NILZA ALZIRA BATISTA

AVALIAO DO COMPORTAMENTO DO HIDROGEL LCOOL

DE POLIVINIL (PVA) ACETALIZADO E IRRADIADO
COMO SUBSTITUTO DA CARTILAGEM ARTICULAR
IMPLANTADO EM JOELHOS DE RATOS

CAMPINAS
Unicamp
2011
i

ii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Cincias Mdicas

AVALIAO DO COMPORTAMENTO DO HIDROGEL ALCOOL

DE POLIVINIL (PVA) ACETALIZADO E IRRADIADO
COMO SUBSTITUTO DA CARTILAGEM ARTICULAR
IMPLANTADO EM JOELHOS DE RATOS

NILZA ALZIRA BATISTA

Dissertao de Mestrado apresentada Ps-Graduao da

Faculdade de Cincias Mdicas da Universidade Estadual de
Campinas para obteno do ttulo de Mestre em Cincias,
rea

de

concentrao

em

Fisiopatologia

Cirrgica,

sob orientao do Prof. Dr. William Dias Belangero e

co-orientao da Profa. Dra. Vanessa Petrilli Bavaresco

Campinas
2011
iii

iv

vi

 todos
que de maneira direta ou indireta
contriburam para que este trabalho se tornasse real.
Ao meu companheiro de todos os dias,
Hamilton Cesar
pela pacincia, compreenso, carinho e
incentivo ilimitados.
Aos meus queridos
Joo e Andr
que foram privados da minha ateno,
para esta realizao.
s minhas irms
Regina e Marisa
que, como sempre,
me substituram na minha ausncia
dando toda a ateno aos meus amados Joo e Andr.

vii

viii

AGRADECIMENTOS

Ao TODO PODEROSO por iluminar todos meus dias e ser motivo

essencial para no deixar desistir jamais dos meus objetivos.
Ao Professor Dr. William Dias Belangero, pela pacincia, orientao e
disponibilizao das dependncias do LABIMO para a realizao deste.
Ao Bilogo amigo William Adalberto Silva do Laboratrio de Tcnicas
Cirrgicas do NMCE/FCM por ter me feito tomar gosto em trabalhar com animais
para o bom e confiante resultados aqui alcanados.
minha amiga Ana Amlia autora co-adjuvante deste por colaborar
diretamente nos experimentos e pela interminvel discusso diante dos resultados
obtidos.
minha querida co-orientadora Vanessa pela amizade surgida nesses
anos de trabalho em conjunto, pelos esclarecimentos e incentivo contnuo...
Obrigada!
Ao mais recente companheiro de trabalho Jos Ricardo Lenzi Mariolani
pelas sugestes aqui registradas.
biloga Claudenete Vieira Leal, do Laboratrio de Microscopia
Eletrnica da FEM pela execuo da microscopia eletrnica de varredura.
Aos tcnicos de Laboratrio Jos Luiz Lisboa, Eder Scrates da
FEM/DEMA e Moiss do Cotuca pela disponibilidade em realizar os ensaios
mecnicos.
Aos doutores Arnaldo Rodrigues dos Santos Jr. da Universidade
Federal do ABC e Luis Antonio Violin Dias do Instituto de Biologia da Unicamp
pelas anlises das lminas de histologia.
ix

"H muitas pessoas de viso perfeita que nada vem...

O ato de ver no coisa natural.
Precisa ser aprendido!"

Rubem Alves

xi

xii

RESUMO

xiii

xiv

Hidrogel de lcool de polivinil (PVA) foi utilizado como potencial reparador de

defeitos osteocondrais da cartilagem articular. A citotoxicidade in vitro foi avaliada
com clulas Vero e clulas-tronco mesenquimais da medula ssea de ratos
Wistar-Kyoto. Para anlise in vivo, os implantes foram colocados em defeitos
produzidos nos joelhos de ratos Wistar. Aps tempos de seguimento de 0, 3, 6,
12 e 24 semanas, as amostras foram analisadas por microscopia ptica
convencional, ensaio mecnico de fluncia indentao, espectrometria de
fluorescncia raio X e microscopia eletrnica de varredura. Os resultados in vitro
motraram que o hidrogel de PVA no afetou a atividade metablica de ambas as
clulas estudadas, nem tampouco a diferenciao osteognica das clulas
mesenquimais. Atividade da enzima fosfatase alcalina e formao de matriz
mineralizada foram identificadas. O PVA implantado no apresentou sinais de
desgastes ou qualquer mudana de aspecto quando comparado com o dia do
implante. A interface do implante/tecido mostrou a formao e manuteno de
tecido conjuntivo denso e osso recm-formado em todos os grupos estudados.
Foi observado um aumento no mdulo de fluncia e concentrao de clcio e
fsforo no PVA longo do tempo. O desempenho do higrogel de PVA irradiados e
acetalizadas foi considerado satisfatrio para a aplicao proposta.

Palavras-chave: Hidrogel, lcool de polivinil, defeitos, cartilagem articular,

biomateriais.

Resumo

xv

Resumo

xvi

ABSTRACT

xvii

xviii

Irradiated and acetalized polyvinyl alcohol (PVA) hydrogel was investigated as a

potential material for osteochondral defect repair in articular cartilage. The in vitro
cytotoxicity of the material was evaluated with Vero cells and mesenchymal stem
cells from bone marrow of Wistar-Kyoto rats. For in vivo analyses, plugs of the
material were implanted into defects produced in the knees of male Wistar
rats-WH. After follow-up times of 0, 3, 6, 12 and 24 weeks, the samples were
analyzed

by

conventional

optical

and

scanning

electron

microscopy,

X-ray fluorescence spectrometry and submitted to mechanical testing of creep

indentation. The in vitro results suggest that the PVA hydrogel did not affect the
viability and morphology of any of the cell types studied. The hydrogel affected
neither the metabolic activity of both studied cells nor the osteogenic differentiation
of the mesenchymal cells. Activity of alkaline phosphatase and mineralized organic
matrix formation could be identified. The implanted plugs showed no sign of wear
or aspect change. The interface plug/tissue exhibited dense connective tissue and
newly formed bone in all groups. It was observed an increase in the creep modulus
and in the concentration of calcium and phosphorus in the PVA over time.
The performance of the irradiated and acetalized PVA was considered satisfactory
for the proposed application.

Keywords: hydrogel, polyvynil alcoholl, defects, articular cartilage, biomaterials.

Abstract

xix

Abstract

xx

LISTA DE ABREVIATURAS

ARS

Vermelho de Alizarina-S

ALP

Fosfatase Alcalina

CA

Cartilagem Articular

CEEA

Comisso de tica em Experimentao Animal

CEMIB

Centro Multidisciplinar para Investigao Biolgica

CNT

Controle Negativo de Toxicidade

CPT

Controle Positivo de Toxicidade

DEMA

Departamento de Engenharia de Materiais (DEMA)

DMEM

Meio de Eagle modificado por Dulbeccos

DNA

cido Desoxirribonuclico

EB

Eltron Beam

ECD

Ensaio Citotoxicidade Direta

ECI

Ensaio Citotoxicidade Indireta

EDTA

cido Etilenodiamino Tetra-actico

EDXRF

Espectrometria de Fluorescncia de Raios-X

EMFI

Ensaio Mecnico de Fluncia Indentao

FCM

Faculdade de Cincias Mdicas

xxi

xxii

FDA

Food and Drug Administration (FDA)

FEM

Faculdade de Engenharia Mecnica (FEM)

GAGs

Glicosaminoglicanos

GCs

Grupos Controles

GE00

Grupo Experimental Dia Zero

GEs

Grupos Experimentais

GI

Grau de Inchamento

HA

cido Hialurnico

HC

Hospital de Clnicas (HC)

HE

Hematoxilina e Eosina

IB

Instituto de Biologia

IPEN

Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares

LABIMO

Laboratrio de Biomateriais em Ortopedia

LAP

Laboratrio de Anatomia Patolgica (LAP)

MEC

Matriz Extracelular

MEV

Microscopia Eletrnica de Varredura

MO

Microscopia ptica

MSCs

Clulas-tronco Mesenquimais

MSCs/MO

Clulas-tronco Mesenquimais Derivadas da Medula ssea

xxiii

xxiv

MTT

Sal (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)

NMCE

Ncleo de Medicina e Cirurgia Experimental

AO

Osteoartrose

PBS

Tampo Fosfato Salino

pHEMA

poli Blenda de poli (2-hidroxi etil metacrilato) e poli (metacrilato de

(MMA-co-AA)

metila-co-cido acrlico)

PIn

Peso Inchado

OS

Penicilina com Estreptomicina

PSe

Peso Seco

PVA

Poli-lcool Vinlico

SBF

Soro Fetal Bovino

UNICAMP

Universidade Estadual de Campinas

VN

Vermelho Neutro

xxv

xxvi

LISTA DE TABELAS

Pg.
Tabela 1-

Apresentao das anlises realizadas nos Grupos Controle

(GCs), Cartilagem Articular (CA) e dos Grupos experimentais
(GEs)........................................................................................

