Projeto: Diretrizes de Polticas Pblicas para a Agroindstria Canavieira de So Paulo. Workshop Produo de etanol: Qualidade da matriaprima.

Efeito de fatores inibidores na fermentao alcolica.

Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto Faculdade de Cincias e Letras de Assis UNESP poliva@assis.unesp.br

INTRODUO
Para dimensionar os fatores biticos e abiticos que inibem a fermentao alcolica industrial necessrio reconhec-los e avali-los de forma sinrgica. Dentre os fatores destacam-se : 1. qualidade do substrato a ser fermentado 2. pH e temperatura de processo 3. teor alcolico 4. aditivos qumicos (cidos, biocidas, antibiticos, ons Ca, P ) 5. contaminaes microbianas com produo de cidos e outros 6. floculao celular 7. qualidade da centrifugao do fermento 8. tipo de processo fermentativo. 9. dimensionamento da planta 10. limpeza e assepcia

Nesta apresentao ser dada ateno a alguns destes fatores relacionados qualidade da matria-prima, parmetros de processo e efeito de contaminaes microbianas, sempre sobre o prisma do efeito sinrgico com outros fatores. Quando me refiro matria-prima para a fermentao alcolica, me refiro, em especial, ao melao e caldo de cana, pois atualmente, estes dois componentes compe o mosto, sendo o primeiro mais problemtico do que o segundo para a fermentao alcolica. Alguns parmetros que podem ser inibidores da fermentao alcolica so apresentados a seguir,os quais se pretende avali-los de forma detalhada:

Efeito de cidos orgnicos

O cido ltico (forma no dissociada) pode entrar na clula diretamente por difuso simples, na presena de glicose no meio. Os cidos actico e frmico so mais solveis nos lipdeos da membrana da levedura que o ltico (que contm uma OH- extra, inibindo o crescimento da levedura numa concentrao inferior ao ac. Ltico. - interfere na energia de manuteno celular - reposio celular e crescimento, - gasto ATP com as permeases de membrana para manuteno do pH I, - interferncia na absoro de nutrientes ex. Fsforo atravs da interferncia no mecanismo de transporte Symport (glicose, H+ e fsforo). - consumo de glicose endgena (trealose ou glicognio) ou externa. Quando o pH externo est abaixo de 4 triplica a atividade da ATPase, dobrando sua afinidade pelo ATP, sem contudo alterar seu pH timo (ERASO & GANCEDO , 1987).

Efeito do pH do meio no metabolismo da levedura

Gradiente de pH gera a fora extruso consumo proton motiva de prtons glicose via ATPases

excesso acidez

aumento H+

maior velocidade

no limite ocorre acidificao interna e pHi

entrando clula das permeases e consumo gli

inibio das enzimas e da prod. ATP

inibio da viabilidade, morte e queda rendimento etanol

Efeito do sulfito
Sulfito em soluo aquosa existe em 3 formas dependendo do valor do pH. SO2 HSO3- SO3 2 pK entre SO2 HSO3- = 1,77 e entre HSO3- SO3 -2, pK = 6,9 . O dixido de enxofre molecular txico para bactrias lticas e em menor grau para leveduras. O HSO3- (bissulfito) inibe a zinco desidrogenase alcolica, portanto a fermentao. O Sulfito mais letal para bactrias no pH mais cido (pH 4,0), predomnio da forma HSO3- . Na fermentao industrial o efeito do sulfito claro na acidez total do vinho (o normal 1,8-2,5 g/L e aumenta para nveis de at 3-5 g/L) e como conseqncia temos: queda da viabilidade e nmero de clulas vivas. queda do brotamento celular e queda na eficincia alcolica via reproduo de mais fermento para reposio das perdas. aumento da atividade tamponante do meio, maior consumo de cidos e bases no processo. em casos mais graves, aumento exagerado na acidez do lcool produzido.

Efeito da Temperatura
A temperatura outro fator importante que pode levar a inibio da levedura e do processo. S. cerevisiae tolera at 33C em condies industriais para produo de etanol, apesar desta sp ter uma faixa de crescimento mnima de 10C e mxima de 40C, estando a temperatura tima entre 28C e 35C (JONES et al, 1981). O sinergismo entre cidos orgnicos e temperatura ocorre levando a um efeito inibidor potencializado. A faixa de crescimento de S. cerevisiae encurtada de 3-42OC para 19-26oC. na presena de 1% v/v de cido actico (Tereza-Ramos e Madeira-Lopes , 1990). A temperatura estimula o acmulo de trealose. Segundo HOTTIGER (1987), um choque trmico, com mudana de 27C para 40C por uma hora resulta em um rpido e grande acmulo de trealose. Tal choque induz a um aumento de seis vezes na atividade da trealose-P-sintetase.

