Programa de Educao Continuada a Distncia

Curso de Microbiologia Geral

Aluno:

Educao a Distncia: Parceria entre Portal Farmcia On-line, Conselho Regional de Farmcia e Sindicato dos Farmacuticos

Curso de Microbiologia Geral

MDULO I

Ateno: O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos para este Programa de Educao Continuada, proibida qualquer forma de comercializao do mesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados a seus respectivos autores descritos nas referncias bibliogrficas.

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MDULO I
GLOSSRIO

Abcesso: coleo de pus localizada, leso fechada. Aerbico: crescimento na presena de oxignio molecular. Aerobiose. Aerosol: partculas que podem disseminar-se em suspenso fina no ar. Agar: extrato gelatinoso de algas marinhas utilizado como matriz de solidificao de meios de cultura. No digerido pelas bactrias. Aglutinao: reao na qual as clulas so agrupadas, ocorrendo a interao de um antgeno particulado com o anticorpo. Ala (inoculao): fio metlico com um anel retorcido na extremidade, utilizado para a transferncia de microorganismos, ou amostras clnicas, para meios de cultura. Alfa Hemlise: as colnias, no meio agar sangue, so circundadas por uma zona esverdeada, que representa uma forma incompleta de hemlise. Anaerbico: crescimento na ausncia de oxignio. Anaerobiose. Antibiograma: prova de verificao de sensibilidade ou resistncia bacteriana a determinadas drogas. Antibitico. Antimicrobiano: substncia qumica capaz de matar ou suprimir o crescimento de microorganismos. Antibitico. Antissptico: composto qumico que pode ser usado em superfcie ou tecido vivo e que inibe o crescimento bacteriano. Antissepsia: ato de matar ou previnir o crescimento de microorganismos na pele ou mucosas. Assepsia: condio na qual no existe microorganismos infecciosos ou contaminantes. Autoclavao: processo de esterilizao utilizando calor mido sob presso e alta temperatura. Autoclave. Bacilos lcool-cido Resistentes (BAAR): bacilos resistentes descolorao por uma soluo lcool-cida, durante a colorao pelo mtodo de Ziehl-Neelsen.

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Bacitracina: teste de laboratorio utilizado para identificao presuntiva de amostras de Streptococcus pyogenes. Bacteremia: presena de bactrias na corrente circulatria. Bactericida: agente capaz de matar bactrias. Bacteriosttico: agente que inibe o crescimento de bactrias. Bacteriria: presena de bactrias na urina. Beta Hemlise: clareamento completo no meio de agar sangue ao redor das colnias, devido a destruio total das hemcias pelas beta hemolisinas produzidas pelas bactrias. Beta Lactamases: enzimas que destroem ou inativam penicilinas e/ou cefalosporinas. Podem ser produzidas por uma variedade de microorganismos Gram positivos ou Gram negativos. Cpsula: camada mucide ou gelatinosa, geralmente incolor, que envolve a parede celular de algumas bactrias. Usualmente so de natureza polissacardica. Catalase: enzima produzida por algumas bactrias capaz de catalizar a degradao de perxido de hidrognio em gua e oxignio. Teste da catalase. Cateter: estrutura tubular flexvel usada para drenar fludos de cavidades ou vasos. Cistite: infeco urinria localizada na bexiga. Coagulase: enzima com atividade semelhante da protrombina, capaz de produzir a coagulao do plasma. Teste da Coagulase. Coleta: obteno de amostras clnicas para exame laboratorial. Colnia: massa uniforme de clulas derivadas de uma nica bactria crescendo em meio slido. Cultivo. Colonizao: crescimento bacteriano em determinadas reas anatmicas do organismo sem prejuzo para o hospedeiro. Flora Normal. Microbiota. Contaminao: presena indesejvel de microorganismos em uma cultura, amostra clnica, determinada rea anatmica ou material. Cultura: populao de microorganismos, macroscopicamente visvel, crescendo em um meio nutriente. Cultivo. Diplococos: cocos que ocorrem aos pares.