Tabela 2-

Critrios

escores

utilizados

na

avaliao

por

estereomicroscpio dos GEs...................................................

Tabela 3-

90

Mdia da frequncia relativa dos critrios atribudos aos

GEs..........................................................................................

Tabela 5-

85

Critrios e escores utilizados na avaliao por MO dos

GEs..........................................................................................

Tabela 4-

81

105

Valores das mdias das concentraes dos componentes

minerais Clcio, Fsforo e Enxofre dos GEs e do material
no implantado (GOO).............................................................

Tabela 6-

Mdia

da

dos

critrios

atribudos

aos

GEs

113

sendo:

1 (+) ausncia do item avaliado; 2 (++) moderada presena e

3 (+++) intensa presena.........................................................

xxvii

119

xxviii

LISTA DE FIGURAS

Pg.
Figura 1-

Esquema da estrutura morfolgica da CA. Junqueira e

Carneiro, 1999 modificada. (1) protena de ligao;
(2)

proteoglicanos;

(3)

molculas

longas

de

cido

hialurnico; (4) cadeias de sulfatos de condroitina do

proteoglicano e (5) fibras colgenas.......................................
Figura 2-

54

Corte histolgico demonstrando a estrutura da cartilagem

articular de co demonstrando as suas zonas. Colorao
HE. Aumento 50X...................................................................

Figura 3-

Imagem da membrana de PVA (a); implante de PVA com

2 mm de dimetro e 1 mm de espessura (b)..........................

Figura 4-

59

74

Procedimento cirrgico: (a) inciso de pele; (b) exposio

cndilo - regio intercondiliana; (c) confeco do defeito
osteocondral; (d) implante PVA com trefina; (e) defeito com
o implante de PVA; (f) sutura..................................................

Figura 5-

83

Ensaio Mecnico de Fluncia a Indentao. (a) mquina

universal de ensaio mecnico com clula de carga de 100N
e amostra fixada a um dispositivo especial durante a
realizao do teste. (b) detalhe do indentador de ponta
esfrica com 1,6 mm de dimetro sobre o cndilo com
implante de PVA.....................................................................

Figura 6-

87

Esquema do cndilo dos GEs com implante de PVA para a

anlise por microscopia ptica. Linha pontilhada seco
sagital cndilo aps descalcificao.......................................
xxix

89

xxx

Figura 7-

Anlise qualitativa da toxicidade do PVA com clulas Vero.

(A) controle negativo; (B) controle positivo; (C) toxicidade
indireta ao PVA (D) toxicidade direta ao PVA.........................

Figura 8-

95

Resultado quantitativo da toxicidade direta e indireta do

PVA com clulas Vero pelo Mtodo MTT. Mdias e desvios
padro: CPT 0,17 (0,26); CNT 0,57 (0,35); PVA (ECI) 0,42
(0,38); PVA (ECD) 0,43 (0,25). Nvel de significncia
0,05.........................................................................................

Figura 9-

96

Resultado quantitativo da toxicidade direta e indireta do

PVA com clulas Vero pelo Mtodo VN. Mdias e desvios
padro: CTP 2,47 (0,67); CNT 3,77 (0,09) e PVA 3,03
(1,16). Nvel de significncia 0,05...........................................

97

Figura 10- Microscopia Eletrnica de Varredura das clulas Vero

cultivadas sobre o PVA por 24horas. Observa-sena
superfcie do PVA: clulas em diviso (cd); agregado celular
(ac); clulas aderidas (ca) e clulas em espalhamento
(es)..........................................................................................

98

Figura 11- Resultado quantitativo da toxicidade indireta do PVA com

clulas MSCs pelo Mtodo MTT. Mdias e desvios padro:
CTP 0,10 (0,07); CNT 0,25 (0,15); PVA 0,35 (0,18). Nvel de
significncia 0,05.....................................................................

99

Figura 12- Microscopia Eletrnica de Varredura da superfcie do PVA

com clulas mesenquimais cultivadas por 24 horas. Clulas
aderidas (*) sobre o PVA e seus prolongamentos (seta).......

100

Figura 13- Quantificao da atividade da enzima ALP sobre MSCs

cultivadas sobre substrato de PVA.........................................

xxxi

101

xxxii

Figura 14- Imagens das MSCs aps 21 dias de diferenciao

osteognica em contato com o PVA. Colorao com
Vermelho de Alizarina S (ARS). Aumento 200x...................... 102
Figura 15- Quantificao da formao de matriz mineralizada avaliada
pela incorporao do corante Vermelho de Alizarina S
(ARS)......................................................................................

103

Figura 16- Imagens capturadas via estereomicroscpio dos cndilos

com implante de PVA dos GEs (a) e suas respectivas
patelas (b). Aumento 10x........................................................ 104
Figura 17- Grfico da mdia dos valores referente ao aspecto da
superfcie do PVA dos GEs avaliados. timo (86%); bom
(13%) ruim (1%)......................................................................

106

Figura 18- Grfico referente mdia dos valores referentes ao aspecto

da superfcie do PVA dos GEs avaliados. timo (72%); bom
(25%); ruim (3%).....................................................................

106

Figura 19- Grfico referente mdia dos valores referentes ao aspecto

da superfcie da patela dos GEs avaliados. timo (86%);
bom (13%); ruim (1%).............................................................

107

Figura 20- Grfico da mdia dos valores referente presena e ou

ausncia de neotecido formado sobre a superfcie do PVA
dos GEs avaliados. timo (82%); bom (17%); ruim (1%)....... 107
Figura 21- Grfico da mdia dos valores referente ao colapso do
implante de PVA dos GEs avaliados. Ausente (97%);
presente (3%).......................................................................... 108
Figura 22- Grfico da mdia dos valores referente presena e ou
ausncia de desgaste do tipo adesivo sobre a superfcie do
PVA dos GEs avaliados. Ausente (96%); presente (4%).......

xxxiii

108

xxxiv

Figura 23- Grfico da mdia dos valores referente presena e ou

ausncia de desgaste do tipo abrasivo sobre a superfcie do
PVA

dos

GEs

avaliados.

Ausente

em

100%

das

amostras.................................................................................

109

Figura 24- Grfico referente mdia dos valores referente ao desgaste

do tipo abrasivo na superfcie da patela dos GEs avaliados.
Ausente (99%); presente (1%)................................................ 109
Figura 25- Grfico da mdia dos valores referente ao desgaste do tipo
adesivo na superfcie da patela dos GEs avaliados. Ausente
(99%); presente (1%)..............................................................

110

Figura 26- Imagens observadas via estereomicroscpio dos cndilos

sem implante de PVA dos GCs e das suas respectivas
patelas (B). Aumento 10x........................................................ 110
Figura 27- Grficos referentes ao Ensaio Mecnico de Fluncia
Indentao dos grupos CA, GE00 e dos GEs........................

111

Figura 28- Grfico do mdulo mdio de Fluncia Indentao em

funo do tempo de seguimento referente aos grupos de
estudo CA, GE00 e GEs.........................................................

112

Figura 29- Grfico referente s concentraes dos componentes

minerais Clcio, Fsforo e Enxofre presentes nas amostras
do grupo GOO (no implantado) e nos GEs........................... 114
Figura 30- Microscopia ptica do GE03. Viso panormica do defeito
osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o
mesmo aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido
(nt) ao redor do implante aumento 200x. Tecido de
granulao (TG) aumento 400x. Colorao HE...................... 115

xxxv

xxxvi

Figura 31- Microscopia ptica do GE06. Viso panormica do defeito

osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o
mesmo aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido
(nt) ao redor do implante aumento 200x. Tecido de
granulao (TG) aumento 400x. Colorao HE...................... 116
Figura 32- Microscopia ptica do GE12. Viso panormica do defeito
osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o
mesmo aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido
(nt) ao redor do implante aumento 200x. Matriz ssea
mineralizada (MO) aumento 400x. Colorao HE..................

117

Figura 33- Microscopia ptica do GE24. Viso panormica do defeito

osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o
mesmo aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido
(nt) ao redor do implante aumento 200x. Tecido sseo
neoformado (TN) aumento 400x. Colorao HE..................... 118
Figura 34- Grfico da mdia referente ao critrio clulas inflamatrias
dos GEs avaliados. Ausente (81%); presena moderada
(19%); presena intensa=0%..................................................

