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Unidade 3-Cinética enzimática e uso e produção de enzimas-versão 2-ago 2006

Universidade Federal de Uberlândia
Faculdade de Engenharia Química
Prof. Ubirajara Coutinho Filho

3.1-Introdução
As enzimas são catalisadores biológicos, geralmente de estrutura protéica (também
existe enzima que tem como estrutura RNA catalítico dito ribozima), que participam de reações
químicas diversas. Tais reações ocorrem nas células vivas, em processos industriais
diversificados, na produção de alimentos e em produtos de limpeza e no próprio organismo
pela ingestão e uso tópico de enzimas presentes em medicamentos, complementos alimentares
e cosméticos.
O grande interesse no uso das enzimas pode ser explicado por inúmeros fatores como: a
grande variedade de reagentes nos quais as mesmas atuam; as reações complexas que as
enzimas são capazes de catalisar em rotas onde a geração de resíduos e subprodutos é
reduzida; capacidade que as mesmas têm atuar como catalisadores a altas velocidades em
condições de reduzida necessidade energética e reduzidos efeitos de corrosão de equipamento
(condições amenas de pressão e temperatura).
Na Tabela 1 é feita uma comparação detalhada entre as enzimas e outros catalisadores
sintéticos.

Tabela 1 – Comparação entre enzimas e catalisadores químicos.

Característica Enzimas
Especificidade ao substrato alta
Natureza da estrutura complexa
Sensibilidade à T e pH alta
Condições de reação (T, P e pH) suaves
Consumo de energia baixo
Formação de subprodutos baixa
Separação catalisador/ produtos difícil/cara (enzima livre)
simples(enz. imobilizada)
Catalisadores Químicos
baixa
simples (geralmente)
baixa
drástica (geralmente)
alto
alta (geralmente)
simples (geralmente)

3.2-Mecanismo de ação enzimática

A ação catalítica das enzimas envolve o fornecimento de um ambiente na estrutura
tridimensional da enzima onde a reação enzimática é mais favorável, sendo que a região
específica da enzima onde ocorre a reação é dito sítio ativo.
A reação se torna mais favorável pelo fato da interação entre os resíduos de
aminoácidos e as moléculas reagentes diminuir a energia de ativação pelo rearranjo de ligações
covalentes e pela realização de interações não covalente entre enzima e substrato.
Para reação esquematizada na equação que segue a Figura 1 representa este fato.

⎯⎯
→ ES ←⎯
E + S ←⎯
⎯ ⎯⎯
→ EP ⎯⎯
⎯ →E + P
 2

# : estado de transição
ES: intermediário de reação
∆G1 EP: intermediário de reação
# G : energia livre
G
∆G2
ES EP

Coordenada de reação

Figura 1: Energia de ativação (∆G) sem enzima (∆G1) e com enzima (∆G2)

Em muitas enzimas o processo catalítico acima descrito só é possível quando uma pequena
molécula orgânica (dita coenzima) ou um pequeno íon (dito cofator) encontra-se ligado no
sítio catalítico da enzima. Esta necessidade de grupo prostético (denominação feita para se
referir ao grupo necessário pela enzima) faz com que processos industriais de uso de
enzimas que necessitam destes grupos só sejam satisfatórios quando o meio reacional
contenha o cofator ou coenzima.

3.4-Modelos cinéticos

A)Michaelis- Menten

O modelo de Michaelis-Menten é um modelo simples e bastante útil na descrição de

reações enzimáticas. Segundo este modelo a velocidade da reação (V) aumenta com a
concentração de substrato até um limite máximo (VM) quando a enzima se tornar saturada
pelo substrato:
⎯⎯
k1
E + S ←⎯⎯ → ES ⎯⎯
k2
→E + P
k −1
Em termos de velocidade de decomposição do substrato (VS), temos:

VS=k1 [E][S]-k-1[ES] (1)

Em termos de complexo (VES) a velocidade se torna:

VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] (2)

 3

A velocidade de formação do complexo é nula pela hipótese do estado pseudo-estacionário