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Esfregao: suspenso ou amostra bacteriana espalhada de maneira uniforme sobre uma lmina de vidro, formando uma camada fina. Estril: isento totalmente de quaisquer microorganismos. Esterilizao: processo que destri todos os microorganismos vivos. Exudato: fludo formado de elementos oriundos do sangue, depositado em uma superfcie ou cavidade. Gastroenterite: sndrome caracterizada por sintomas gastrointestinais, incluindo nusea, vmito e desconforto abdominal. Gram (colorao): mtodo de colorao mais comumente usado em microbiologia para a observao diferencial de caractersticas morfolgicas das bactrias, dividindo-as em dois grandes grupos, proposto por Hans Chistian Gram. Gram Positivo: organismo que corado em roxo pelo mtodo de Gram. Gram Negativo: organismo corado em vermelho pelo mtodo de Gram. Hematria: presena de sangue (hemcias) na urina. Hemlise: destruio de clulas vermelhas do sangue com liberao da hemoglobina. Incubao: manuteno das culturas bacterianas em condies de temperatura e aerao favorveis ao seu crescimento. Infeco: invaso, multiplicao e disseminao de microorganismos patognicos no interior do corpo, geralmente resultando em doena infecciosa, a partir do aparecimento de sinais e sintomas. In Vitro: fora do corpo ou realizado em meios artificiais. In Vivo: no interior do corpo ou dentro de organismos vivos. Inoculao: introduo ou transferncia de amostras clnicas ou microorganismos para um meio de cultura estril, para subseqente identificao. Inculo. Meio de Cultura: preparao lquida ou slida contendo nutrientes, com finalidade de promover o crescimento de microorganismos para isolamento estudo. Cultura. Cultivo. Optoquina: teste de laboratrio utilizado na identificao presuntiva de amostras de Streptococcus pneumoniae. Petri (placa): recipiente circular, de vidro ou plstico, utilizado na cultura de microorganismos em meio slido. Piognico: formador de pus. 5
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Piria: presena de leuccitos polimorfonucleares na urina. Sensibilidade (teste): capacidade de um teste detectar corretamente a presena de uma doena. Septicemia: doena sistmica na qual microorganismos se multiplicam livremente na corrente circulatria. Termoestvel: que resiste ou no inativao pelo calor. Termolbil: inativado ou destrudo pelo calor, geralmente a 560C durante 30 minutos. Virulncia: propriedade relativa a capacidade dos microorganismos para causar doena. Patogenicidade. Ziehl-Neelsen (colorao): mtodo de colorao especfico para bactrias lcool-cido resistentes, como Mycobacterium tuberculois.

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BIOSSEGURANA
Biossegurana pode ser definida como o conjunto de medidas voltadas para a preveno, minimizao ou eliminao de riscos inerentes s atividades de pesquisa, produo, ensino, desenvolvimento tecnolgico e prestao de servios, que podem comprometer a sade do homem, dos animais, do meio ambiente ou a qualidade dos trabalhos desenvolvidos. A segurana antes de tudo um direito e uma obrigao individual. A Biossegurana laboratorial deve ser sustentada pelos planejamentos prvios das atividades, avaliao dos riscos, adequao das instalaes e na criao de barreiras. A utilizao de normas de segurana requer atitude, bom senso e boa conduta do profissional para a preveno de acidentes assegurar os resultados e a integridade das pessoas, instalaes e equipamentos. Em um laboratrio todos fazem parte de uma equipe, e a segurana depende da ao dessa equipe, para avaliar os provveis riscos e determinar as condies de segurana necessrias para o trabalho. Os ambientes voltados prtica de atividades relacionadas sade podem no parecer, para muitos, mas tambm um local de trabalho que no est livre de acidentes. O profissional de sade, como tambm, pacientes, visitantes, pessoal de apoio (limpeza e manuteno) e administrao, esto inseridos num grupo, que diariamente est em contato direto com elementos geradores de riscos em potencial, tais como equipamentos e substncias variadas, utilizadas em processos de limpeza e esterilizao. Quando no so orientados devidamente, no tocante segurana, tornam-se presas 7
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fceis desses elementos, que causam danos aos seus corpos, muitas vezes de forma irreversvel.

Regras Bsicas de Segurana

1. Use os culos protetores de olhos, sempre que estiver no laboratrio. 2. Use sempre guarda-p, de algodo com mangas compridas. 3. Aprenda a usar extintor antes que o incndio acontea. 4. No fume, no coma ou beba no laboratrio. 5. Evite trabalhar sozinho, e fora das horas de trabalho convencionais. 6. No jogue material insolvel nas pias (slica, carvo ativo, etc). Use um frasco de resduos apropriado. 7. No jogue resduos de solventes nas pias. Resduos de reaes devem ser antes inativados, depois armazenados em frascos adequados. 8. Em caso de acidentes, mantenha a calma, desligue os aparelhos prximos, inicie o combate ao fogo, isole os inflamveis, chame o Bombeiros. 9. No entre em locais de acidentes sem uma mascara contra gases. 10. Ao sair do laboratrio, o ultimo desliga tudo, e verificando se tudo esta em ordem. 11. Trabalhando com reaes perigosas, explosivas, txicas, ou cuja periculosidade voc no esta bem certo, use a capela, o protetor acrlico (Shield), e tenha um extintor por perto. 12. Nunca jogue no lixo restos de reaes. 13. Realize os trabalhos dentro de capelas ou locais bem ventilados. 14.Em caso de acidente (por contato ou ingesto de produtos qumicos) procure o medico indicando o produto utilizado. 15. Se atingir os olhos, abrir bem as plpebras e lavar com bastante gua. Atingindo outras partes do corpo, retirar a roupa impregnada e lavar a pele com bastante gua.