100 90 80 % de clulas vivas 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 te m po e m hor as 38 C 40 C 45 C 50 C 55 C 65 C 30 40

Viabilidade das clulas de levedura de panificao durante a autlise em diferentes temperaturas

Efeito inibitrio do Etanol

- alteraes da composio da camada lipdica da membrana, - sntese de protenas estressoras, na modulao dos processos de troca inica, - reduo de atividades metablicas como causa da inibio do transporte de glicose, diminuindo a viabilidade, formao de produto e causando estresse hdrico (Hallsworth, 1998, Martini et al., 2004). - A toxidade do etanol em concentraes elevadas (acima de 10% p:v), limita o seu rendimento e produtividade durante a fermentao industrial (Walker-Capriolo et al., 1985) e diminui a tolerncia temperaturas mais altas .

Fatores de estresse fisiolgico que levam ao aumento da energia de manuteno celular, queda viabilidade, produo de etanol e reservas energticas causando instabilidade do processo fermentativo

Sinergismo entre cidos fracos, pH, etanol, presso osmtica do meio, temperatura afetando de forma potencializada a Fora Prton Motiva.
Quando por ex. o pH externo cai de 6 para 3 aumenta a sensibilidade da levedura ao etanol, dissipando a fora protomotiva da membrana. Esse feito aumentado na presena de cidos orgnicos fracos, principalmente quando o pHi da clula est abaixo do pKa dos cidos, aumentando a forma indissociada do cido e aumentando a toxidez pelo etanol, de modo sinergstico, como ocorre com o cido actico. O etanol em concentraes de 6 e 8% (v/v) ativa (acelera) a ATPase da membrana plasmtica de Saccharomyces cerevisiae, industrialmente trabalha-se com 9-9,5% de etanol, portanto no limite do metabolismo da levedura. Efeito do pH baixo ocasiona a perda de nutrientes como nitrognio e potssio, bem como aumenta a sensibilidade ao etanol, aos cidos orgnicos e ao SO2. Elevada Presso osmtica do meio pode aumentar a toxicidade do cido ltico que em baixa Presso Osmtica (0,6) inibe o crescimento de S.cerevisiae a partir de 5 g/L , em alta presso osmtica (1,6) inibe a partir de 2,5 g/L. (Ngang et al. 1989).

Sinergismo entre cido ltico, Sulfito, pH e etanol na fermentao de Saccharomyces cerevisiae Pe-2 e M-26.

Tese de Doutorado da aluna: Claudia Dorta Orientao: Prof. Dr. Pedro de Oliva Neto UNESP Campus de Rio Claro e Assis

Publicao: Dorta, C. Oliva-Neto, P. Synergism among lactic acid, sulfite, pH and ethanol in alcoholic fermentation of Saccharomyces cerevisiae (PE-2 and M-26). World Journal of Microbiology and Biotechnoloy , vol. 22, p. 177-182, 2006.

Objetivo
Verificao dos efeitos sinrgicos de estresse durante a fermentao etanlica, podendo assim estabelecer parmetros reais para um aprimoramento na produo de lcool carburante.

Tabela 1: Formulao de meios fermentativos com os fatores de estresse: etanol, cido ltico sulfito e pH.
______________________________________________________________________ TC sulfito (mg/L) cido ltico etanol pH toxicidade M (meio) (NaHSO3) (g/L) (% p:v) ______________________________________________________________________ 1 32 200 6,0 9,5 3,6 mxima 2 32 50 6,0 9,5 3,6 - sulfito 3 32 200 2,0 9,5 3,6 - c. lt. 4 32 200 6,0 7,5 3,6 - etanol 5 32 200 6,0 9,5 4,5 pH normal 6 32 0 0 7,5 4,5 controle _____________________________________________________________________

80 70 Viabilidade celular (%) 60 50 40 30 20 10 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

Figura 1: Efeito de diferentes estresses associados na viabilidade celular das linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae P-2 e M26 aps a fermentao etanlica.

Figura 2: Efeito da fermentao em M5 sobre as clulas da linhagem Pe-2.

Figura 3: Efeito da fermentao em M1 sobre as clulas da linhagem PE-2.

20 18 16 Brotamento (%) 14 12 10 8 6 4 2 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

Figura 4: Efeito de diferentes estresses associados na taxa de brotamento das linhagens de levedura Saccharomyces cerevisiae Pe2 e M26 aps a fermentao etanlica.

450
L e d H (u o d H / h g ib ra o e + m les e + / )

400 350 300 250 200 150 100 50 0 To 5 o Ciclo 7o Ciclo

Ciclo fermentativo

Figura 5: Efeito de diferentes mostos com estresses associados na atividade da bomba de prtons, aps o processo fermentativo por S cerevisiae P-2. M1, M2, M3, M4, M5, M6.

