1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM
ZOOTECNIA

Disciplina: Seminrio I

Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira

Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR

PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM
ZOOTECNIA

Abordagem Protemica e a Identificao de

Biomarcadores de Processos Fisiolgicos

Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira

Orientador: PhD Arlindo de Alencar Araripe Moura
Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas

INTRODUO

Estrutural
Seres vivos

Enzimtica
Transporte
Hormonal
Protenas

Imunolgica
4

INTRODUO
Anderson & Anderson (1982)

ATLAS DAS PROTENAS

HUMANAS

Protemica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995)

A identificao e caracterizao de
protenas, constituintes de uma matriz
biolgica (organismo, clula, organela,
fludo biolgico) que so produzidas em
um determinado momento e sob
determinadas condies.

Dinmica do proteoma
Fatores epigenticos
Temperatura
Estresse
Doenas
Alimentao

WITZMANN & LI (2002)

Transcrio

DNA

Splicing

pr-RNAm

RNAm
Modificaes
Traduo

Protenas

Degradaes 7

OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEMICA

Nvel de expresso de
protenas

Modificaes Pstraducionais

Protemica
Interaes entre protenas

Identificao de
Biomarcadores
8

BIOMARCADORES
So molculas biolgicas indicadoras
de estados fisiolgicos ou patolgicos,
passveis de serem mensuradas em
clulas e fludos biolgicos.
Moore et al., (2007)

ABORDAGEM PROTEMICA E A
IDENTIFICAO DE BIOMARCADORES

Coleta

Coleta
Amostra
Separao
Identificao
ZHOU et al., (2005)

10

ABORDAGEM PROTEMICA E A
IDENTIFICAO DE BIOMARCADORES
Coleta de amostras:
Unicelulares (+ sincronizao):
fase do ciclo celular e condies de cultivo

Clulas e Tecidos de Organismos Pluricelulares

(- sincronizao):
Bipsias: tipos celulares
Cultura de tecidos
Coleta: Manual X microdisseco a laser

Fludos biolgicos
Complexidade
11

ABORDAGEM PROTEMICA E A
IDENTIFICAO DE BIOMARCADORES
Eletroforese Bidimensional (2D)
Espectrometria de Massa (EM)
Estudos fisiolgicos ou patolgicos comparativos;
Quantitativos
Qualitativos

Cromatografia lquida (CL)

Espectrometria de massa (EM)
Recuperao de ptns na forma nativa
Anlises funcionais, estruturais e bioqumicas
12

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
Separao de misturas protecas com base em
dois parmetros fsico-qumicos: ponto
isoeltrico (pI) e a massa molecular (M.M.), sob
a influncia de um campo eltrico:
1 Etapa: Focalizao Isoeltrica
pI

2 Etapa: Eletroforese descontnua em gel de

poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE)
Tamanho (massa molecular)
OFarrell, 1975; Gorg et al. 1998
13

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(+)
(maior)

M.M.

pI

(menor)

(-)
Focalizao Isoeltrica

SDS-PAGE

14

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

(maior)

M.M.

(menor)
SDS-PAGE

15

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL
(-)
(+)

pI

(+)

Revelao
Azul brilhante de Coomassie coloidal
Fluorescncia

M.M.

Anlise do gel
(-)

16

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL

Gel A
controle

Gel B
Tratamento
ISSAQ & VEENSTRA (2008)

17

ELETROFORESE DE FLUORESCNCIA
DIFERENCIAL EM GEL 2D (DIGE)

Cy5

controle

Cy5

Tratamento
UNLU et al., (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008)

18

Tabela 1. Vantagens e limitaes da

eletroforese bidimensional.
Vantagens

Limitaes

Quantificar expresso

Reprodutibilidade

Analisar modificaes pstraducionais

Tempo de execuo
No automatizada

Avaliar vrias protenas

Protenas de membrana
Protenas: pI e MM extremas
19

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E
ESPECTROMETRIA DE MASSA

Digesto: tripsina
Espectrmetro de massas

m/z

Espectros de massas

Programas: identificar
a protena

20

ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Tcnica analtica que identifica a composio
qumica de compostos, pela determinao de suas
massas moleculares na forma inica, baseada na
sua movimentao (m/z) atravs de um campo
eltrico ou magntico.
Amostra

Fonte de
Ionizao

Analisador

Detector
Dados

Recipiente com baixa presso

21

ESPECTROMETRIA DE MASSA
Ionizao por dessoro a laser assistida
por matriz -Tempo de vo (MALDI-TOF)
Tempo de vo

Detector

amostra

La
se
r

Karas & Hillkamp (1998)

22

ESPECTROMETRIA DE MASSA

m/z

Espectrmetro de massa

Espectros de massas
peptdeos

Impresso Digital de peptdeos

Programas de Anlise
e pesquisa em banco
de dados.