120

Figura 35- Grfico da mdia referente ao critrio tecido de granulao

dos GEs avaliados. Ausente (68%); presena moderada
(32%); presena intensa (0%)................................................. 120
Figura 36- Grfico da mdia referente ao critrio fibras colgenas dos
GEs avaliados. Ausente (9%); presena moderada (69%);
presena intensa (22%)..........................................................

121

Figura 37- Grfico da mdia referente ao critrio matriz ssea

mineralizada dos GEs avaliados. Ausente (9%); presena
moderada (61%) presena intensa (30%)..............................

xxxvii

121

xxxviii

Figura 38- Grfico da mdia referente ao critrio tecido sseo

neoformado dos GEs avaliados. Ausente (37%); presena
moderada (53%) presena intensa (10%)..............................

122

Figura 39- Grfico da mdia referente ao critrio reabsoro ssea do

tecido sseo neoformado dos GEs avaliados. Ausente
(88%);

presena

moderada

(12%)

presena

intensa

(0%).........................................................................................

122

Figura 40- Grfico da mdia referente ao critrio desabamento do

tecido sseo neoformado dos GEs avaliados. Ausente
(100%) do total das amostras.................................................

123

Figura 41- Microscopia ptica dos GCs. Nota-se a formao e

manuteno do tecido fibrocartilaginoso (TFC) preenchendo
completamente o defeito sseo osteocondral em todos os
grupos. Colorao HE. Aumento 400x....................................

124

Figura 42- Microscopia Eletrnica de Varredura da superfcie do PVA

dos GEs. Detalhe menor aumento de 10x. Maior aumento
1000x........................................................................................

125

Figura 43- Detalhe da regio medial da contra-superfcie (patela) dos

GEs.........................................................................................

126

Figura 44- Microscopia Eletrnica de Varredura da superfcie do defeito

vazio dos GCs. Detalhe menor aumento de 10x. Maior
aumento 1000x........................................................................

127

Figura 45- Detalhe da regio medial da contra-superfcie (patela) dos

GCs.........................................................................................

xxxix

128

xl

SUMRIO

Pg.
RESUMO......................................................................................................

xiii

ABSTRACT..................................................................................................

xvii

1- INTRODUO.........................................................................................

51

1.1- Cartilagem articular - composio................................................

53

1.1.1- Matriz Extracelular (MEC).......................................................

55

1.1.2- Colgeno................................................................................

55

1.1.3- gua.......................................................................................

55

1.1.4- Condrcitos.............................................................................

56

1.1.5- Proteoglicanos........................................................................

57

1.1.6- Cartilagem Articular - estrutura...............................................

58

1.1.6.1- Zona superficial tangencial.......................................

59

1.1.6.2- Zona de transio ou mdia.....................................

59

1.1.6.3- Zona profunda ou de cartilagem calcificada............

60

1.1.6.4- Osso subcondral.......................................................

60

1.2- Processo de degenerao e reparao da cartilagem

articular.........................................................................................
1.3- Uso de hidrogis no reparo de defeitos osteocondrais..............

xli

61
63

xlii

2- OBJETIVOS.............................................................................................

67

2.1- Geral.................................................................................................

69

2.2- Especficos......................................................................................

69

3- MATERIAL E MTODOS........................................................................

71

3.1- Material.............................................................................................

73

3.1.1- Preparo dos Implantes do Hidrogel de PVA...........................

73

3.1.2- Teste de inchamento dos implantes de Hidrogel de PVA.....

74

3.2- Ensaios in vitro................................................................................

75

3.2.1- Cultura Celular........................................................................

76

3.2.1.1- Avaliao da Citotoxidade Indireta e Direta do PVA

com Clulas Vero pelo Mtodo MTT........................

76

3.2.1.2- Avaliao da Citotoxidade Indireta do PVA com

Clulas Vero pelo Vermelho Neutro (VN)................

77

3.2.1.3- Investigao da adeso e morfologia celular do

PVA por Microscopia Eletrnica de Varredura
(MEV).......................................................................
3.2.1.4-

Induo

da

Diferenciao

Osteognica

78

das

Clulas-Tronco Mesenquimais (MSCs) sobre o

PVA..........................................................................

79

3.2.1.5- Anlise estatstica.....................................................

80

3.3- Ensaios in vivo................................................................................

80

xliii

xliv

3.4- Mtodo.............................................................................................

81

3.4.1- Procedimento cirrgico...........................................................

81

3.4.2- Sacrifcio dos animais.............................................................

84

3.5- Avaliao da interao do PVA com o tecido receptor..............

84

3.5.1- Anlise Macroscpica por Estereomicroscopia.....................

84

3.5.2- Avaliao do comportamento mecnico do PVA por Ensaio

Mecnico de Fluncia Indentao (EMFI)...........................

85

3.5.3- Anlise dos Minerais nas Amostras de PVA por

Espectrometria de Fluorescncia de Raios-X (EDXRF)........

87

3.5.4- Avaliao por Microscopia ptica (MO).................................

88

3.5.5- Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) das Superfcies

dos cndilos dos GEs e GCs e das Patelas..........................

90

4- RESULTADOS.........................................................................................

93

4.1- Teste de inchamento dos implantes do hidrogel de PVA..........

95

4.2- Resultados anlises in vitro..........................................................

95

4.2.1- Avaliao da Citotoxidade Indireta e Direta do PVA com

Clulas Vero pelo Mtodo MTT.............................................

95

4.2.2- Avaliao da Citotoxidade Indireta do PVA com Clulas

Vero pelo Vermelho Neutro (VN)...........................................

97

4.2.3- Investigao da adeso e morfologia celular do PVA com

clulas Vero por microscopia eletrnica de varredura
(MEV).....................................................................................

xlv

98

xlvi

4.2.4- Avaliao da citotoxidade indireta do PVA com clulas

mesenquimais (MSCs) pelo mtodo MTT.............................

99

4.2.5- Investigao da adeso e morfologia celular do PVA com

MSCs por microscopia eletrnica de varredura (MEV).........

100

4.2.6- Quantificao da atividade da enzima fosfatase alcalina

(ALP)......................................................................................

101

4.2.7- Colorao de vermelho de alizarina S (ARS).........................

102

4.3- Resultados anlises in vivo...........................................................

104

4.3.1- Avaliao da Superfcie do Implante de PVA e da

Cartilagem Articular adjacente via Estereomicroscpio.......

104

4.3.2- Avaliao do comportamento mecnico do PVA por ensaio

mecnico de fluncia indentao (EMFI)............................
4.3.3-

Anlise

dos

minerais

nas

amostras

de

PVA

111

por

espectrometria de fluorescncia de raios-X (EDXRF).........

113

4.3.4- Avaliao por microscopia ptica (MO)..................................

115

4.3.5- Microscopia eletrnica de varredura (MEV) das superfcies

dos cndilos e das patelas.....................................................

125

4.3.5.1- Microscopia eletrnica de varredura (MEV) das

superfcies dos cndilos e patelas dos GEs...........

125

4.3.5.2- Microscopia eletrnica de varredura (MEV) das

superfcies dos cndilos e patelas dos GCs...........

127

5- DISCUSSO............................................................................................

129

5.1- Anlise dos resultados obtidos.....................................................

131

xlvii

xlviii

5.1.1- Teste de inchamento das membranas de hidrogel de

PVA.......................................................................................

132

5.1.2- Ensaios in vitro do PVA..........................................................

133

5.1.3- Avaliao por estereomicroscopia..........................................

135

5.1.4- Avaliao por EMFI................................................................

136

5.1.5- Avaliao EDXRF...................................................................

137

5.1.6- Avaliao por MO...................................................................

137

5.1.7- Avaliao dos cndilos e patelas por MEV............................

138

6- CONCLUSES E SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS........

139

7- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS........................................................

143

xlix

1- INTRODUO

51

52

A cartilagem articular (CA) um tecido altamente complexo,

especializado, levemente elstico, que reveste as superfcies das articulaes dos
ossos longos e curtos.
Apresenta funes como absorver choques, minimizar o atrito e o
desgaste, facilitar o deslizamento, mantendo assim os movimentos articulares
repetitivos e indolores na articulao por vrias dcadas, distribuir a carga
recebida, diminuir o contato entre as superfcies (devido presena do fluido
sinovial), reduzir a tenso mecnica sobre qualquer ponto de contato entre esta e
ossos (13, 19, 30, 75).

