio aqutico onde apresentam excepcional longevidade, em
funo da grande resistncia a condies ambientais desfavorveis.
Aps realizar as filtraes, seguir o procedimento:
Colocar as placas na jarra de anaerobiose em posio invertida;
Colocar 40 ml da soluo A no becker;
Colocar 2 cpsulas de carbonato de clcio no becker;
Feche a jarra de anaerobiose e deixe a 36C por um perodo de 48 horas.
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A composio em g/L do agar a seguinte:

Casena enzimtica hidrolizada: 3,70
Digesto peptdica de tecido animal: 3,70
Triptose: 7,50
Lactose: 9,40
Fosfato dipotssico: 3,30
Sulfato lauril de sdio: 0,05
Sulfito de sdio: 1,60
Agar: 15,00
Se ocorrer presena, as colnias apresentaro uma colorao azul escuro
negra a exemplo da figura abaixo.
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2.3 - E.coli / Coliformes totais
As guas de abastecimento e guas minerais apresentam o risco de serem

poludas por guas residurias e excretas de origem animal ou humana, podendo,
desta forma, conter microorganismos patognicos, tornando-se assim um veculo de
transmisso de doenas. Por isso h a necessidade de anlises rotineiras das
mesmas, para determinar seu grau de segurana do ponto de vista bacteriolgico.
Para a avaliao das condies de potabilidade de uma gua utilizam-se
bactrias do grupo coliforme, que atuam como indicadores de poluio fecal, pois esto
presentes no trato intestinal humano e de outros animais de sangue quente, sendo
eliminadas em grande nmero pelas fezes. A presena de coliformes na gua indica
poluio, com o risco potencial da presena de microorganismos patognicos e sua
ausncia evidncia em uma gua bacteriologicamente potvel, uma vez que so
mais resistentes na gua que as bactrias patognicas de origem intestinal.
Como o grupo dos coliformes totais inclui gneros que no so de origem
exclusivamente fecal, isto limita sua aplicao como indicador especfico de
contaminao fecal. O reconhecimento deste fato levou ao desenvolvimento de
mtodos de enumerao de um sub-grupo de coliformes denominados coliformes
fecais (termo tolerantes), os quais so diferenciados dos coliformes totais pela sua
capacidade de fermentar a lactose em temperatura elevada.
A definio do grupo de coliformes totais inclui as bactrias na forma de
bacilos Gram-negativos, no formadores de esporos, aerbios ou anaerbios
facultativos, capazes de fermentar lactose com produo de gs em 24 horas a 36 C.
O grupo inclui cerca de 20 espcies, dentre as quais encontram-se tanto bactrias
originrias do trato gastrintestinal de humanos como tambm diversos gneros e
espcies de bactrias no entricas, como Serratia e Aeromonas, por exemplo. Por
essa razo, sua enumerao em gua e alimentos menos representativa, como
indicao de contaminao fecal do que a enumerao de coliformes fecais.
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A definio de coliformes fecais a mesma do grupo de coliformes totais,

restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produo de gs
em 24 horas 42C. Esta definio, objetivou, em princpio, selecionar apenas
coliformes do trato intestinal. Atualmente sabe-se, entretanto, que o grupo de
coliformes fecais inclui 3 gneros (Escherichia coli, Enterobacter e Klebsiella), dos
quais os dois ltimos incluem cepas de origem no fecal.
Todos os sistemas analisados devero apresentar resultados negativos, isto ,
ausncia em 100 mL.
Entretanto, para facilitar as anlises, a KITLABOR disponibiliza a placa
E.coli/coliformes totais, onde pode-se obter os 2 grupos na mesma placa e na mesma
temperatura.
A composio em g/L do agar contendo o meio E.coli/coliformes totais a
seguinte:
Peptona especial: 5,00
Cloreto de sdio: 5,00
Sorbitol: 1,00
Lauril sulfato de sdio: 0,10
Substrato cromognico: 0,08
Substrato fluorognico: 0,05
Agar: 15,00
A placa incubada a 36C em 24 horas. Aps esse perodo, faz-se ento a
leitura. Para coliformes totais, as colnias ficaro verdes azul. Terminada a contagem
das mesmas, levar a placa numa lmpada UV negra. Se ocorrer brilho em alguma
colnia, esta ser E. coli (coliforme fecal). Aconselhamos que para facilitar a leitura
destas colnias, deve-se fazer em local escuro. Segue abaixo fotos exemplificando-as.
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2.4 - Enterococos
O habitat normal destes grupos de bactrias o trato intestinal humano e de

outros animais e estas bactrias normalmente no ocorrem em guas e solos de reas
no poludas, sendo que as poucas incidncias esto relacionadas diretamente a
animais de vida selvagem ou drenagem dos solos por enxurradas.
Embora estas bactrias possam persistir por longos perodos em guas de
irrigao com alto teor eletroltico, geralmente no se multiplicam em guas poludas,
sendo, portanto, sua presena indicativa de contaminao fecal recente.
Este grupo de bactrias engloba vrias espcies que apresentam diferentes
graus de resistncia s variaes ambientais e origens fecais especficas. Assim, as
espcies includas no gnero Enterococcus apresentam maior resistncia e so
caracterizadas por sua capacidade de crescer em temperaturas de 10 a 45 C, pH de
at 9,6
e em meios com altas concentraes de NaCl. Alm disso, conseguem
sobreviver a temperaturas de 60 C durante 30 minutos.