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Risco Fsico
Consideram-se agentes de riscos fsicos: rudo, vibraes, presses anormais, temperaturas externas, radiaes ionizantes, radiaes no ionizantes, ultra-som, materiais cortantes e pontiagudos, etc. Normas de Segurana em Laboratrio

1. Todo experimento dentro ou fora do expediente, que no tiver o acompanhamento do interessado, dever ter uma ficha ao lado, com nome, horrio de experimentao, reagentes envolvidos e medidas a serem adotadas em casos de acidentes.

2. Todo experimento que envolver certo grau de periculosidade exigir a obrigatoriedade de utilizao de indumentria adequada (luvas, culos, mscaras, pinas, aventais, extintores de incndio, Shield).

3. Cada laboratrio ou sala de experimento devera possuir os seguintes equipamentos (culos de segurana, mscara contra gases, saco de areia de 5 Kg, um cobertor e um chuveiro em funcionamento normal e caixas de primeiros socorros).

4. A utilizao de qualquer material que venha a prejudicar ou colocar em perigo a vida, ou sade dos usurios do ambiente, ou que causem incomodo, dever ser discutida ou comunicada ao responsvel do laboratrio, o qual sugerir e/ou autorizar o evento sob certas condies como avisos, precaues, horrio que deve ser feito, etc.

Equipamentos de Segurana

Os equipamentos de segurana relacionados a seguir devem estar ao alcance de todos os funcionrios. Certifique-se de que sabe us-lo corretamente.

extintores de incndio (p qumico e CO2);

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chuveiros de emergncia; lavador de olhos; aventais e luvas contra produtos corrosivos (de PVC); protetores faciais: mascaras e culos de segurana; luvas de amianto ou raspa de couro; mscaras contra gases; e mascara contra p (slica, asbesto).

Equipamentos de Ordem Pessoal (Nos laboratrios):

proibido pipetar qualquer tipo de produto com a boca. Trabalhe sempre com jaleco abotoado. proibido fumar. Use calado fechado, de couro ou similar. proibido usar roupas de tecido sinttico facilmente inflamvel. proibido colocar materiais de laboratrio no armrio de uso pessoal. proibido levar as mos boca ou aos olhos quando estiverem manuseando produtos qumicos e/ou biolgicos. Lave cuidadosamente as mos, com bastante gua e sabo, antes de fazer qualquer refeio. proibido colocar qualquer alimento sobre bancadas, ou guard-los em armrios e geladeiras de laboratrios. proibido utilizar vidrarias de laboratrio como utenslio domstico. proibido fazer refeies no laboratrio. proibido usar lentes de contato, pois estas podem ser danificadas por produtos qumicos, causando leses graves. proibido expor-se s radiaes ultravioleta, infravermelha ou de luminosidade muito intensa sem a proteo adequada. Feche toadas as gavetas e portas que abrir.

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Referentes ao Laboratrio

Mantenha as bancadas sempre limpas e livres de materiais estranhos ao trabalho. Faa uma limpeza prvia, com o solvente adequado, ao esvaziar um frasco de reagente; antes de coloc-lo para lavagem. Rotule imediatamente, qualquer reagente ou solues preparadas, utilizando as etiquetas padronizadas. Retire da bancada os materiais, as amostras e os regentes empregados aps terminar o trabalho. Jogue papis usados e outros materiais dispensveis e que no ofeream riscos, em lata de lixo especfica. Use pinas e materiais de tamanho conservao. Limpe, imediatamente, qualquer derramamento de produtos e reagentes; protejase, se necessrio, para fazer essa limpeza; use os materiais e recursos adequados. adequado e em perfeito estado de

Em caso de derramamento de lquidos inflamveis, produtos txicos, biolgicos, txicos e/ou corrosivos, tome as seguintes providncias: - Interrompa o trabalho; - Advirta as pessoas prximas sobre o ocorrido; - Solicite ou efetue a limpeza imediata; - Alerte sua chefia; - Verifique e corrija a cousa do problema.

Riscos Qumicos

Consideram-se agentes de risco qumico as substncias, compostas ou produtos que possam penetrar no organismo pela via respiratria, nas formas de poeiras fumos, nvoas, neblinas, gases ou vapores, ou que, pela natureza das atividades de exposio, possam ter contato ou ser absorvido pelo organismo atravs da pele ou por ingesto.