1.1- Cartilagem articular - composio

A CA um tecido conjuntivo denso de origem mesodrmica formado
por cartilagem hialina que possui consistncia elstica firme, aneural, alinftico e
avascular que recebe nutrio por meio de difuso por meio dos condrcitos
oriundos do fluido sinovial presente nas cavidades articulares (6, 13, 40, 76, 103).
Suas clulas, os condrcitos dispersos e distribudos em toda extenso
da CA, so constitudos de matriz extracelular (MEC) que por sua vez composta
por proteoglicanos e colgenos em menor quantidade outras protenas e
glicoprotenas. A grande quantidade de proteoglicanos atrai a gua tornando a CA
hidratada.
Conforme Figura 1, observa-se que as protenas de ligao (1) esto
unidas por covalescncia protena central dos proteoglicanos (2) e estes ligados
s molculas longas de cido hialurnico (HA) (3). As cadeias de sulfatos de
condroitina do proteoglicano (4) estabelecem ligaes eletrostticas com as fibras
colgenas (5), contribuindo assim para aumentar a resistncia da matriz (40).
A CA formada por cerca de 40% do seu peso seco por fibras de
colgeno do tipo II que formado por uma tripla hlice de glicoprotenas de at
300nm, sendo que a maioria delas possui tamanho mdio de 67nm e peso
Introduo

53

molecular de 67kDa. A molcula de colgeno e est relacionada principalmente

com sua arquitetura e funo da CA.

Figura 1- Esquema da estrutura morfolgica da CA. (1) protena de ligao;

(2) proteoglicanos; (3) molculas longas de cido hialurnico;
(4) cadeias de sulfatos de condroitina do proteoglicano e (5) fibras
colgenas. Junqueira e Carneiro, 1999 modificada.

A complexa constituio da CA formada por proteoglicanos e colgeno

do tipo II, confere a CA alta elasticidade, propriedades mecnicas de resistncia a
trao e a compresso (13, 40, 76, 103).
As propriedades biomecnicas da CA so conferidas principalmente
pelos principais componentes presentes na MEC: as fibras colgenas do tipo II,
que representam cerca de 95% do peso total do tecido cartilaginoso, alm da
presena de outros em menor quantidade dos tipos V, VI, IX, X e XI os quais esto
associados proteoglicanos hidratadas cerca de 10 a 20% e gua cerca de
60 a 80% alm de 1 % de protenas (enzimas, lipdeos, fatores de crescimento,
etc.) secretadas pelos prprios condrcitos dispersos na matriz.
Introduo

54

Abaixo seguem descritos os principais componentes encontrados na

cartilagem articular.

1.1.1- Matriz Extracelular (MEC)

A MEC possui caracterstica de um gel, composta por cerca de 70% a
80% de gua e 30% da sua parte slida formada principalmente por colgeno e
proteoglicanos (15, 56).

1.1.2- Colgeno
A principal funo das fibras de colgeno dar suporte estrutural para a
matriz da cartilagem que, por sua vez, resiste de forma efetiva s foras de trao
aplicadas sobre esta.
Conforme Figura 1(5), observa-se que a molcula de colgeno do tipo II
possui forma de um pequeno basto rgido, formado pelo entrelaamento em
trplice hlice de trs cadeias polipeptdicas chamadas alfa que so sintetizadas
na forma de um precursor (pr-colgeno tipo II) e so codificadas por genes
diferentes. Estas so unidas por pontes de hidrognio que possibilita o tecido
resista s foras de cisalhamento e servem de suporte para a adeso dos
condrcitos justificada pelas propriedades fsicas, biolgicas e a rigidez e
estabilidade proferida ao colgeno (15,67).

1.1.3- gua
A gua essencial para a manuteno e a sobrevivncia do tecido
avascular da CA, pois permite a difuso de gases, transporta nutrientes e produtos
de degradao entre os condrcitos e o fludo da membrana sinovial.
Ela tambm responsvel pelo desempenho mecnico da mesma. (56,96).
Introduo

55

A gua considerada o componente presente em maior quantidade na

CA, cerca de 65 a 80% do seu peso total. Sua concentrao varia de acordo com
a regio da CA, variando de 80% na regio superficial e cerca de 65% nas regies
mais profundas (48). Nos espaos intracelulares ela est presente em cerca de
30% e est associada com as fibras de colgeno. Encontram-se tambm
dissolvidos na gua os componentes minerais como Sdio, Clcio, Cloro e
Potssio entre outros (56).
A maior quantidade de gua ocupa o espao entre as molculas e
encontra-se livre para se mover quando gradientes de carga e presso so
aplicados sobre esse tecido. Quando o tecido cartilaginoso submetido a uma
determinada carga, 60% desse fludo pode se mover, representando assim um
importante controle no comportamento mecnico da CA e da sua lubrificao
(4,15,62,64).

1.1.4- Condrcitos
Derivados de Clulas Tronco-Mesenquimais (MSCs), apresentam
diferenciao durante o desenvolvimento e formao do esqueleto, aumentando
de volume e ocupam menos de 3 a 10% do volume do volume da poro slida da
CA. A formao e a manuteno da CA dependem da formao dos condrcitos
que, utilizando-se tanto o metabolismo aerbico como o anaerbico e distribudo
em camadas bem estruturadas, so os responsveis pela sntese de Matriz Extra
Celular (MEC) formada principalmente por proteoglicanos e colgeno.
Os

condrcitos

secretam

colgeno

principalmente

do

tipo

II,

proteoglicanos e glicoprotenas, como a condronectina responsvel pela

manuteno da CA, e que possui atividade mittica demonstrada pela sntese de
cido desoxirribonuclico (DNA) nas faixas etrias mais precoces, embora perca
esta capacidade na idade adulta (15,77,93).

Introduo

56

O citoplasma dos condrcitos variam de acordo com a atividade celular.

Nos mais ativos o Retculo Endoplasmtico e Complexo de Golgi so abundantes,
enquanto em clulas inativas, estas organelas esto praticamente ausentes (87).
Por ser a CA avascular e alinftica, o ambiente onde se encontram os
condrcitos possui baixa oxigenao, ento ela degrada a glicose principalmente
pelo mecanismo anaerbio, tendo como produto final o cido ltico. Dessa forma,
os nutrientes trazidos pelo sangue penetram na matriz da cartilagem e vo at os
condrcitos mais profundos.
Os fatores que determinam essa atividade metablica, resultando na
produo da matriz, no esto totalmente esclarecidos, mas provavelmente so
influenciados pelas necessidades biomecnicas locais, por mediadores qumicos e
por fatores de crescimento celular (15,64).

1.1.5- Proteoglicanos
Os proteoglicanos Figura 1 (2) so macromolculas complexas que
consistem

em

(polissacardeos

uma
ou

protena

formada

mucopolissacardeos)

principalmente
conhecidas

por

como

carboidratos
regies

dos

glicosaminoglicanos (GAGs) representadas por um complexo variado de

molculas onde se fixam uma ou vrias cadeias de GAGs (64,88). Estas cadeias
possuem carga negativa e se repetem, atraindo ons solveis que atraem gua e
resultam em resistncia compresso.
A cartilagem pode conter diversas classes de proteoglicanos que
variam de acordo com o tamanho e sua composio, sendo que os que possuem
cadeias longas so chamados de agrecanos que so unidos por ligaes
covalentes a uma protena central com peso molecular que varia de 220 a
250kDa formando grandes agregados entrelaados entre si no covalentes
ligados ao HA. Estes, por sua vez, variam em quantidade e estrutura de acordo
com o local em que se encontram e a idade do indivduo.
Introduo

57

Cerca de 87% dos proteoglicanos so constitudos por sulfato de

condroitina alm de 6% de sulfato de keratina que encontrada apenas na CA,
sendo responsvel pela presso osmtica da CA e desempenha o principal papel
de inchar e hidratar a estrutura de colgeno.
Existem outros tipos de proteoglicanos de cadeias longas menos
caracterizadas que possuem baixo peso molecular (entre 12 e 40kDa), como a
decorina, biglicana e a fibromodulina encontradas em diferentes tipos de tecido
conjuntivo, incluindo a cartilagem e os fragmentos de proteoglicanos que se
acumulam com o passar dos anos e que permanecem unidos ao HA.
H uma reduo progressiva no contedo de gua e protenas com o
aumento de idade do indivduo (21,76) que est relacionada com a diminuio do
contedo do sulfato de condroitina e no aumento do sulfato de queratina que
variam na proporo de 10/1 no nascimento at 2/1 na idade adulta (15,91,94).
Atualmente, aceito que a agregao dos proteoglicanos na rede do
colgeno aumenta a rigidez estrutural da matriz extracelular (64,66).

