Bactérias anaeróbias

Aeróbios Metabolismo na presença de O2

 Obrigatórios Exigem O2 como aceitador final de electrões

Anaeróbios Metabolismo na ausência de O2
 Facultativos Crescem aerobicamente, usando O2 como aceitador final de electrões e
anaerobicamente, obtendo energia pela fermentação de compostos orgânicos
 Estritos Incapazes de usar O2 e inibidas por ele
 Propriamente Não tolera [O2] maior que 0,5%
Estritos São membros da flora normal
 Aerotolerantes Toleram [O2] até 2-8%
Responsáveis pela maioria das infs.

Bactérias anaeróbias e toxicidade ao O2

Do metabolismo aeróbio bacteriano resultam espécies reactivas de O2

peróxido de hidrogénio

radicais hidroxilo

aniões superoxido
Estas espécies reactivas de O2 tornam-se tóxicas:

Causam danos no DNA

Destroem componentes lipidicos das células

Inactivam enzimas essenciais para as actividades metabólicas
Bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas têm enzimas protectoras

Catalase

Peroxidase

Superoxido dismutase
Conceito clássico – toxicidade do O2 nos anaeróbios dependia da ausência destas enzimas protectoras.
Actualmente:

Superoxido dismutase
 Produção induzida pela exposição ao O2 em Bacteroides e outros
 Os níveis de enzima são superiores nos Gram- que nos Gram+
 Correlacionam-se com o grau de tolerância ao O2 nos anaeróbios obrigatórios moderados
 Papel importante na tolerância ao O2 e na virulência de alguns anaeróbios

Catalase
 Produção demonstrada em Bacteroides, Peptostreptococcus e Propionibacterium
 Não se correlaciona com a tolerância ao O2

Peroxidase
 A sua actividade não foi demonstrada em anaeróbios.
As razões pelas quais outros anaeróbios (Clostridium perfringens) são capazes de sobreviver a exposições
de O2 superiores a 72h ou mais apesar da ausência de enzimas protectoras são desconhecidas.

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Bactérias anaeróbias são predominantes no organismo

Maioria das inf. são endógenas, provocadas por bactérias que ganham virulência ou passam para
locais estéreis onde se tornam patogénicas

A identidade dos anaeróbios associados com infs. especificas pode frequentemente ser previsível pelo
local do organismo envolvido

Passagem através de barreiras muco-cutâneas (trauma ou cirurgia), propagação a partir de zonas
contíguas, exp., por aspiração.

Algumas inf. são exógenas associadas a agentes esporulados:
 Botulismo – Clostridium botulinum
 Tétano – Clostridium tetani
 Gangrena Gasosa – Clostridium perfringes

Processo infeccioso envolve uma mistura de bactérias que actuam por sinergismo de virulência e
complementaridade metabólica – por vezes, associam-se a bactérias aeróbias que numa 1ª fase lhes
fornece alguns metabolitos.
SNC Abcessos cerebrais
Cabeça e pescoço Abcesso periodontal
Outras infs. orais
Pleuropulmonar Pneumonia por aspiração
Abcessos pulmonares
Pneumonia necrosante
Intra-abdominais Peritonites e abcessos
Tracto genital feminino Abcessos tubo-ovarianos
Abcessos vulvo-vaginais
Aborto séptico
Tecidos moles Gangrena gasosa (mionecrose)
Celulite crepitante
Fasceite necrosante

Colheita de amostras

Por aspiração com agulha e seringa

Amostra de tecido por biópsia

Zaragatoas – se possível, devem ser rejeitadas!
 Mais susceptíveis de contaminação
 Mais expostas ao O2 e à dessecação
 Não permitem a preparação de um bom esfregaço
 Colheita de pequeno volume de produto para amostra
Local Espécimen aceitável Espécimen inaceitável
Sangue Sangue
Dentes Aspirados endodentarios Raspados das superfícies
Aspirados de colecção purulenta gengivais, dos dentes ou mucosa
vizinha
Faringe Aspirados de abcessos com agulhas Zaragatoa
Seios Especimens colhidos por intervenção cirúrgica Irrigação ou aspirados