As placas de Petri contendo o meio de cultura Agar so colocadas em estufa a
36 C durante 48 horas. A colorao das colnias varia do rosa ao vermelho escuro.
A composio em g/L do agar contendo o meio de Enterococos a seguinte:
Triptose: 20,00
Dextrose: 2,00
Fosfato dipotssio: 4,00
Agar: 10,00
A foto abaixo ilustra a presena de Enterococos numa anlise realizada em
laboratrio.
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2.5 - Pseudomonas aeruginosa
A diversidade bioqumica da Pseudomonas aeruginosa e sua resistncia a

agentes antimicrobianos so fatores que tm determinado um grande interesse em seu
estudo, pois contribuem para sua importncia como patgeno oportunista, como
microrganismo formador de biofilme (limo), interferindo em muitos processos
industriais e como microrganismo de importncia em processos de deteriorao,
atacando uma variedade de materiais.
Nos ltimos anos, seu estudo em guas de piscina tem merecido uma ateno
especial e esse interesse deriva do fato de pesquisas recentes terem evidenciado a
relao entre a alta incidncia de otite em nadadores e a presena de Pseudomonas
aeruginosa nessas guas recreacionais.
A contaminao dessas guas por Pseudomonas aeruginosa pode ser
decorrente de sua introduo atravs da pele de banhistas, da superfcie da pele
contaminada por matria fecal, da urina ou de contaminao da prpria fonte de gua
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que abastece as piscinas. A presena desta bactria em guas minerais envazadas em

garrafes plsticos reutilizveis (normalmente de 20 litros) tambm tem sido
constantemente relatada, especialmente pela grande produo de biofilme no interior
destes recipientes e a m higienizao destes nas empresas engarrafadoras,
determinando a deteriorao da gua (alterao de sabor, odor e aparncia), alm de
poder contribuir para a disseminao de um patgeno oportunista de extrema
importncia.
As placas de Petri contendo o meio de cultura Agar so incubadas a 36 C por
aproximadamente 48 horas.
A composio em g/L do agar contendo o meio de Pseudomonas aeruginosa
a seguinte:
Digesto pancretica de gelatina: 20,00
Cloreto de magnsio: 1,40
Sulfato de potssio: 10,00
Cetrimida: 0,300
Agar: 15,00
O crescimento das colnias tem de 0,8 a 2,2 mm de dimetro de aparncia
achatada com colorao acastanhada esverdeada-negra.
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3 - TEMPO DE INCUBAO DAS PLACAS

VALOR MXIMO
BACTRIAS
TEMPO DE INCUBAO
Bactrias heterotrficas
48 horas
Sem especificao
Clostridium perfringens
48 horas
Ausncia
E.coli / coliformes totais
24 horas
Ausncia
Enterococos
48 horas
Ausncia
Pseudomonas aeruginosas
48 horas
Ausncia
PERMITIDO
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1 Tcnica de membranas filtrantes..............................................2

1 - TCNICA DE MEMBRANAS FILTRANTES

Abaixo, encontram-se fotos exemplificando os passos:

2 - AVALIAO DA QUALIDADE MICROBIOLGICA DA GUA

2.1 - Bactrias Heterotrficas

Apesar de ser virtualmente impossvel a determinao de todas as bactrias

bactrias heterotrficas, mas de extrema importncia a determinao da densidade

A composio em g/L (gramas por litro) do agar contendo o meio de bactrias

2.2 - Clostridium perfringens

A determinao de esporos de Clostridium perfringens em gua uma

A composio em g/L do agar a seguinte:

2.3 - E.coli / Coliformes totais

As guas de abastecimento e guas minerais apresentam o risco de serem

A definio de coliformes fecais a mesma do grupo de coliformes totais,

O habitat normal destes grupos de bactrias o trato intestinal humano e de

e em meios com altas concentraes de NaCl. Alm disso, conseguem

sobreviver a temperaturas de 60 C durante 30 minutos.

2.5 - Pseudomonas aeruginosa

A diversidade bioqumica da Pseudomonas aeruginosa e sua resistncia a

que abastece as piscinas. A presena desta bactria em guas minerais envazadas em

3 - TEMPO DE INCUBAO DAS PLACAS

E.coli / coliformes totais

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