Protena
Biomarcador

23

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA

PERFORMANCE

Mtodo de separao fsica baseado na

migrao diferencial de compostos, devido a
suas distintas interaes, entre duas fases
imiscveis, a fase mvel (bombeada sob
presso) e a fase estacionria (pequenas
partculas).

peptdeos

24

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA

PERFORMANCE
Fase lquida:
Solvente: alto grau de pureza

Fase estacionria:
Excluso molecular
Poros com tamanhos controlados

Troca inica
Altamente carregada (ons + ou -)

MATT et al. 2008

25

SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LQUIDA

DE ALTA PERFORMANCE

Detector

Bomba de alta presso

amostra

Reservatrio fase
mvel

coletor

Registro e anlise
26
dos dados

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA

PERFORMANCE
Mtodos de deteco:
Absorbncia (UV)
Fluorescncia
Espectrometria de massa
CLEM
protenas

27

CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A
ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM
(ES/ES)
Ionizao por spray de eltrons Tempo
de vo em TANDEM (ESI-TOF/TOF)

Camara de coliso

m/z

MATT et al., 2008

28

ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM)

Espectrmetro de massa
(EM/EM)

m/z

Espectros de massas

Sequenciamento de novo da protena

Programas de Anlise
e pesquisa em banco
de dados.

Protena
Biomarcador

29

Tabela 1. Vantagens e limitaes da

cromatografia lquida de alta performance.
Vantagens

Limitaes

Tempo de execuo

Custo do equipamento

Automatizao

Manuteno do equipamento

Versatilidade

30

ABORDAGEM PROTEMICA E
IDENTIFICAO DE BIOMARCADORES
Do geral para o particular
Analisar proteomas de condies
distintas e identificar as
diferenas

Do particular para o geral

Analisar uma protena e inferir suas
funes no contexto do todo

Separao de protenas nas amostras

Eletroforese bidimensional

Cromatografia lquida (LC)

fragmentao

Espectrometria de Massas:
Determinao de massas para identificao
Impresso digital de peptdeos

Sequenciamento de novo
Bioinformtica

MANN et al. 2001

PROTEINA

31

Identificao da bactenecina no muco

cervico-vaginal pela eletroforese-2D em um
modelo ovino de trabalho de parto

MS/MS
Induo de parto
Dexametasona
(+) Bactenecina
0h

28 h

Trabalho
de parto

YOUNG et al. (2007)

32

Anlise protemica de protenas hipotalmicas

de linhagens de galinhas de alta e baixa
produo de ovos

corte

18
semanas

60
semanas

CLAPMS/MS

Ribonucleoprotena
nuclear hetergenea H3
(HNRPH3)

poedeira
(HNRPH3) (+)

KUO et al. (2007)

33

Protena Osteopontina como

biomarcador de fertilidade em bovinos
AIDA et al. (1999)
Purificao
Sequenciamento
identificao
Alta fertilidade

Osteopontina
55 kDa; pI = 6,2

smen
FIV

Baixa fertilidade
ocitos

(+)

KILLIAN et al. (1993)

GONALVES et al. (2008)

34

Desafios na Abordagem Protemica e

Identificao Biomarcadores
Otimizao dos bancos de dados
Deteco de protenas em baixas
concentraes;
Automatizao das tcnicas;
35

Perspectivas da abordagem protemica e

identificao de Biomarcadores
Diagnstico e prognstico de doenas e
animais humanas e animais;
Seleo de animais de produo;
Descoberta de novos princpios da
fisiologia celular;
Metabolmica;

36

Rodrigo V. De Oliveira
oliveirarv@rocketmail.com

37