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perinasais
Área pulmonar Aspiração transtraquel Expectoração espectorada
Aspirados de colecções purulentas Aspirados nasofaríngeos
Colheira por operação Broncoscopia vulgar
Aspiração percutânea pulmonar Aspirado de traqueostomia
Liquido pleural
Aspirado por broncoscópio com protecção
terminal
SNC LCR
Área Aspirados por paracentese Conteúdo gástrico, Fezes
abdominal Bile Amostras intraluminares
Colheitas por intervenção cirúrgica Zaragatoa rectal
Tracto genital Culdocentese Descarga vaginal
feminino Colheita cirúrgica Amostras cervicais
Colheita por laparoscopia Corrimento colhido com zaragatoa
Espécimen da cavidade endometrial com curette Exsudado do endométrio
de sucção
Tracto urinário Aspirado de urina supra-púbico Urina
Tecidos moles Aspirados de feridas profundas Amostra superficial
Aspirados com agulha através de zonas intactas
Colheira cirúrgica

Transporte da amostra

Amostras mantidas a 37ºC

Evitar refrigeração das amostras – leva à diminuição do nº microrganismos viáveis

Em caso de atraso de 15-20 mins entre colheita e processamento

Velocidade de transporte tanto maior quanto menor a amostra colhida

Usados para pequenas amostras de tecido, fluidos aspirados ou especimens colhidos com zaragatoas

Tubos fechados ou frascos com uma atmosfera anaeróbica e base de agar isotonica que mantém
ambiente húmido – Port-A-Cul system, Anaerobic Transport Médium, Anaport e Anatube

Tubos de vidro ou plástico, com sistemas catalíticos para gerar um ambiente anaeróbico depois da
zaragatoa ser inserida – Vacutainer anaerobic specimen collector, Anaerobic Culturette system

Tubos com ambiente anaeróbico e meio de transporte reduzido – PRAS, anaerobic transport system,
anaerobic transport medium

Exame macroscópico

Inspecção visual – sugerem a presença de bactérias anaeróbias:
 Purulência
 Odor pútrido
 Tecidos necrosados
 Pus com “grãos de enxofre”

Exame com luz U.V. (360 nm) – pesquisa de fluorescência – vermelho tijolo: anaeróbios pigmentados
Porphyromonas e Prevotella

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Exame microscópico

Esfregaço corado pelo Gram – observação de morfologia típica de mts bacts
 Bacteroides – bacilo Gram- pouco corado, pleomórfico
 Fusobacterium – bacilo Gram- fusiforme e fino
 Veillonella – coco Gram- pequeno
 Actinomyces – bacilo Gram+ ramificado
 Clostridium perfringens – bacilo Gram+ largo e rectangular

Método de Gram - funciona como um controlo de qualidade
 Se espécimen transportada correctamente
 Se meio de isolamento foi apropriado
 Se sistema de incubação anaeróbico foi apropriado
 Se subcultura anaeróbica foi feita correctamente
 Se crescimento foi inibido pela presença de outras bactérias ou antibióticos

Microscopia de campo escuro e contraste de fase – demonstração de espiroquetas

Imunoflourescência com anticorpos monoclonais – rápida identificação de mts espécies anaeróbias,
caro, mts falsos + e –, não substitiu cultura

Outros procedimentos

Cromatografia gás-liquida (GLC) – analise directa dos AG de cadeia curta
 Culturas de sangue – com algum valor
 Analise directa de material purulento – pouco sensível e especifico

Testes serológicos – uso limitado, teste de antigenio do látex para Clostridium difficile

Selecção dos meios de cultura

Maioria das inf. são polimicrobianas
Vai depender – tipo de amostra, volume amostra, recursos económicos
Meios devem ser frescos e/ou pré-reduzidos

Meios não selectivos – devem ser enriquecidos com vit K1 e hemina
 Agar-sangue – crescimento de anaeróbios estritos e facultativos
 Brucella – bacilos Gram- anaeróbios
 Brain-heart
 Columbia
 CDC – cocos anaeróbios
 Schaedler – bacilos Gram- anaeróbios, alta dose de glicose, favorece crescimento de organismos
sacarolíticos
 Fastidious Anaerobe agar – Fusobacterium