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Regras de segurana para manuseio de produtos qumicos: 1. Nunca manusear produtos sem estar usando o equipamento de segurana adequado para cada caso.

2. Usar sempre material adequado. No faa improvisaes. 3. Esteja sempre consciente do que estiver fazendo.

4. Comunicar qualquer acidente ou irregularidade ao seu superior e a Segurana. 5. No pipetar, principalmente, lquidos caustico ou veneno com a boca. Use aparelhos apropriados.

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6. No cheirar qualquer substncia.

7. Procurar conhecer a localizao do chuveiro de emergncia e do lava-olhos e saiba como us-lo corretamente. 8. Nunca armazenar produtos qumicos em lugares imprprios. 9. No fumar nos locais de estocagem e manuseio de produtos qumicos. 10. No transportar produtos qumicos de maneira insegura, principalmente em recipientes de vidro e entre aglomeraes de pessoas.

Risco Biolgico
Consideram-se agentes de risco biolgico as bactrias, fungos, parasitos, vrus, entre outros. Os agentes biolgicos apresentam um risco real ou potencial para o homem e para o meio ambiente. Por essa razo, fundamental que se prepare uma estrutura adequada para preveno dos riscos encontrados nos laboratrios. Os agentes se dividem em quatro grupos, segundo estes critrios: a patogenicidade para o homem, a virulncia, o modo de transmisso, a endemicidade e a existncia de profilaxia e/ou de teraputica eficazes.

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Classificao dos micorganismos por classes de risco:

Segundo a Resoluo no. 1 de 1998 do Conselho Nacional de sade, Cap. X art. 64, os microrganismos podem ento ser classificados em classes de risco de 1 a 4 por ordem crescente:

Classe 1 - onde se classificam os agentes que no apresentam riscos para o manipulador, nem para a comunidade (ex.: E. coli, B. subtilis);

Classe 2 - apresentam risco moderado para o manipulador e fraco para a comunidade e h sempre um tratamento preventivo (ex.: bactrias - Clostridium tetani, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus; vrus - EBV, herpes; fungos - Candida albicans; parasitas - Plasmodium, Schistosoma);

Classe 3 - so os agentes que apresentam risco grave para o manipulador e moderado para a comunidade, sendo que as leses ou sinais clnicos so graves e nem sempre h tratamento (ex.: bactrias Bacillus anthracis, Brucella, Chlamydia psittaci,

Mycobacterium tuberculosis; vrus - hepatites B e C, HTLV 1 e 2, HIV, febre amarela, dengue; fungos - Blastomyces dermatiolis, Histoplasma; parasitos - Echinococcus, Leishmania, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi);

Classe 4 - os agentes desta classe apresentam risco grave para o manipulador e para a comunidade, no existe tratamento e os riscos em caso de propagao so bastante graves (ex.: vrus de febres hemorrgicas). Medidas de segurana para riscos biolgicos:

conhecimento de risco pelo manipulador; A formao e informao das pessoas envolvidas, principalmente no que se refere a maneira como essa contaminao pode ocorrer, o que implica no conhecimento amplo do microrganismo ou vetor com o qual se trabalha;

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O respeito das Regras Gerais de Biossegurana e ainda a realizao das medidas de proteo individual; Uso do avental; Uso de luvas descartveis (e/ou lavagem das mos antes e aps a manipulao); Mscara e culos de proteo (para evitar aerossis ou projees nos olhos); Utilizao da capela de fluxo laminar corretamente, mantendo-a limpa aps o uso; Autoclavagem de material biolgico patognico, antes de elimin-lo no lixo comum; Utilizao de desinfetante apropriado para inativao de um agente especfico.

Transporte de produtos biolgicos

Os regulamentos sobre o transporte de agentes biolgicos so definidos de forma a segurar proteo ao pblico e aos trabalhadores da rede de transporte exposio a qualquer agente que possa estar presente na embalagem. As substncias infecciosas e materiais orgnicos para diagnstico precisam ser embalados em trs camadas:

1.receptculo impermevel gua, dentro do qual se encontra a amostra; 2.um segundo recipiente impermevel contendo quantidade suficiente de material absorvente entre suas paredes e o receptculo. Este recipiente dever conter uma etiqueta ou rtulo com a caracterstica da amostra; 3.uma embalagem externa destinada a proteger a segunda embalagem contra os fatores externos. Rotulagem adequada da embalagem com o smbolo risco biolgico e outro rtulo com o endereo da instituio.