(HEPE). Considerando a HEPE e as equações (1) e (2) tem-se:
k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] = 0 (3)

VS= k2[ES] (4)

A concentração total de enzima que participa do processo (Et) é dada pela soma das
concentrações de enzima livre (E) e enzima complexada (ES):
[Et]= [E]+[ES] (5)
Das equações (3) e (5), tem-se:
k1 ([Et]-[ES] ) [S]-k-1[ES]- k2[ES] = 0 (6)
Das equações (4) e (6), tem-se:
k1.k2 .[ S ].[ Et ]
VS = (7)
k1.[ S ] + k2 + k−1
Assim :

VM .[ S ]
VS = (8)
[S ] + K M
Onde KM=(k2+k-1)/k1 e VM=k2[Et].

A equação (8) representa o modelo de Michaelis Menten

Para dados cinéticos, os parâmetros VM e KM podem calculados por regressão não-linear e

regressão de equações linerizadas obtidas da equação (8). O método Lineweaver-Burk e o
de Eadie-Hoffstee são duas formas usuais de linearizar a equação de Michaelis-Menten.

Y=a+bX com Y=1/V e X=1/S é forma de linearização de Lineweaver-Burk para qual

VM=1/a e KM=b/a, conforme ilustra a Figura 2.

Y=1/V

Ponto de intercepção
Y=1/VM e X=0

X=1/S

Ponto de intercepção X= -1/KM e Y=0

Figura 2: linearização de Lineweaver-Burk

Y=a+bX com Y=V e X=V/S forma de linearização de Eadie-Hoffstee para qual a=VM e
b=-KM, conforme ilustra a Figura 3.
 4

Y=V
Ponto de intercepção
Y=VM e X=0

Ponto de intercepção Y=0

e X=VM/KM

X=V/S
Figura 3: linearização de Eadie-Hoffstee

Quando a reação ocorre em um reator agitado sem a adição de enzima e substrato até o
final do processo o perfil de concentração de substrato ao longo do tempo corresponde a
equação de Michaelis-Menten integrada:
(S0-S)+ KM ln(S0/S)=VM(t-t0) (8*)
onde S0 representa a concentração inicial de substrato e t o intervalo de tempo contado a
partir do momento onde a enzima e a solução do substrato foram misturadas.

A discussão da cinética em processos com enzima imobilizada e a discussão de diversos

tipos de reatores enzimáticos são descritos na Unidade 6.

B) Inibição competitiva:

O modelo de inibição competitiva é um modelo onde a inibição é reversível conforme

mostra as equações de equilíbrio:

⎯⎯→ ES ⎯⎯
E + S ←⎯⎯
k1 k2
→E + P
k −1

⎯⎯→ EI
E + I ←⎯⎯
ki

k −i

Em termos de velocidade de decomposição do substrato (VS), temos:

VS=k1 [E][S]-k-1[ES] (9)

Em termos de complexos (VES e VEI ) a velocidade se torna:

VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] (10)

VEI=ki [E][I]-k-i[EI] (11)

Pela HEPE e pela equação (11), tem-se:

 5

[EI]= [E][I]/Ki (12)

onde Ki=k-i/ki

A concentração total da enzima [Et] é dada pela soma das concentrações de enzima na
forma livre e complexada:
[Et]= [E]+[ES] +[EI] (13)
Das equações (12) e (13):

[E]=( [Et]-[ES])/fator (14)

onde fator = 1+[I]/Ki.
Das equações (10), (14) e da HEPE, tem-se:

[ES]=[S] [Et]/([S]+fator.KM ) (15)

onde KM=(k2+k-1)/k1

Das equações (9) e (10) em conjunto com HEPE (VES=0), tem-se:

VS= k2[ES] (16)
De (15) e (16):

VM .[ S ] V .[ S ]
VS = = M ap (17)
[ S ] + K M (1 + [ I ]/ Ki ) [ S ] + K M
onde KMap=KM(1+I/Ki)

A equação (17) representa o modelo de inibição competitiva que está representado na

forma linerizada na Figura 4.