1.1.6- Cartilagem articular - estrutura

A CA est dividida morfologicamente em quatro zonas distintas
conforme Figura 2, as quais diferem uma da outra conforme a quantidade e
arranjo dos seus componentes, o dimetro das fibras de colgeno, a organizao
dos proteoglicanos e dos demais componentes presentes na MEC.

Introduo

58

Figura 2- Corte histolgico demonstrando a estrutura da cartilagem articular de

co demonstrando as suas zonas. Colorao HE. Aumento 50X.

1.1.6.1- Zona superficial tangencial

Chamada de superfcie de deslizamento, ela constituda por uma
camada delgada com cerca de 10 a 20% da espessura total da CA. Possui fibras
de colgeno tipo II situadas paralelamente superfcie da CA. Nessa poro,
os condrcitos apresentam-se alongados e sintetizam alta concentrao de
colgeno do tipo II, baixa concentrao de proteoglicanos e alta concentrao de
gua.

1.1.6.2- Zona de transio ou mdia

Consiste na zona mais espessa da CA, com cerca de 40 a 60% da
espessura total com alta concentrao de proteoglicanos. Os condrcitos
apresentam formas arredondadas e as fibras colgenas possuem dimetros
maiores esto dispostas aleatoriamente.
Introduo

59

1.1.6.3- Zona profunda ou de cartilagem calcificada

Possui camada com espessura equivalente a 30% da espessura total
da CA. As concentraes de gua so muito baixas e de proteoglicanos bastante
alta. As fibras de colgeno tipo II apresentam dimetros bem maiores e esto
dispostas perpendicularmente superfcie articular. Os condrcitos so esfricos
e em maior quantidade que na zona de transio e formam colunas na mesma
direo das fibras colgenas.
Neste nvel, h uma espessa camada de fibras colgenas que separam
um nvel do outro atribuindo uma estabilidade entre a linha de transio conhecida
como tidemark e a mais profunda de cartilagem calcificada (90).
Na zona que separa a cartilagem calcificada do osso subcondral
(regio de transio entre os dois tecidos), os condrcitos apresentam fentipo
hipertrfico, so pequenos e irregulares e encontram-se embebidos na matriz
calcificada que menos elstica que as zonas anteriores. Desse modo,
as solicitaes mecnicas da cartilagem articular para o osso subcondral ocorre
de forma mais amena.

1.1.6.4- Osso subcondral

A interface entre a cartilagem calcificada fornece uma excelente
integrao estrutural com osso subcondral que est logo abaixo desta. Esta regio
consiste de uma placa de osso localizada diretamente sob a cartilagem articular
calcificada que d sustentao a esta placa ssea.
O osso subcondral composto por trabculas sseas orientadas em
diferentes direes e est extremamente dependente da situao de carga e
apresenta propriedades mecnicas diferentes em diferentes planos.
A capacidade de deformao do osso subcondral contribui para o
absorver cargas transmitidas sobre a articulao e distribu-las proporcionando,
assim, efeito amortecedor (30,33,78).
Introduo

60

1.2- Processo de degenerao e reparao da cartilagem articular

Conforme Hunter, 1743, uma vez destruda, a cartilagem articular
jamais ser reparada, pois o potencial de regenerao limitado devido baixa
atividade mittica dos condrcitos e sua caracterstica avascular.
Leses que acometem a CA podem ocorrer como resultado de uma
destruio mecnica traumtica ou de uma degenerao mecnica progressiva
(uso e desgaste). As leses condrais so muito comuns e podem ser
diagnosticadas entre 63 a 66% das artroscopias de joelho, enquanto aquelas que
atravessam a camada calcificada da cartilagem e expe o osso subcondral
(osteocondrais) so encontradas em 19,6%.
O diagnstico de imagem por ressonncia magntica considerado
padro para avaliao das leses cartilaginosas, uma vez que permite uma
avaliao morfolgica da superfcie, da espessura, do volume e osso subcondral
(80,98).
A degenerao mecnica da CA ocorre com a perda progressiva de sua
estrutura e funes normais que tem incio na maioria das vezes com o seu
amolecimento que evolui para uma fragmentao e, com esta perda contnua o
osso abaixo comea a sofrer danos, perde sua proteo durante as atividades
dirias normais podendo evoluir para uma Osteoartrose (OA) (57,58). Leses por
tores de alto impacto, anatomia anormal da articulao, instabilidade articular,
fora e resistncia muscular inadequada e fatores mdicos ou genticos podem
tambm contribuir para a OA.
Degeneraes

que

resultam

em

OA

causam

dores

severas,

deformidades e baixo movimento das articulaes, surgindo, ento, a necessidade

de intervenes cirrgicas para o tratamento. Esses efeitos degenerativos ocorrem
comumente aps trauma (como fratura articular), leso ligamentar ou meniscal,
leso osteocondral isolada, doenas congnitas e metablicas (9,81).

Introduo

61

Nas leses traumticas, dependendo do tamanho e local da leso,

algumas vezes pode ocorrer cura. No caso de uma leso completa que atinge o
osso subcondral, haver sangramento no local, com a formao de um cogulo
que ir preencher o defeito formado e desencadear a formao do tecido fibroso
que num perodo curto de tempo ir se deteriorar por no possuir as propriedades
mecnicas ao da CA e do osso pr-existente.
Leses que acometem o osso subcondral tm sido tratadas com
microfraturas, artroplastia, debridamento, abraso e enxertos osteocondrais
autlogos. Os enxertos osteocondrais autlogos apresentam como principais
desvantagens a limitada quantidade que pode ser doada, a pouca estabilidade
mecnica do tecido formado alm da morbidade produzida na rea doadora
(5,8,14,16). As condies para a escolha da tcnica cirrgica adequada para
reparos de defeitos osteocondrais deve ser bastante criteriosa, levando-se em
considerao as causas do defeito, idade do paciente, entre outras.
Apesar das vrias tcnicas utilizadas, estas so apenas paliativas,
pois todas apresentam limitaes que vo desde o comprometimento da rea
doadora, incompatibilidade gentica, alto custo, dentre outros e, ao final, o tecido
formado para substituir tais leses apresenta propriedades mecnicas inferiores
CA normal e, cerca de 70% a 80% dos pacientes apresentam alguma melhora e
com o passar do tempo o problema persiste.
Atualmente nenhum tratamento capaz de reparar de maneira
satisfatria e definitiva as leses condrais e osteocondrais e, alm disso,
das tcnicas frequentemente utilizadas, melhores resultados so geralmente
encontrados em pacientes jovens com sintomas descobertos recentemente,
que apresentam menor ndice de massa corporal e com poucas intervenes
cirgicas anteriores.
constante a necessidade do desenvolvimento de mtodos alternativos
para o tratamento das leses osteocondrais. De acordo com a literatura, inmeros
pesquisadores tm desenvolvido estudos em busca de novos mtodos para
potencializar a regenerao tecidual.
Introduo

62

A engenharia tecidual tem sinalizado para a aplicao de clulas-tronco

mesenquimais (MSCs) para se obter uma regenerao tecidual mais eficaz,
podendo ser esta uma excelente alternativa teraputica (36,85,97).
As principais fontes de MSCs so: a medula ssea, o tecido adiposo e o
sangue do cordo umbilical. Estas, quando estimuladas por sinais especficos,
so induzidas a se diferenciar em inmeros tipos celulares com funes
especializadas (29). Estudos tm demonstrado que MSCs derivadas da medula
ssea (MSCs/MO) tm capacidade para se diferenciar em tecido sseo,
cartilaginoso e adiposo (17).
A engenharia tecidual tem focado sua ateno no desenvolvimento de
estudos sobre a utilizao de suportes porosos tridimensionais e materiais
biorreabsorvveis que permitam a adeso e o crescimento das MSCs, bem como
mecanismos de induo da diferenciao das mesmas, porm o sucesso destes
mtodos est sujeito ao melhor entendimento dos mecanismos de interaes
celulares e no seu potencial de diferenciao sobre os diferentes materiais
desenvolvidos (34,52,97).
So vrios e constantes os desafios pesquisados na rea de
biomateriais na tentativa de desenvolver novas metodologias e implantes com
propriedades mecnicas, fsicas e qumicas similares quelas da CA e do osso
subcondral para reparar de modo satisfatrio e definitivo esses defeitos (19,22,
23,24,37,65,83,95,97).