Os transporte de amostras clnicas dentro dos setores do laboratrio necessitam de cuidados especiais para evitar que possveis acidentes possam ocorrer. transportar em recipiente impermevel e resistente a queda. os transporte de vidrarias deve ser feita o uso de carrinhos para frascos de grande porte e as de pequena proporo em bandejas

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Proteo Contra Incndio

Regras bsicas em caso de incndio no laboratrio: 1. Mantenha a calma. 2. Comece o combate imediatamente com os extintores de CO2 (gs carbnico). Afaste os inflamveis de perto. 3. Caso o fogo fuja ao seu controle, evacue o local imediatamente. 4. Ligue o alarme que fica no corredor (uma pequena caixa vermelha), quebrando o vidro para aciona-lo. 5. Evacue o prdio. 6. Desligue a chave geral de eletricidade. 7. V ate o telefone direto, na secretaria ou use o orelho na entrada do prdio. Bombeiro 193. 8. D a exata localizao do fogo (ensine como chegar l). 9. Informe se este um laboratrio qumico e que no vo poder usar gua para combater incndio em substncia qumica. Solicite um caminho com CO2 ou p qumico. OBS: Se a situao estiver fora de controle abandone imediatamente a rea e acione o alarme contra incndio localizado no corredor NO TENTE SER HERI CUIDADO: Quando o fogo irromper em um bquer ou balo de reao, basta tapar o frasco com uma rolha, toalha ou vidro de relgio, de modo a impedir a entrada de ar. Quando o fogo atingir a roupa de uma pessoa algumas tcnicas so possveis: - lev-la para debaixo do chuveiro; - h uma tendncia da pessoa corre, aumentando a combusto, neste caso, deve derrub-la e rola-la no cho at o fogo ser exterminado; - melhor no entanto embrulha-la rapidamente em um cobertor para este fim; - pode-se tambm usar o extintor de CO2, se este for o meio mais rpido. Jamais use gua para apagar o fogo em um laboratrio. Use extintor de CO2 ou p qumico. Fogo em sdio, potssio ou ltio. Use extintor de p qumico (no use o gs 16
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carbnico, CO2). Tambm pode usar os reagentes carbonato de sdio (Na2 CO3)ou cloreto de sdio (NaCl-sal de cozinha).

Sinalizao de segurana

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Esterilizao
Para o bom funcionamento de um laboratrio de microbiologia se faz necessrio um rigoroso controle que vai desde da limpeza geral de pisos e bancada a uma criteriosa esterilizao das vidrarias e de todo material (meios cultura) utilizados para realizao dos exames microbiolgicos. Detalharemos os mtodos de esterilizao mais utilizados no laboratrio de microbiologia. A esterilizao um processo de eliminao completa de micrbios que emprega mtodos fsicos, tais como forno Pasteur, estufa e autoclave, e qumicos, como xido de etileno, glutaraldedo e formaldedo. Normalmente so utilizadas embalagens para acondicionar os materiais durante a esterilizao para evitar contaminao posterior. O uso da esterilizao visa a inativao de agentes infecciosos, reduzindo o potencial de transmisso de doenas para os profissionais e pacientes. O ciclo de esterilizao pode ser subdividido em itens, mas na realidade todas as etapas so relacionadas, como em uma reao em cadeia, onde todos os processos so importantes, a saber: 1. material contaminado; 2. pr-lavagem com desincrustante; 3. lavagem em gua corrente; 4. secagem do material; 5. embalagem; 6. esterilizao; 7. armazenagem do material. NENHUM INSTRUMENTO DEVE SER ESTERILIZADO SE HOUVER SOBRE ELE MATRIA ORGNICA. A eficcia da esterilizao deve ser periodicamente monitorizada atravs do emprego de indicadores, sendo considerada o mtodo indicado para eliminao absoluta de todo material infeccioso, mas como a maioria dos protocolos requer treinamento especial para adequada preparao dos instrumentos com remoo de toda matria

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orgnica, preenchimento correto da cmara e operao do ciclo de esterilizao dentro de parmetros estritamente definidos. Dentre outros autores, consideram a autoclave o mais eficiente dos mtodos para a esterilizao.

Mtodo de Esterilizao

Existem 4 tipos de mtodos de esterilizao: 1. Irradiao; 2. Filtrao; 3. Substncias qumicas; 4. Calor: o mais confivel e amplamente utilizado.

1. Irradiao

A irradiao pode ser luz ultravioleta (<330nm de comprimento de onda); este mtodo utilizado em cmaras de segurana microbiolgica em laboratrios, mas exige que os olhos sejam protegidos, para preveno de dano. A irradiao pode ser usada como radiao ionizante por eltrons do cobalto-60 ou um acelerador linear para a esterilizao de artigos plsticos descartveis sensveis ao calor.

2. Filtrao

A filtrao j foi realizada por diferentes tipos de filtros, incluindo asbesto, cermica e vidro prensado, mas, atualmente, so mais utilizados os filtros de membrana de nitrocelulose. utilizada para a esterilizao de lquidos sensveis ao calor, incluindo soro e antibiticos.