Y=1/V

Sem inibição

com inibição

X=1/S
Figura 4: representação do modelo de Michaelis –Menten e o modelo de inibição
competitiva no mesmo sistema cartesiano
 6

B) Inibição não-competitiva:

O modelo de inibição não-competitiva é um modelo onde a inibição é reversível e a

ligação do substrato a enzima e a ligação do inibidor a enzima não interferem na formação
do complexo enzima-inibidor-substrato. As equações de equilíbrio que seguem
demonstram esta situação:

⎯⎯
k1
E + S ←⎯⎯ → ES ⎯⎯
k2
→E + P
k −1

⎯⎯→ EI
E + I ←⎯⎯
ki

k −i

⎯⎯⎯
ES + I ←⎯→ ESIki

k −i

⎯⎯→ ESI
EI + S ←⎯⎯
k1

k −1

Em termos de velocidade de decomposição do substrato (VS), temos:

VS=k1 [E][S]-k-1[ES]+ k1 [EI][S]-k-1[ESI] (18)

Em termos de complexos (VES , VEI e VESI ) a velocidade se torna:

VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] - ki [ES][I]+k-i[ESI] =0 (HEPE) (19)

VEI=ki [E][I]-k-i[EI]- k1 [EI][S]+k-1[ESI] = 0 (HEPE) (20)

VESI=ki [ES][I]-k-i[ESI]+ k1 [EI][S]-k-1[ESI] = 0 (HEPE) (21)

De (19) e (21), tem-se:

k1 [E][S]-k-1[ES]+ k1 [EI][S]-k-1[ESI]= k2[ES] (22)

De (22) e (18), tem-se:

VS= k2[ES] (23)

Para as equações químicas tem-se os equilíbrios:

Ki=[E][I]/[EI]= [ES][I]/[ESI] (24)

K1=[E][S]/[ES]= [EI][S]/[ESI] (25)

De (24):
[ESI] = [ES][I]/Ki (26)
De (25):
[E] = K1[ES]/[S] (27)
De (24) e (27):
 7

[EI] = [E] [I]/Ki = (K1/Ki)([I]/[S])[ES] (28)

A concentração total da enzima [Et] é dada pela soma das concentrações de enzima na
forma livre e complexada:
[Et]= [E]+[ES] +[EI]+ [ESI] (29)

De (26), (27), (28) e (29):

[ Et ] [ Et ]
[ ES ] = = (30)
K1 /[S ] + 1 + ([ I ]/ Ki)( K1 /[ S ]) + [ I ]/ Ki ( K1 /[S ] + 1)(1 + [ I ]/ Ki)

De (30) e (23):

k2 [ Et ][ S ] VM
[S ]
(1 + [ I ]/ Ki ) (1 + [ I ]/ Ki ) VMap [ S ]
Vs = = = (31)
K1 + [ s ] K1 + [ s] [S ] + K M

onde VMap=VM/(1+I/Ki)

A equação (31) descreve o modelo de inibição não competitiva que está representado na
forma linerizada na Figura 5.

Y=1/V

Sem inibição
Com inibição

X=1/S

Figura 5: representação do modelo de Michaelis –Menten e o modelo de inibição não-

competitiva no mesmo sistema cartesiano
 8

D) Inibição pelo substrato:

O modelo de inibição pelo substrato é um modelo onde o excesso de substrato gera uma
inibição é reversível conforme mostra as equações:
⎯⎯
k1
E + S ←⎯⎯ → ES ⎯⎯
k2
→E + P
k −1

⎯⎯⎯
ES + S ←⎯→ ES2
ki

k −i

Em termos de velocidade de decomposição do substrato (VS), temos:

VS=k1 [E][S]-k-1[ES]+ ki [ES][S]-k-I[ES2] (32)

Em termos de complexos (VES eVESS) a velocidade se torna:

VES=k1 [E][S]-k-1[ES]- k2[ES] - ki [ES][S]+k-i[ES2] =0 (HEPE) (33)