Meios selectivos
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  BBE agar (Bacteroides bile esculin agar) – crescimento selectivo de B. fragilis, ocasionalmente
outras bactérias crescem: Fusobacterium, Klebsiella, Enterococcus
 KVLB agar (agar sangue lisado com vancomicina e kanamicina) – crescimento selectivo de
Bacteroides e aumenta a produção de pigmento nos Bacteroides pigmentados (Prevotella e
Porphyromonas); bacilos Gram- resistentes à kanamicina podem crescer neste meio
 Agar sangue de carneiro com álcool fenietil – crescimento da maioria dos anaeróbios Gram- e +;
inibe bacilos anaeróbios facultativos Gram-
 Agar sangue com colistina e acido nalidixico – crescimento dos anaeróbios estritos e facultativos
Gram +; maioria das bactérias Gram- são inibidas

Caldos – se sistema de incubação anaeróbico falhar, a espécimen em cultura não será perdida
 Meio de tioglicolato enriquecido com hemina e vit K1 – isolamento de anaeróbios de crescimento
lento, como Actinomyces
 Chopped meat broth (caldo de carne) – para isolamento de anaeróbios

Preparação das amostras para sementeiras

Volume liquido – concentração por centrifugação, semear o sedimento

Zaragatoa – extracçao suave num pequeno volume (0,5-1ml) de caldo de tioglicolato; semear o
espécimen no meio de cultura usando uma pipeta

Tecidos – homogeneização em 1ml caldo de tioglicolato suave e rápido, para evitar exposição ao O2

Usar sempre pipetas e ansas esterilizadas na inoculação dos meios

Incubação em anaerobiose
Composição habitual – 5% H2, 5% CO2, 90% N2
Sistemas produção de anaerobiose:
Jarra de anaerobiose Saco de Câmara de Roll tube
anaerobiose anaerobiose
Custo inicial Moderado Baixo Alto Moderado
Custo de Moderado Alto Moderado Moderado
manutenção
Tempo Baixo Baixo Moderado Moderado
Espaço Moderado Pequeno Moderado-grande Moderado
Outras Sistemas de válvulas 1 ou 2 placas, Sistema em Óptimo p/ espécies
características Sistema de evacuação- crescimento pode anaerobiose por extremamente
substituição ser detectado catalisador sensíveis ao O2,
Sistema gerador de gás examinando as palladium, reactivo não conveniente
Sistema Gás-Pak – placas pelo saco pelo calor a para isolamento de
catalisador palladium e transparente 160ºC/2h, ambiente anaeróbios
indicador de mantido seco por obrigatórios
anaerobiose gel de sílica (pode moderados
empobrecer associados às infs.
crescimento bact) humanas
Vantagens Simples, conveniente, Placas Placas Tubos
permite uso de técnicas inspeccionadas a inspeccionadas a inspeccionados a
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 convencionais qq momento sem qq momento sob qq momento sem
perturbar as condições de perturbar as
condições de anaerobiose, condições de
anaerobiose; isolamento anaerobiose
simples, segundo técnicas
conveniente, tradicionais
permite uso de
técnicas
convencionais
Desvantagens Possibilidade de Uso de apenas 2 Ocupa mt espaço, Tecnicamente
exposição prolongada placas, custo inicial difícil, difícil
das placas ao O2 possibilidade de elevado, consumo isolamento de
durante exposição de tempo elevado estirpes em cultura
inspecção/subculturas prolongada das pura, não permite
placas ao O2 obs da morfologia
durante celular típica
subculturas

Identificação das bactérias anaeróbicas

Presumptiva:

TSA – colistina, vancomicina, kanamicina

Provas bioquímicas - catalase, produção de indol, redução de nitratos, polianetolsulfonato de sódio,
crescimento em 20% bile, alanina peptidase, discos verdes brilhantes, urease, licitinase e lipase

Testes cromogénios – kits de identificação rápida (4-24h) – β-glicosidase, β-galactosidase, α-
glicosidase, α-fucosidase…
Definitiva