1.3- Uso de hidrogis no reparo de defeitos osteocondrais

A engenharia tecidual tem se utilizado de polmeros reabsorvveis ou
no que podem ser origem natural (protena, celulose, amido, borracha)
ou sintticos obtidos em laboratrio (hidrogel de polietileno, lcool de polivinil,
poliestireno), entre outros, os quais so bastante promissores para reparao de
defeitos da CA e do osso subcondral (12, 18,75,102).

Introduo

63

Vrios so os biomateriais desenvolvidos pela engenharia de materiais

para serem utilizados para reparao de defeitos sseos, onde destacam as
biocermicas como os biovidros, hidroxiapatita, fosfatos de Clcio (39,82);
dos polmeros sintticos biodegradveis a base de poli (afa-hidroxi cidos),
poli (etileno glicol) (PEG) e poli (caprolactona) (PCL) (49,53) os quais so
amplamente incorporados a outros materiais sintticos e utilizados na engenharia
tecidual para reparo de CA e do osso subcondral devido a sua capacidade de
processamento, baixo custo, biodegradabilidade controlada e alm disso j so
aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) (46).
Os hidrogis polimricos so elsticos, macios e estveis por
apresentarem ligaes covalentes fortes e foras coesivas fracas na forma de
ligaes inicas, determinadas pelo monmero hidroflico bsico e pela
concentrao de agentes de reticulao, mas quando secos tornam-se
quebradios (26,68,79).
Para a aplicao especfica como reparo da CA, ele deve ser produzido
de maneira a apresentar um comportamento viscoelstico compressivo,
semelhante ao da mesma, mantendo suas propriedades mecnicas mesmo
quando inchado.
Com o intuito de melhorar suas propriedades mecnicas quando
inchado, os hidrogis polimricos utilizados no estudo como reparadores da CA
so geralmente obtidos por copolimerizao, isto , pelo uso de mais de um
monmero ou at mesmo mudanas no processo de reticulao (26,62).
Os hidrogis polimricos podem ser sintetizados dentro de uma grande
variedade de formas como esponjas, gis no esponjosos, filmes, lquidos que
podem ser polimerizados na forma de gis e como recobrimentos de matrizes
(substratos) sem alterar as propriedades fsicas.
H tambm um grupo de hidrogis reticulados obtidos via radiao
ionizante onde pode controlada a concentrao de stios de reticulao o que
influencia a sua capacidade de absoro de gua (inchamento), fator importante
Introduo

64

para seu comportamento mecnico para uso em articulaes (99). Alm disso,
todo o processo de reticulao e esterilizao realizado em uma nica etapa,
e o produto na sua forma final obtido de modo simples e rpido se comparado
ao convencional o qual apresenta alto grau de impurezas resultantes dos agentes
de reticulao ou de iniciadores qumicos utilizados durante a sntese (7, 25, 43,
45, 91,78, 89).
Os hidrogis a base de lcool de Polivinil (PVA) apresentam boa
biocompatibilidade,

baixo

coeficiente

de

atrito,

boa

absoro

de

gua,

so insolveis na presena de lquido e apresentam tima viscoelasticidade (2,10).

Eles so amplamente utilizados como laringe artificial, suporte para cultura de
tecidos e dispositivos controladores de liberao de drogas, tubos e artefatos que
ficam em contato com sangue, como membranas de dilise, prtese valvares
cardacas testes preliminares como substituto pericrdio e recentemente como
reparador de defeitos osteocondrais (21,31,38,70,71,84,100).
Bavaresco (2004) estudou o processo de obteno de membranas de
PVA reticuladas via radiao ionizante para uso como substitutas da cartilagem
articular. A pesquisa desenvolvida mostrou a importante diminuio dos valores de
coeficiente de atrito () com o aumento da concentrao de gua absorvida pelo
PVA e a dependncia deste comportamento com o aumento da velocidade de
deslizamento, sugerindo a ocorrncia de lubrificao hidrodinmica semelhante
observada nas articulaes naturais.
Caractersticas consideradas biocompatveis quando utilizados em
ensaios in vivo associados praticidade de sntese e manuseio dos hidrogis os
torna interessantes e, alm disso, so elsticos, macios e estveis por
apresentarem ligaes covalentes fortes e foras coesivas fracas na forma de
ligaes inicas, determinadas pelo monmero hidroflico bsico e pela
concentrao de agentes de reticulao (26,68).
Dentre as diversas classes de hidrogis polimricos pesquisados para
aplicaes biomdicas, aqueles base de PVA, obtidos via radiao ionizante
com feixe de eltrons tem merecido destaque devido s suas caractersticas
Introduo

65

fsico-qumicas, alm das vantagens que o mtodo de obteno apresenta

(7,11,44,73).
Hermann e colaboradores (1924), foram os pioneiros na sua obteno,
mas somente aps a II Guerra Mundial pesquisadores estudaram extensivamente
suas propriedades bsicas e aplicaes, principalmente na tecnologia de filmes e
fibras. Sua produo e caracterizao em grande escala se deu mais tarde com
pesquisadores americanos e russos (74) utilizando-se de tcnicas de tratamento
trmico melhoraram as propriedades mecnicas desse biomaterial, confirmando,
assim, sua viabilidade como substituto da cartilagem articular.
Bray e Merryl (1973) foram os primeiros a sugerir o desenvolvimento de
hidrogis de PVA para reconstruo de juntas articulares e a continuidade do
trabalho foi dada por Kobayashi (2001) com tcnicas de tratamento trmico
melhoraram as propriedades mecnicas desse biomaterial, confirmando, assim,
sua viabilidade como substituto da cartilagem articular.
Resultados de testes in vitro realizados com hidrogel de pHEMA/poli
(MMA-co-AA) demonstraram a potencialidade destes materiais para uso no reparo
das articulaes conforme (50,51) e tambm in vivo (54,55). Resultados de testes
in vivo foram confirmados ao utilizar o hidrogel como reparador de defeitos
osteocondrais em ratos quando foi possvel mimetizar o comportamento
mecanoeltro-qumico do mesmo associado ao bom desempenho biolgico
apresentado (54).
O objetivo do presente estudo foi avaliar o comportamento do hidrogel
de PVA acetalizado e irradiado como substituto da cartilagem articular implantados
em joelhos de ratos Wistar.

Introduo

66

2- OBJETIVOS

67

68

2.1- Geral
Avaliar o comportamento do hidrogel de PVA acetalizado e irradiado
como substituto da cartilagem articular implantados em joelhos de ratos Wistar.

2.2- Especficos
avaliar a citotoxicidade dos materiais frente clulas Vero e MSCs/MO;
avaliar o cultivo e diferenciao das MSCs/MO em clulas osteognicas;
avaliar o comportamento do PVA ao longo do tempo como substituto da
cartilagem articular e
avaliar a interao do PVA com o tecido receptor subjacente.

Objetivos

69

Objetivos

70

3- MATERIAL E MTODOS

71

72

3.1- Material
3.1.1- Preparo dos do hidrogel de PVA
O hidrogel de PVA foi sintetizado a partir do polmero comercial lcool
de polivinil, hidrolizado 99+%, cdigo 341584 Aldrich.
Pesou-se 100g do polmero e colocou-o em balo volumtrico contendo
900 ml de gua destilada, e produziu-se uma soluo aquosa na concentrao de
10% (p/p), seguida do aquecimento magntico em banho-maria por 30 minutos
sob temperatura de 70C at a completa homogeneizao. Em seguida, a soluo
foi resfriada e armazenada em refrigerador sob temperatura de 4C.
Para a confeco das membranas conforme Figura 3A, retirou-se a
soluo do refrigerador e, ao atingir a temperatura de 25C, 20ml foram vertidos
em placas de Petri com 10cm de dimetro previamente silanizadas para a
confeco das membranas com 1mm de espessura. Estas eram mantidas sob
temperatura 25C por um perodo de 72h para a total evaporao da gua.
Aps este perodo, as membranas foram submetidas ao processo
qumico de acetalizao (que consiste em aumentar a resistncia mecnica do
PVA), onde foram imersas em um Becker contendo soluo composta por gua
destilada, formaldedo 40% (v/v) (Aldrich), cido sulfrico concentrado 50% (v/v)
(Aldrich) e sulfato de sdio anidro 300g (Aldrich). Nessa soluo e sob
constante agitao e temperatura de 70C foram mantidas por 24 horas
(7, 59,104).
Para remoo dos resduos oriundos do processo de acetalizao,
as membranas foram lavadas em gua corrente destilada por 24 horas, o excesso
de gua foi eliminado com a utilizao de papel filtro e embaladas individualmente
e submetidas ao processo de irradiao por reticulao radioativa.
As membranas foram irradiadas no Instituto de Pesquisas Energticas e
Nucleares (IPEN), utilizando-se radiao ionizante de feixes de eltrons em
ambiente livre de oxignio (eltron beam - EB) emitido por acelerador de eltrons
Dynamitron (E=1,5 MeV) Radiation Dynamis, Inc com dose de 25kGy (7).
Material e Mtodos

73

Aps reticuladas e irradiadas, sob capela de segurana biolgica as

amostras foram mergulhadas em soluo de Cloreto de Sdio (NaCl) 0,9% por 2h
para atingir o grau de inchamento de 43% e foram obtidas amostras com 0,2g
para os testes in vitro (citotoxicidade indireta e direta) e, para o in vivo (implante
nos animais) com um cortador de bipsia (punch) n 2, implantes de 2mm de
dimetro e 1mm de espessura foram cortados (Figura 3B) e colocados em frascos
previamente autoclavados e mantidos em geladeira at o momento do implante.