VESS=ki [ES][S]-k-i[ES2] =0 (HEPE) (34)

De (34), (35) e (36):

VS= k2[ES] (35)

A concentração total de enzima de enzima é dada pela soma das concentrações de enzima
livre e enzimas em formas complexas:
[Et]= [E]+[ES] +[ES2] (36)
Para as reações podem ser associadas as constantes de equilíbrio:
KM=[E][S]/[ES] (37)

Ki= [ES][S]/[ES2] (38)

De (37) e (38):

[E ]= KM [ES]/[ S] (39)

[ES2]= [ES] [S]/ Ki (40)

De (36), (39) e (40):

[ Et ]
[ ES ] = (41)
K M /[S ] + 1 + [S ]/ Ki

De (41) e (35):

k2[ Et ] VM [S ]
VS = = (*)
K M /[S ] + 1 + [S ]/ Ki K M + [S ] + [S ]2 / Ki
 9

A equação (*) representa o modelo de inibição pelo substrato. Neste modelo há um ponto
de máximo onde a máxima velocidade possível (dV/dS=0) corresponde a S = K i .K M

3.5-Desativação térmica da enzima

Ao longo do tempo de armazenamento e uso a enzima perde sua atividade pelo efeito de
mudanças conformacionais. O modelo mais simples que descreve este processo é o modelo
de primeira ordem onde a taxa de desativação (dA/dt, onde A representa atividade da
enzima ativa) é diretamente proporcional a concentração da enzima ativa

A ⎯⎯
k1
→ Ai (42)
Nestas condições:
dA/dt=-k.A (44)
A resolução da Equação (44) nos fornece o modelo de primeira ordem na forma integrada:
A(t)=Ao.exp (-k.t) (45)
A equação (45) pode ser descrita na forma linerizada:

ln[A(t)]=ln[Ao] -k.t (45)

Para o modelo de primeira ordem, o tempo de meia-vida (t1/2) associado da desativação

térmica torna-se:
t1/2=ln[2] /k (46)

O modelo cinético de desativação térmica acima descrito pode ser expresso em termos
relativos a atividade inicial :

Ar(t)=A(t)/Ao ou Ar(t)%=100.A(t)/Ao (47)

Neste caso:
Ar(t)%=100.exp (-k.t) (48)

Existem modelos de desativação mais complexos como os modelos de desativação em série

que consideram que a enzima passa por vários estados de desativação com progressiva
perda da atividade em cada estado:

α1 α2
A ⎯⎯
k1
→ A1 ⎯⎯
k2
→ A2 (49)
 10

onde k1 e k2 são as constantes da taxa de desativação de primeira ordem. A, A1, A2 são as

atividades específicas. α1 e α2 são as razões das atividades específicas A1/A e A2/A,
respectivamente.

Para um modelo desta natureza tem-se:

α1k1 α 2 k2 α1k1 α 2 k1
AR (t ) = α 2 + [1 + − ]exp(− k1t ) − [ − ]exp(− k2t ) (50)
k2 − k1 k2 − k1 k2 − k1 k2 − k1

Onde AR(t) foi considerada uma função do peso das atividades específicas dos estados das
enzimas:
A + α1 A1 + α 2 A2
AR (t ) =
A0

3.6- Imobilização das enzimas

A imobilização das enzimas consiste na retenção da enzima em uma região definida

do espaço com a manutenção da atividade. Este processo representa a metodologia mais
utilizada para superar as dificuldades associadas ao uso das enzimas como: custos elevados
de obtenção e purificação; instabilidade da estrutura isolada do ambiente natural; efeitos
desnaturantes associados ao uso em condições operacionais e condições do ponto ótimo de
uso; ação de substâncias traços que atuam como inibidores das enzimas.

Entre as vantagens associadas ao uso de enzimas imobilizadas, constam: utilização

contínua da enzima; favorecimento da reutilização da enzima; possibilidade do uso
econômico da enzima em maior concentração; estabilidade e resistência a desnaturação.