Cromatografia gás-liquida (GLC) – analise directa dos ac. gordos de cadeia curta

Testes bioquímicos PRAS – determinar actividade sacarolítica

Placas Presempto – testes diferenciais nos quadrantes das placas – I, II e III

Sistemas rápidos de identificação API 20 A, Minitek system, API-ZYM system
Dupla zona de

vancomicina

Crescimento

Produção de
em 20% bile
kanamicina

Redução de

Mobilidade
Morfologia

β-hemolise

peptidase

lecitinase
colistina
Esporos

Alanina
catalase

nitratos

Anaeróbios
urease
lipase
indol

B. fragilis B - - R R R + V + V - - - - -
B. pigmentados CB/B - - R V V - - + V - - V - -
B. ureolyticus B - - S S R - - - - + V - - V
Fusobacterium B - - S S R V - - V - - V - -
Veillonella C - - S S R - V - - + - - - -
Peptostreptococcus C - - V R S - V V V - - - - -
C. perfringens B + + S R S + - - - V - - + -
C. difficile B + - S R S + - - - - - - - +
Propionibacterium B - - S R S - + +/- +/- + - - - -
Eubacterium CB/B - - S R S - - V - + - - - -

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 Bactérias
anaeróbias

Bacilos anaeróbios, Bacilos anaeróbias, Cocos anaeróbios Bactérias

Gram +, Gram +, não Gram + anaeróbias
formadores de formadores de Gram –
esporos esporos

Actinomyces
Mobiluncus
Pele e mucosas (oral, TGI, genital) do Homem
Bifidocterium e animais
Eubacterium
Mts são oportunistas
Propionibacterium
Inf. graves com risco de vida
Lactobacillus
Crescimento lento

Actinomyces

Anaeróbios estrictos ou facultativos

Produção de inf. crónicas de desenvolvimento lento

Desenvolvimento de filamentos ou hifas – semelhante aos fungos

Crescimento lento em cultura – 2 semanas

A. israelli, A. meyeri, A. naelundii, A. odontolyticus, A. viscosus

Colonizam tracto resp. sup, TGI, TGU feminino

Baixa virulência – traumatismos, cirurgia, infs.

Actinomicose – macroscopicamente: “grãos de enxofre” amarelos ou laranja
 Cervicofacial, torácica, abdominal, pélvica, SNC

Sensíveis à penicilina e resistentes ao metronidazole

Propionibacterium Mobiluncus

Bacilos pequenos Gram + em cadeias curtas
Anaeróbios obrigatórios de crescimento lento

Na pele, conjuntiva, ouvido externo,
orofaringe, TGU feminino

Anaeróbios facultativos ou estritos, imóveis,
catalase +, fermentadores de carbohidratos co
produção de ác. propriónico

P. acnes – acne e inf. oportunistas

P. propionicus - canaliculite lacrimal e
abcessos
Lactobacillus

Bacilos anaeróbios facultativos ou obrigatórios

Boca, estômago e TGU (o + comum na uretra)

Frequentemente isolado na urina e sangue

Resistente à vancomicina

Bacteremia, endocardite, septicemia
oportunista

Tratamento – penicilina + aminoglicosídeo

Gram variável ou Gram –

Bacilos encurvados com extremidades afiladas

Classificados como Gram +
 Parede celular Gram+
 Falta de endotoxina
 Susceptível à vancomicina, clindamicina,
eritromicina e ampicilina
 Resistente à colistina

Vaginose bacteriana
Bifidobacterium e Eubacterium

Orofaringe, cólon e vagina

Baixa virulência – raramente causam infs.
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 Bactérias
anaeróbias

Bacilos anaeróbios, Bacilos anaeróbias, Cocos anaeróbios Bactérias

Gram +, Gram +, não Gram + anaeróbias
formadores de formadores de Gram –
esporos esporos

Eram classificados como Peptostreptococcus
Colonizam tracto resp.sup, TGI, TGU

Colonizam cavidade oral, TGI, TGU e pele

Infs ocorrem qd bacts. Passam destes locais
para outros estéreis
 Tracto resp. sup. – sinusite e inf.
pleuropulmonares
 TGI – inf. intrabdominais
 TGU – endometrite, abcessos pélvicos,
salpingite
 Pele – celulite, infs. tecidos moles
 Sangue – infs. ósseas

Dx lab difícil:
 Necessário meio de transporte para
prevenir contaminação com outros agente que
colonizem as mucosas
 Meio de transporte sem oxigénio
 Meios de cultura nutricionalmente ricos
 Incubação – 5-7 dias