Tabela 2. cidos orgnicos totais produzidos durante a fermentao alcolica por S. cerevisiae M-26 e PE-2.
______________________________________________________________________ Mdia cidos orgnicos totais(g l-1) ______________________________________________________ M-26 PE-2 ________________ _______________ M* DP * M* DP * ______________________________________________________________________ M1 14.97 1.76 10.86 3.68 M2 15.88 0.67 12.25 2.60 M3 12.02 1.37 8.50 1.96 M4 13.30 1.00 8.06 2.90 M5 14.65 1.00 11.00 2.28 M6 10.62 1.15 8.00 2.00 ______________________________________________________________________ *M= mdia, *DP= desvio padro. Obs. Somatria dos cidos ltico, actico, succnico, acontico, tartrico.

12 Trealose (g.100g-1 massa seca ) 10 8 6 4 2 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios de fermentao

Figura 6: Concentrao de trealose em linhagens de Saccharomyces cerevisiae PE-2 e M-26 durante diferentes condies de fermentao. ( ) PE-2, To-1o ciclo ; ( ) PE-2, 7o ciclo -12h; ( ) M-26, 1o cicloTo; ( ) M-26, 7 o ciclo-12h.

Concentrao de protena residual (mg/ mL)

45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

Figura 7: Efeito de diferentes estresses associados na formao de protena residual no mosto fermentado pela linhagem S. cerevisiae M-26 PE-2

3 2,5 2 ARRT (%) 1,5 1 0,5 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

Figura 8: Efeito de diferentes estresses associados na formao de ARRT aps a fermentao de S. cerevisiae P-2 e M26 .

90 Rendimento etanlico (%) 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

Figura 9: Efeito de diferentes estresses associados no rendimento etanlico obtido da fermentao de S. cerevisiae P-2 e M26 .

12 Produtividade etanlica(g/L.h) 10 8 6 4 2 0 M1 M2 M3 M4 M5 M6 Meios fermentativos

Figura 10: Efeito de diferentes estresses associados na produtividade etanlica obtido da fermentao de S. cerevisiae Pe-2 e M26 .

Concluses do trabalho
O pH baixo do meio demonstra ser o fator de maior estresse fisiolgico para Saccharomyces cerevisiae obtida e utilizada em destilarias de produo de etanol carburante, quando comparado com outros fatores (sulfito, cido ltico e teor alcolico elevado). O pH 4,5 no mosto permite uma proteo contra os fatores de estresse estudados, obtendo-se maior viabilidade celular, brotamento, rendimento alcolico, morfologia regular das leveduras, diminuio no acar residual e menor liberao de aminocidos no meio, propiciando melhor eficincia alcolica e estabilidade do processo. O desenvolvimento da tecnologia de produo do bioetanol deve contemplar procedimentos que preservem a fora prton-motiva da levedura tais como: mostos com pH mais adequados, e eliminao de mtodos que envolvam aumento da concentrao hidrogeninica do meio.

Perspectivas para a melhoria da matria prima usada na fabricao do bioetanol

Clarificao do melao de cana 1. considerando-se que o melao provoca aumento da acidez e sulfito, no mosto, o que prejudicial levedura e ao processo. 2. Aumento de clcio no mosto, estimulando a floculao celular 3. A quantia de ART via mel na composio do mosto ser superior do caldo de cana. 4. Aumento do poder tamponante do mosto o que impacta em maior gasto com cido sulfrico no p-de-cuba. 5. A eficincia na eliminao de sais, incluindo o sulfito via clarificao do melao, a qual pode chegar a 90% Justifica-se a implementao deste procedimento em escala indutrial, porm necessrio um decantador separado da linha de fabricao de acar, maior entrave hoje .

Controle na deteriorao da cana

mais fcil evitar a entrada de molculas e microrganismos indesejveis no processo industrial, do que retir-los do sistema. Cana deteriorada no campo rica em biopolmeros e microrganismos que causam distrbios no processo industrial, tanto para a linha de acar, como para a de etanol. Por isso necessrio um eficiente planejamento entre a rea agrcola e a industrial, para evitar a deteriorao da cana no campo. Em meses quentes e chuvosos, a deteriorao pode chegar a infeces microbianas da ordem de 10 bilhes de clulas por ml de caldo de cana.

Com a lei obrigando a mecanizao do corte , onde a cana cortada em tamanhos menores, haver mais rea exposta a deteriorao e maior controle neste planejamento dever ser feito. Investimentos em pesquisa e desenvolvimento de mtodos de controle biolgico de insetos devem ser feitos para melhorar a tecnologia hoje disponvel no Brasil.

Assepsia da moenda
A qualidade do mosto a ser fermentado depende muito do grau de assepcia da moenda. Para a assepcia da moenda em condies de processo, apenas alguns biocidas so utilizados, e com baixa eficincia nas dosagens recomendadas. A limpeza fsica s feita nas paradas. Mtodos de CIP (clean in place) deveriam ser estudados, em especial nos locais considerados pontos crticos, onde biofilmes so formados. Pesquisas de novos produtos antimicrobianos so necessrios, de preferncia produtos naturais com comprovada inocuidade ao ser humano e meio ambiente.