3. Substncias Qumicas

O formaldedo (gs), a formalina (lquida), o glutaraldedo e o xido de etileno so esporicidas e viricidas e, por isto, conseguem esterilizar materiais. No entanto, estas 19
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substncias so txicas e irritantes e seu uso restrito. Formaldedo: era utilizado para desinfetar quartos aps a sada de pacientes com doenas infecciosas. Formalina: usada para fixar tecidos, mas como a formalina impede o crescimento de culturas bacterianas, ela no mais usada em laboratrios de microbiologia. Glutaraldedo: usada para a esterilizao de instrumentos invasivos que no podem ser esterilizados de outra forma, exemplo: broncoscpios, cistoscpios, equipamentos de anestesia e alguns plsticos. xido de Etileno: precisa estar confinado em um recipienteespecial, muitas vezes denominado bomba porque o gs explosivo quando em contato com o ar. utilizado para a esterilizao de artigos sensveis ao calor, tais como equipamentos de plstico, borracha e de material complexo.

4. Calor

O calor pode ser seco ou mido. O calor seco utilizado em: Incinerao: para a esterilizao de alas de metal, durante o repique de culturas bacterianas; Flambagem: utilizada para fixar lminas de microscpicos molhados com lcool metilado; Fornos com ar quente: 1600C por 60 minutos para bisturis, tesouras e substncias impermeveis ao calor mido (leo,cera); Radiao infravermelha: raramente utilizada hoje em dia.

O calor mido alcanado por meio da gua fervente ou da autoclavagem. A fervura em gua por 5,10 ou 20 minutos destri as clulas vegetativas, mas no necessariamente todos os esporos, portanto, no indicado para esterilizao. A autoclavagem o processo de esterilizao mais seguro e eficiente. Em bacteriologia a autoclave utilizada na esterilizao de material usado na preparao de meios de cultura e esterilizao em geral. 20
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A autoclave uma caldeira, construda por um tubo cilndrico e fechada hermeticamente com tampa de cobre ou bronze, fixada por vrios parafusos, munida superiormente por uma vlvula de segurana, um manmetro para registro de presso e uma torneira de escape do vapor dgua aquecida. Dentro da autoclave existe um cesto de metal para acondicionamento do material, deixando um espao entre o fundo do aparelho e a sua parte inferior, reservado para conter gua e as resistncias de aquecimento. Externamente h um interruptor indicando a potncia mnima, mdia e mxima de aquecimento, quando ligada uma ou as duas resistncias eltricas. A autoclavagem depende do vapor dgua sob presso e, por isto, a temperatura superior a 1000C (p.ex., 1210C por 15 minutos ou 1320C por 3 minutos). Estas combinaes de tempo e temperatura tm sido escolhidas porque os experimentos mostram que destroem esporos de clostrdios e outros esporos patognicos. O uso da autoclave confere muita eficincia ao processo de esterilizao, realizado atravs da desnaturao protica. No entanto, requer tambm bastante preparo de quem o manuseia. Os cuidados tm incio com a limpeza e secagem do material a ser esterilizado. Ele deve ser acondicionado em pacotes, tambores, caixas metlicas com furos e vidros com tampo de algodo ou papel. Devem ser acomodados adequadamente, sem compactao. So as seguintes as recomendaes do Ministrio da Sade (1994) para a esterilizao com autoclaves: 1. obedincia indicao do fabricante com manuteno preventiva, no mnimo semanal; 2. conhecimento e prtica da distribuio dos pacotes em relao posio dos mesmos e ao tipo de material submetido ao processo; 3. para invlucros o uso de tecido de algodo cru, embalagem de papel kraft ou de papel grau cirrgico; 4. a monitorizao deve ser realizada por testes biolgicos semanais; 5. identificao visual dos pacotes com fita termossensvel, para assegurar que o pacote passou pelo calor; 6. registro de controles de presso interna e externa das cmaras, da presso negativa e temperaturas a cada ciclo de esterilizao. 21
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Principais Mtodos de Colorao