Sensíveis à penicilina, metronidazole,
imipenem e cloramfenicol

Resistentes aos aminoglicosídeos (tds
anaeróbios)

Anaerococus, Fingoldia, Micromonas,
Peptostreptococcus, Schleiferella
(prevalentes)

Patogénicas possuem catalase e superóxido
dismutase – toleram exposição ao O2

Produzem enzimas citotóxicas

Causam infs. endógenas
 Tracto resp.
 Abcessos cerebrais
 Intrabdominais
 Ginecológicas
 Cutâneas e dos tecidos moles
 Bacteremia
 Gastroenterite

Meios selectivos
 Enriquecidos com bile
 Enriquecidos com sangue lisado – estimula
produção de pigmento por Prevotella e
Porphyromonas

Bacteroides – bacilos, crescimento estimulado
em meios com 20% bile, crescimento rápido (2
dias), sem endotoxinas
 B.fragillis – pleiomórfico, o + virulento,
produz BFT e β-lactamases , identificação:
 Gram e morfologia das colónias
 Resistência à kanamicina, vancomicina e
colistina
 Crescimento estimulado em meios com
20%bile
 Fusobacterium –
bacilos alongados,
produzem β-lactamases

Porphyromonas – bacilos assacarolíticos, bile-
susceptivel, pigmentados, produzem β-lactamases

Prevotella – bacilos pequenos sacarolíticos,
bile-susceptivel, pigmentados e não-pigmentados,
produzem β-lactamases

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 Bactérias
anaeróbias

Bacilos anaeróbios, Bacilos anaeróbios, Cocos anaeróbios Bactérias

Gram +, Gram +, não Gram + anaeróbias
formadores de formadores de Gram –
esporos esporos

Anaeróbios estritos

Ubiquitários – solo, água, TGI de humanos e animais

Maioria comensais
Clostridium
Capacidade de patogenicidade
 Sobrevivência em condições adversas pela esporulação
 Crescimento rápido em meios sem O2, enriquecidos nutricionalmente
 Produção
 Toxinas histoliticas
 Enterotoxinas
 Neurotoxinas

Clostridium perfringens Clostridium difficile

Bacilos grandes, rectangulares, Gram +
Anaeróbios estritos

Esporos raramente obs (in vivo/in vitro)
Infs. endógenas

Imóveis, crescimento típico de bacts. móveis
Diarreia pós-antibioterapia

Hemolíticos – zona dupla de hemolise pelas
Colite pseudomembranosa
toxinas α e β em agar-sangue
Produção:

Produção de toxinas letais: α, β, ε, ι  Toxina A = enterotoxina

5 tipos (A-E): A – infs. + freq  Toxina B = citotoxina
C – enterite necrosante  Hialuronidase

Produção de lecitinase (PLC) = α-toxina (lise)  Factores de adesão

Dça por exposição exógena ou endógena
Diagnóstico – detecção de enterotoxina ou

Infs. tecidos moles, celulite, miosite citotoxina nas fezes
supurativa, mionecrose ou gangrenas gasosas,
Tratamento – vancomicina e metanizadole
gastroenterite, intoxicação alimentar (auto-
limitada), enterite necrosante Clostridium botulinum

Tratamento – penicilina
Anaeróbios estritos

Crescimento lento
Clostridium tetani
Produção de 1 de 7 toxinas (A-G) – toxinas

Bacilo móvel, com esporos nas extremidades botulinicas (termo-labeis)

Difícil crescimento – anaeróbios estritos
Estirpes que causam dça produzem lipase,

Proteoliticos, não fermentam carbohidratos proteínas digerem leite, gelatinases, fermentam glicose

2 toxinas:
Dça humana – toxinas A, B, E e F
 Tetanolisina – hemolisina, oxigénio-labil
Botulismo – bloqueio da libertação de Ach –
 Tetanospasmina – neurotoxina termo-labil paralisia flácida
– provoca Tétano por desregulação da actividade
Isolar bacts – 10 mins a 80ºC
excitatória neuronial – paralisia espástica
Toxinas inactivadas se 10 mins a 60-100ºC

Vacinação com toxoide tetânico

Testes de neutralização antitoxina tetânica

Tétano:sistémico, localizado, cefálico,neonatal