Embora a imobilização represente as vantagens citadas há dificuldades que tornam a

imobilização ainda inviável para diversas enzimas de interesse. Entre as principais causas
que dificultam a imobilização, podem ser citadas: perda de atividade pelo processo de
imobilização; limitação da atividade catalítica por efeitos difusivos; aumento da
complexidade do processo (devido a etapas adicionais); custos associados a enzima
imobilizada.

Os principais métodos de imobilização podem ser divididos em processos onde há

imobilização por ligação e processos onde há a imobilização por retenção física da enzima.
Os processos de ligação a suportes (ligação iônica e ligação covalente) e ligação cruzada (
dividida em ligação cruzada e ligação co-cruzada) são as formas de imobilização por
ligação, já oclusão em matriz (gel e fibras) e oclusão em membranas (encapsulação e
reatores de membranas) são as formas de imobilização por retenção física.

O gluteraldeído (OHC-[CH2]3-CHO, pentanodial) representa um dos compostos de

uso comum para formação de ligações cruzadas e ligações covalentes entre enzima e
 11

suporte. O grupo funcional aldeído (-CHO) se liga a um o mais grupos funcionais amino (-
NH2) da enzima conforme mostra as Equações 51 e 52 .

E-NH2 + OHC-[CH2]3-CHO Æ E-N=CH-[CH2]3-CHO (51)

E-N=CH-[CH2]3-CHO + E-NH2 Æ E-N=CH-[CH2]3-CH=N-E (52)
onde E-NH2 representa a estrutura da enzima com um dos grupos amino evidente.

A sucessiva ligações de gluteraldeído (G) a enzima (E) gera estruturas como a representada
na Figura (6):
...-E-G-E-G-E-G-P-G-E-G-E-....

G-E-G-E-G-E-G-P-G

...-E-G-E-G-E-G

Figura 6: uma possível estrutura de enzima(E), gluteraldeído (G) e proteína (P)

A ligação covalente de enzimas a suportes é feita por suportes com presença de grupos
diversos como o grupo amino (-NH2), hidroxila (-OH), carboxila e epóxido ( -CH CH2 )
e aldeído (-CHO, ex: no gluteraldeído). O

A Figura 7 apresenta exemplos de reações de imobilização envolvendo o suporte ligado a

diferentes grupos. O terceiro exemplo é um processo que utiliza suportes hoje já
disponíveis na forma ativada e o quarto exemplo é um dos vários tipos de silanizações
possíveis. As reações de silanização são usadas em vidros, sílica e óxidos metálicos como a
alumina.

Figura 7: ligação covalente de enzimas a suportes por quatro formas distintas de formação
das ligações covalentes enzima-suporte ativo.

Nas resinas onde não há ligações covalente resina-enzima, a imobilização no

suporte é ocasionada por forças de natureza eletrostáticas ou intermoleculares entre o
suporte e as moléculas da enzima. Entre as resinas disponíveis no mercado constam: resina
 12

catiônica Amberlite (grupo funcional que retém os cátions: ácido carboxílico), resina
hidrofóbica Amberlite (grupo funcional de natureza alifática apolar Entre as enzimas hoje
utilizadas industrialmente na forma imobilizadas em resinas de troca iônica constam:
lipase,β-amylase, aminocilase, glicose-isomerase, Rnase, lactase e lisozima.

Uma das formas de imobilização por oclusão em gel é o alginato de sódio (derivado
do ácido algínico proveniente de algas) com soluções de íons de cálcio ou outro íons(ex:
alumínio) capazes de gerar um gel insolúvel. Ao gotejar uma solução composta de alginato
de sódio e enzima na solução do íon cálcio (ou outro íon como o alumínio), ocorre a
formação de uma rede polimérica de cálcio e ácido alginato (veja a Figura 8) que é capaz
de reter a enzima. A eficiência do processo pode ser melhorada pela formação, em uma
etapa posterior, de ligações cruzadas utilizando, por exemplo, gluteraldeído.