De uma maneira geral, as bactrias tm afinidade por um grande nmero de corantes, principalmente aqueles do grupo dos derivados bsicos da anilina (azul de metileno, cristal vileta, fucsina bsica, etc). Dentre os mtodos existentes, aqueles que mais importncia apresentam dentro do laboratrio de microbiologia so os mtodos de GRAM e de ZIEHL-NEELSEN. Direto sem colorao 1. Salina Material: salina (soro fisiolgico 0,85% de cloreto de sdio), lmina e lamnula. Indicao: permite observar a morfologia bacteriana e avaliar a existncia de motilidade. Usada para pesquisa a fresco de Trichomonas em secrees, fungos (leveduriformes ou filamentosos) em diferentes materiais. Tcnica: gotejar a salina no centro de uma lmina de microscopia e nela suspender uma colnia ou uma alada do material a ser investigado. Cobrir com lamnula e examinar ao microscpio com objetivas de 40X ou 100X. 2. Hidrxido de Potssio Material: hidrxido de potssio em soluo aquosa a 10% ou 20%, lmina e lamnula. Indicao: usada para pesquisa de fungos (leveduriformes e particularmente

filamentosos) em material biolgico na presena de muco, restos celulares, plos, unhas, etc., por facilitar a microscopia dissolvendo a queratina e o muco, destacando as estruturas fngicas, quando presentes. Tcnica: colocar uma pequena amostra do material a ser pesquisado no centro da lmina; suspender o material com uma ou duas gotas de KOH; cobrir com lamnula e aguardar 30 minutos, ou aquecer ligeiramente a lmina para acelerar o clareamento; examinar com objetiva de 10X ou 40X, fechando o diafragma.

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3. Exame de Campo Escuro Material: microscpio com condensador de campo escuro e, quando possvel, objetiva de 100X com ris; lmina, lamnula, salina e leo de imerso. Indicao: empregado para observar a motilidade de bactrias dificilmente observadas em microscopia direta com salina, como o caso do Treponema pallidum e da Leptospira sp., podendo tambm ser usada para observar a motilidade do Campylobacter sp. e outras bactrias. Tcnica: Treponema pallidum: devem se atritar as bordas da leso suspeita com um swab ou ala bacteriolgica; colher o exudato com a prpria ala ou fazer um imprint com a lmina e cobrir com a lamnula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapidamente. Leptospira: um dos materiais mais utilizados a urina recm-emitida, centrigugada e examinado o sedimento. A microscopia em campo escuro realizada colocando-se leo de imerso, com objetiva de 100X. 4. Tinta da China (Nanquim) Material: tinta da China (nanquim), lmina e lamnula. Indicao: para pesquisa de criptococos em lquor ou outros materiais, permitindo destacar a cpsula deste fungo contra um fundo negro. Tcnica: o sedimento do lquor ou uma colnia do meio de cultura suspensa em uma gota de tinta da China, fazendo um filme bem delgado entre lmina e lamnula e observando em objetiva de 10X e 40X. Erro comum: confundir linfcitos com criptococos. A diferenciao feita atravs da observao do ncleo refringente e gemulao do fungo. Colorao de GRAM A colorao de GRAM recebeu este nome em homenagem a seu descobridor, o mdico dinamarqus Hans Christian Joaquim Gram. Em 1884, Gram observou que as bactrias adquiriam cores diferentes, quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classific-las em dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram-positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram23
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negativas. A colorao de Gram usada para classificar bactrias com base no tamanho, morfologia celular e comportamento diante dos corantes. No laboratrio de microbiologia clnica um teste adicional rpido para o diagnstico de agentes infecciosos, sendo tambm utilizado para avaliar a qualidade da amostra clnica analisada. As interpretaes dos esfregaos corados pelo Gram envolvem consideraes relacionadas com as caractersticas da colorao, tamanho, forma e agrupamento das clulas. Estas caractersticas podem ser influenciadas por vrios fatores, incluindo idade da cultura, o meio de cultivo utilizado, a atmosfera de incubao e a presena de substncias inibidoras. No se pode deixar de destacar que a colorao de Gram somente ser um recurso rpido e til quando for corretamente realizada (do ponto de vista tcnico) e interpretada por profissionais experientes. Modificaes do Mtodo de Gram

O mtodo original utilizava violeta-de-genciana. Hoje se utiliza outro tipo de cristal violeta, a violeta-de-metila. importante ressaltar que a soluo de violeta-de-metila, em sua preparao, j contm fixador qumico. Devido a isso, a fixao do esfregao em chama caiu em desuso e atualmente contra-indicada. O diferenciador h 100 anos era uma mistura de solventes. Hoje se usa apenas o lcool etlico (99,50 Gay Lussac), fazendo com que no haja o problema da hiperdescolorao. A modificao mais importante foi no corante secundrio, tambm chamado corante de fundo. A fucsina fenicada de Gram foi substituda pela safranina. Foi baseado no espectro de cores. A safranina mantm-se mais distante da violeta no espectro de cor, diferenciando com maior nitidez as bactrias Gram-negativas que se destacam das Grampositivas e da colorao de fundo, que assume a cor vermelho-claro. Colorao de Gram

1. cubra o esfregao com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos; 24