Figura 3- Imagem da membrana de PVA (a); implante de PVA com 2mm de

dimetro e 1mm de espessura (b).

3.1.2- Teste de inchamento dos implantes de hidrogel de PVA

O controle do grau de inchamento pode ser realizado atravs de
variaes das condies externas como pH, resistncia inica, temperatura,
tipo de agente de reticulao ou do tipo de monmeros e mtodos de sntese.
Alm disso, para certos hidrogis, so desenvolvidas teorias as quais predizem o
grau de inchamento baseado na temperatura e peso molecular entre
reticulaes (3).
Hidrogis de PVA so considerados termorrgidos, onde as ligaes
entre cadeias so primrias, de alta energia e no so passveis de rompimento
pela ao de solventes, tornando-os insolveis. O grau de inchamento do hidrogel
Material e Mtodos

74

termorrgido resultado do nvel de afinidade qumica entre o grau de reticulao,

o fluido e a densidade de ligaes cruzadas ali presentes. Portanto, quanto maior
for a densidade das ligaes cruzadas presentes no hidrogel, menor ser a o grau
de inchamento do mesmo.
Para avaliar o grau de inchamento (GI) foram utilizados seis implantes
de PVA secos que variaram entre 0,09 a 0,14g. As amostras foram colocadas em
soluo de NaCl 0,9% com pH 7 por 24h e, aps este perodo calculado o
GI utilizando-se a relao existente entre o peso seco (PSe) e o peso inchado
(PIn) condio e tempo acima e sob temperatura ambiente mdia de 25C.
A pesagem das amostras foi realizada aps perodo de estabilizao de
48h e os resultados calculados conforme equao abaixo:
GI (%) = (PIn - PSe)

PS x 100 onde:

GI= porcentagem do grau de inchamento de cada amostra;

PIn= peso de cada amostra inchada;
PSe= peso de cada amostra seca.

3.2- Ensaios in vitro

Para a avaliao da citotoxicidade do PVA utilizou-se clulas VERO,
uma linhagem celular do tipo fibroblastos originria de rim de Macaco Verde
Africano (Cercopithecus aethiops), obtidas junto ao Instituto Adolfo Lutz,
So Paulo-SP. As clulas foram cultivadas em meio nutriente celular (HAM F-12)
Nutricell contendo L-glutamina, D-Glicose, NaHCO 3, suplementado com 10% de
soro fetal bovino (SBF) Gibco e mais 1% de penicilina com estreptomicina (PS)
Gibco e mantidas em incubadora de CO 2 (Sanyo Scientific) sob temperatura de
37C. Esta linhagem celular foi adotada neste estudo por ser recomendada para
testes de citotoxicidade e interaes com biomateriais (35,42,86).
Material e Mtodos

75

3.2.1- Cultura celular

3.2.1.1- Avaliao da citotoxidade indireta e direta do PVA com clulas
VERO pelo mtodo MTT
O extrato do PVA foi obtido por meio da incubao na proporo de
0,2g/ml de meio HAM F-12 com 10% SFB por 48 horas sem agitao sob 37C.
Decorrido o tempo acima, o meio foi removido para avaliar o possvel
efeito de substncias liberadas pelo material que pudessem estar presentes no
meio de cultura. O teste de citotoxicidade indireta e obteno dos extratos foram
realizados e testados conforme recomendaes internacionais e testes j
comprovados (36, 60).
Aps obteno do extrato utilizou-se para o cultivo as clulas VERO e
como controle positivo de toxicidade (CPT) utilizou-se soluo de Fenol 0,5% em
meio de cultura e como controle negativo de toxidade (CNT) meio de cultura
(HAM F-12) suplementado com 10% SFB e 1% de penicilina/estreptomicina (PS).
As clulas foram inoculadas a uma concentrao de 3 X 106 clulas/ml
de meio de cultivo celular (HAM F-12) suplementado com 10% SFB em placas de
96 poos. Aps 24 horas, considerado como tempo suficiente para a adeso
celular, o meio de cultura foi substitudo pelo extrato dos materiais e mantidos sob
as mesmas condies de cultura por 24 horas.
A avaliao da toxicidade por contagem direta foi feita pela adio de
sal (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) (MTT) de acordo
com mtodo descrito (60). A anlise estatstica foi realizada utilizando-se o mtodo
One Way Anova, com nvel de significncia de 0,05.

Material e Mtodos

76

3.2.1.2- Avaliao da citotoxidade indireta do PVA com clulas VERO

pelo Vermelho Neutro (VN)
Para a realizao do teste de toxicidade pelo mtodo de incorporao
do Vermelho neutro utilizou-se protocolo estabelecido por Rogero et al (86).
Neste ensaio foi avaliada a viabilidade de clulas VERO frente ao
extrato dos materiais por meio da incorporao do vermelho neutro (VN),
onde uma suspenso celular na concentrao de 3 x 106 clulas/ml foi inoculada
em placa de cultura de 96 poos (n=5) e incubada por 24 horas a 37C. Utilizou-se
como controle a soluo de meio HAM F-12 com 10% de fenol controle positivo de
toxicidade (CPT) e o extrato de poliestireno como controle negativo de toxicidade
(CNT).
Aps 24 horas o meio de cultura presente na placa foi substitudo pelo
extrato dos materiais e a placa foi incubada por um perodo de 24 horas.
Decorrido o perodo de incubao, o extrato foi desprezado e foram adicionados
em cada poo 200l em meio mnimo de Eagle (MEM) contendo 50g de VN por
mililitro (ml).
Aps 3 horas o meio foi removido e os poos foram lavados com 200l
de PBS e outra soluo contendo cloreto de Clcio 1% (CaCl 2 ) em formaldedo
0,5%. Foram adicionados 200l de cido Actico1% (CH 3 COOH) em Etanol 50%.
A placa foi mantida sob agitao por 10 minutos em temperatura ambiente.
Foi feita leitura de absorbncia em leitor de Microplacas BioTek
modelo Power Wave X52 com software adaptado verso Gen 5 109 em
comprimento de onda de 540nm.

Material e Mtodos

77

3.2.1.3- Investigao da adeso e morfologia celular do PVA por

Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
Esta anlise foi utilizada para verificar o crescimento e espalhamento
das clulas aderidas cultivadas sobre o PVA.
Sob uma placa de cultura de 24 poos, foi colocada uma lamnula
circular com 13mm de dimetro e sobre ela o implante de PVA. Realizou-se a
inoculao da suspenso celular na concentrao de 3x106 clulas/ml a qual foi
incubada por 24 h a 37C e, aps o perodo acima, as amostras foram fixadas em
soluo de paraformoldedo Aldrich 2,5%, glutaraldedo Aldrich 2,5% dissolvidos
em soluo tampo de Cacodilato 0,1M com pH de 7,4 por 2 horas em
temperatura ambiente seguida da lavagem com soluo de PBS por trs banhos
de 15 minutos cada um deles.
A ps-fixao foi feita com Tetrxido de smio 1% Sigma e a placa
envolvida em papel alumnio foi mantida em geladeira por 15 minutos, em seguida
realizadas trs lavagens de 15 minutos cada uma delas com gua destilada e a
desidratao por concentraes crescentes de etanol (50%, 70%, 95% e 100%)
de 60 minutos cada uma.
Aps desidratao final as lamnulas e o PVA foram submetidos
metalizao com ouro em sputter modelo CTD-050 Balzers. A observao das
superfcies da lamnula e do PVA foram realizadas em microscpio eletrnico de
varredura modelo JEOL 5800 para aumentos de 500X.
Os ensaios toxicidade foram realizados no Laboratrio de Biomateriais
em Ortopedia (LABIMO) localizado no Ncleo de Medicina e Cirurgia Experimental
(NMCE) da Faculdade de Cincias Mdicas (FCM) da Universidade Estadual de
Campinas (Unicamp).