Figura 8: modelo da estrutura do gel de alginato de cálcio

3.6- Extração e purificação de enzimas

A baixa concentração das enzimas no interior das células e no meio de cultura

fermentado, bem como outros fatores (ex: existência de diversas enzimas e substâncias no
meio onde se encontra a enzima; desnaturação da enzima ao por efeito do tempo,
temperatura, acidez do meio e ação microbiana) fazem com que o processo de purificação e
padronização de preparados enzimáticos seja essencial antes que os mesmos possam ser
utilizados em processos e produtos variados.

São as principais etapas associadas a obtenção das enzima para uso industrial e em
produtos: obtenção da matéria-prima ou, no caso de enzimas microbianas, fermentação para
obtenção da enzima; extração da enzima envolvendo o processo de ruptura celular para
enzimas intracelulares (via ultra-som, ação de detergentes e solventes, moagem entre outros
processos como processos enzimáticos); extração da enzima; purificação da enzima e
padronização do preparado enzimático.

A primeira etapa da purificação consiste na obtenção da enzima em meio líquido

pela trituração da fonte animal, vegetal ou ruptura de células ricas em enzimas, após esta
etapa é feita a filtração ou sedimentação do material insolúvel, e, então, a enzima é
purificada pelo uso de técnicas variadas como: fracionamento por solventes (ex: etanol e
 13

acetona), fracionamento por sais (ex: sulfato de amônio); fracionamento por variação da
acidez; e outras técnicas de custo mais elevado (ex: diálise; filtração em gel; eletroforese;
ultrafiltração; cromatografia e troca iônica). A escolha de uma ou mais das técnicas
combinadas entre as disponíveis depende do grau de pureza e escala de produção desejada.
O fracionamento com sal, também conhecido como salting-out, está relacionado
com a força iônica do sal (I). A Equação (53) relaciona a solubilidade a enzima (S) com a
força iônica do sal:
log (S)=a-b.I (53)
onde: a é a solubilidade hipotética na ausência de sal, b é a constante de precipitação e I é
a força iônica representada pela Equação (54).
1 n
I = ∑ Ci Z i (54)
2 i =1
onde Ci é a concentração da espécie iônica i, Zi é a carga do íon i e n é o número total de
íons presentes no meio onde está a enzima.

Intercepto: I=0, log(S)=a

log(S)
Solubilidade
real
Eq. (51)

I
Figura 8: Fracionamento de enzimas por salting-out

Quando se tem uma mistura de enzimas e proteínas, a adição progressiva de sal

gera, a baixas temperaturas, a obtenção de frações ricas nas diferentes enzimas e proteínas,
assim o processo gera a separação das enzimas e proteínas do meio líquido.

O fracionamento por alteração da acidez é conseguido quando a acidez do meio gera

a ausência de cargas na estrutura da enzima. Esta situação é conhecida como o ponto
isoelétrico (pI) e torna mínima as forças eletrostáticas repulsivas entre as moléculas das
enzimas, assim valores de pH próximos ao pI ocasionam a menor solubilidade de enzima o
que possibilita sua separação por insolubilização.

A extração enzimática com polietilenoglicol (PEG) é um método de interesse

prático pelo fato do PEG ser um composto que favorece a estabilização de enzimas e ser
fácil o processo de extração com PEG a custos atrativos. A adição de PEG em
concentrações de 25-30% gera precipitação por exclusão da água superficial da estrutura
protéica e a enzima é recuperada por centrifugação.

3.7- Uso de enzimas

 14

O mercado mundial de enzimas movimenta uma cifra superior a um bilhão de dólares

anuais com uma taxa de crescimento de 8 a 10% ao ano. Este mercado disponibiliza uma
grande variedade de enzimas sendo que os setor de alimentos, detergente e couro utilizam
grande quantidade de enzimas. A Tabela 2 apresenta exemplos de uso de diferentes
enzimas.

Tabela 2– Uso de enzimas

Vivemos em uma época perigosa. O homem domina a natureza antes que tenha
aprendido a dominar-se a si mesmo ( Albert Schweitzer)