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2. adicione igual quantidade de gua sobre a lmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por 45 segundos; 3. escorra o corante e lave em um filete de gua corrente. Cubra a lmina com lugol diludo (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto; 4. escorra o lugol e lave em um filete de gua corrente; adicione lcool etlico (99,50 GL) sobre a lmina, descorando-a, at que no desprenda mais corante; 5. lave em um filete de gua corrente; 6. cubra a lmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos; 7. lave em um filete de gua corrente; 8. deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com auxilio de um papel de filtro limpo; 9. coloque uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e; 10. leia em objetiva de imerso (100X). Princpio de Funcionamento Tanto a espessura da parede celular, quanto as dimenses dos espaos intersticiais, por exemplo, dimetro do poro, parecem ser determinantes do resultado final da colorao de Gram. Quando as estruturas celulares so cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram de roxo. Com a adio do lugol, tambm chamado de mordente, ocorre a formao do complexo iodo-pararosanilina. Esta reao tem a propriedade de fixar o corante primrio nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como o lcool etlico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou no perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas. As bactrias que tm a parede celular composta por murena (peptdeoglicano peptdeo de cido n-acetil murmico), durante o processo de descolorao com lcool etlico, retm o corante. J as bactrias com parede celular composta predominantemente por cidos graxos (lipopolissacardeos e lipoprotenas) perdem o complexo iodopararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo.

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Mtodo de Ziehl-Neelsen O mtodo de Ziehl-Neelsen baseia-se no fato da lcool-cido resistncia de determinadas bactrias (p. ex: Mycobacterium tuberculosis), o que permite trat-las com uma soluo de fucsina fenicada a quente. Tais bactrias resistem ao tratamento posterior com uma soluo de lcool+ cido clordrico (HCL 3% em etanol), mantendo-se com a colorao inicial vermelha (Bacilos lcool-cido Resistentes ou BAAR), enquanto outras descoram-se e vo apresentar a colorao de fundo, normalmente feita com azul de metileno. Procedimento da colorao Em lmina nova, fazer um esfregao homogneo, delgado e fixado ao ar livre (recomenda-se haver circulao de ar). Colorao: 1. adicione a fucsina sobre o esfregao previamente fixado; 2. faz-se o aquecimento at a emisso de vapores, por 3 vezes, para facilitar a penetrao da fucsina; 3. derrama-se o corante na pia e lava-se o esfregao com gua; 4. faz-se a descolorao com lcool-cido e lava-se o esfregao com gua. Apenas os BAAR presentes no esfregao retero a fucsina; 5. adiciona-se o azul de metileno; 6. lava-se o esfregao com gua e faz-se a leitura.

Se houver BAAR na amostra eles ficaro vermelhos devido a reteno da fucsina e sero vizualizados microscopicamente. O fundo azul no esfregao, faz o contraste para essa vizualizao.

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Coleta e Transporte de Amostras

O laboratrio responsvel por fornecer instrues para uma correta coleta de espcimes a serem analisados, bem como para o seu adequado transporte at o laboratrio. Estas instrues devem estar disponveis para todos os funcionrios que lidam com esse tipo de procedimento. Nelas devem ser includos: 1. propsito do teste e limitaes; 2. critrio de seleo dos pacientes; 3. tempo de coleta dos espcimes (p. ex.: antes da administrao de

antimicrobianos); 4. coleta em stios apropriados; 5. mtodos padronizados para a coleta de espcimes; 6. dscrio do(s) meio(s) de transporte, incluindo o propsito, temperatura de incubao e prazo para a entrega ao laboratrio; 7. instruo para armazenamento das amostras, caso no seja possvel a entrega imediata ou o seu processamento; 8. disponibilidade de execuo do teste; 9. prazo para entrega dos resultados.

Outras informaes crticas incluem: o paciente est em uso de antimicrobianos? H suspeita de algum agente etiolgico ou sndrome? Histria de imunizao (caso aplicvel). O laboratrio deve tambm estabelecer critrios para rejeio de espcimes. Exemplos incluem: amostra no identificada ou mal identificada; uso de meio de transporte imprprio; excessivo tempo de transporte sem a devida conservao da amostra; temperatura imprpria durante o transporte ou armazenamento da amostra; amostras enviadas fora dos recipientes dos meios de transporte.

Algumas vezes, mesmo sabendo que o espcime no adequado para anlise, o 27

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mdico pede para que ainda assim seja analisado. Caso a anlise venha a ser feita, o responsvel tcnico pelo setor deve incluir no final do laudo uma indicao de que o espcime no fora coletado corretamente e que os resultados devem ser interpretados com cautela. Os critrios para uma correta coleta de amostra sero descritos posteriormente, nos captulos especficos de cada identificao bacteriana.

------ FIM MDULO I -----

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