Material e Mtodos

78

3.2.1.4- Induo da diferenciao osteognica das clulas-tronco

mesenquimais (MSCs) sobre o PVA
Aps o isolamento das clulas mononucleares da medula ssea de
ratos Wistar Kyoto (85), na quarta passagem as MSCs em cultura foram
estimuladas a se diferenciar em osteoblastos conforme protocolo estabelecido
(69).
Para a induo de diferenciao osteognica utilizou-se placas de
cultura de 24 poos contendo clulas numa densidade de 3.000 clulas/cm2.
Dois dias aps a inoculao celular o PVA foi colocado nos poos e o meio de
cultura foi substitudo por meio de induo osteognica constitudo por Meio de
Eagle modificado por Dulbeccos (DMEM) baixa glicose suplementado com de
15% SBF mais 1% de OS, 100nM Dexametasona, 50M Ascorbato-2-fosfato e
10mM de Glicerol-fosfato, o qual era substitudo a cada 3 dias por um perodo de
21 dias (85).
A anlise da diferenciao foi feita por meio da quantificao da
atividade da enzima Fosfatase Alcalina (ALP), impregnao e extrao
colorimtrica do corante vermelho de alizarina (ARS) conforme mtodo descrito
por Gregory et al. (28).
Para a quantificao da atividade da ALP, foi utilizado kit Fast
p-Nitophenyl phosphatase Tablets N189 Sigma, onde 50l do meio de induo
de diferenciao osteognica contido na placa em diferenciao foram transferidos
para placa de 96 poos e mantida em incubadora de CO 2 a 37C por 2 horas e,
aps este perodo, adicionou-se 200l da soluo substrato da ALP e a placa foi
mantida no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente para a realizao da
leitura de absorbncia em leitor de microplacas BioTek modelo Power Wave X52
com software adaptado verso Gen 5 109 para comprimento de onda de 540nm.

Material e Mtodos

79

Para avaliar a impregnao do corante ARS, as clulas foram fixadas

com paraformaldedo a 4% em PBS por 20 minutos e coradas por 10 minutos e as
imagens analisadas em microscpio ptico Leica modelo DMLB para aumentos
de 100 e 200 vezes.
Para quantificar da colorao por ARS, por foram adicionados 280l de
cido actico 10% em cada poo corado com ARS e a placa foi mantida em
agitador por 30 minutos em temperatura ambiente. Aps este perodo o contedo
de cada poo foi transferido para tubos Eppendorf, aquecidos a 85C por
10 minutos seguidos do resfriamento rpido com gelo por 5 minutos.
Os tubos foram centrifugados a 16.000g por 20 minutos e 100l do sobrenadante
foi transferido para um novo tubo com 40l de hidrxido de amnio 10%.
A soluo final (cerca de 140l) foi t ransferida para placa de 96 poos para leitura
de absorbncia em comprimento de onda de 405nm.

3.2.1.5- Anlise estatstica

Para a avaliao da diferena entre as mdias dos valores dos testes
de citoxicidade realizadas nos implantes de PVA, foi utilizado o teste estatstico
One Way Anova com nvel de significncia de p igual a 0,05.

3.3- Ensaios in vivo

Para avaliar a interao do PVA com o tecido receptor, utilizou-se um
total de 80 (oitenta) ratos machos (Rattus novergicus, variedade albina, Rodentia,
Mammalia) da linhagem Wistar com de idade 10(2) semanas e massa corprea
de 380g (20) fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigao Biolgica
(CEMIB) Unicamp, divididos em dez grupos conforme descrito na Tabela 1 de
acordo com os objetivos e anlises propostos.

Material e Mtodos

80

Tabela 1- Apresentao das anlises realizadas nos Grupos Controle (GCs),

Cartilagem Articular (CA) e dos Grupos experimentais (GEs).

3.4- Mtodos
3.4.1- Procedimento cirrgico
Conforme Protocolo n1047-1/2008, aprovado pela Comisso de tica
em Experimentao Animal (CEEA) do Instituto de Biologia (IB) da Unicamp,
os animais foram pesados e anestesiados com Tiopental Sdico Cristlia,
na dose de 25mg/100g de peso do animal, via endovenosa caudal.
Conforme Figura 4, realizou-se a tricotomia dos membros posteriores
(tero distal do fmur e tero proximal da tbia), seguida da assepsia com soluo
alcolica de Iodo 1%. Sobre uma prancha, os animais foram colocados em
decbito ventral com os membros anteriores fixados e os posteriores (direito e
Material e Mtodos

81

esquerdo) livres, expostos e isolados com por campo cirrgico fenestrado estril,
onde por meio de acesso parapatelar lateral, realizou-se uma inciso na pele com
2,5cm no sentido longitudinal (poro distal do fmur e proximal da tbia) dos lados
direito e esquerdo de cada animal. Em seguida, a patela foi luxada medialmente e
com

auxilio

de

esptulas

odontolgicas

modelo

Millenium,

regio

intercondiliana (sulco troclear) de cada um dos cndilos foi exposta.

No centro da regio exposta e, com auxilio de uma broca helicoidal
confeccionada com

um

limitador

e acoplada

a uma furadeira

Bosch

sob velocidade 130rpm, foram realizados os defeitos osteocondrais com 2mm de

dimetro e 1mm de profundidade, ou seja; nas mesmas dimenses do implante de
PVA a ser implantado.
Com auxlio de uma trefina e sob presso o implante de PVA era
introduzido ficando no mesmo nvel da cartilagem articular adjacente. Em seguida,
a cpsula articular e pele eram reposicionadas e suturadas com mononylon
000 Ethycon.
Aps procedimento cirrgico, os animais foram acondicionados em
gaiolas coletivas para cinco animais cada uma e locados no Biotrio para animais
em experimentao NMCE onde nas primeiras 24 horas receberam soluo de
Paracetamol 25mg/kg e rao e aps este perodo, rao e gua foram
oferecidas vontade at o dia do sacrifcio.

Material e Mtodos

82

Figura 4- Procedimento cirrgico: (a) inciso de pele; (b) exposio cndilo regio

intercondiliana;

(c)

confeco

do

defeito

osteocondral;

(d) implante PVA com trefina; (e) defeito com o implante de PVA;
(f) sutura.
Material e Mtodos

83

db

3.4.2- Sacrifcio dos animais

Decorrido cada tempo de seguimento pr-determinado para os GEs e
GCs, os animais foram sacrificados por aprofundamento anestsico pela mesma
via j citada, os joelhos desarticulados e realizou-se a osteotomia do tero mdio
da difise femoral.

3.5- Avaliao da interao do hidrogel de PVA com o tecido

3.5.1- Anlise macroscpica por estereomicroscopia
Imediatamente

aps

sacrifcio,

todas

as

amostras

(n=160)

dos fmures bem como suas respectivas patelas foram imersas e mantidas em
soluo fisiolgica de NaCl a 0,9% e mantidas sob temperatura entre zero e +1C
para evitar a autlise tecidual, at o momento da captura das imagens com luz
incidente para aumento 10x.
Aps anlises via estereomicroscopia, foram fixadas em soluo de
Formaldedo 10% (v/v) tamponado com Fosfato de Sdio Monobsico e Dibsico
com pH igual a 7,0 por 48 horas para a realizao das demais anlises propostas.
Em posse das imagens capturadas por estereomicroscopia, as imagens
foram numeradas e encaminhadas juntamente com uma ficha com os critrios a
serem avaliados e os referidos escores a um grupo composto por trs avaliadores
onde as imagens apresentavam-se sem identificao de qual dos GEs pertencia.
A partir dos resultados dos escores apresentados por cada um dos
avaliadores foi elaborado uma tabela contendo valores numricos simples.
Em seguida os valores foram compilados em uma planilha do tipo exilou e
obteve-se a porcentagem mdia de cada um dos critrios analisados e, finalmente
construiu-se um grfico para cada critrio avaliado.

Material e Mtodos

84

Abaixo segue Tabela 2 referente aos critrios e escores que foram

utilizados na anlise por estereomicroscopia.

Tabela 2- Critrios e escores utilizados na avaliao por estereomicroscpio dos

GEs.
CRITRIOS

ESCORES

Aspecto PVA

ruim(+)

Aspecto CA

bom(++)
timo(+++)

Aspecto Patela

sem crescimento (+)

crescimento <50%

Tecido Neoformado sobre PVA

crescimento >50%
Colapso PVA
Desgaste Abrasivo PVA
Desgaste Adesivo PVA

ausente (%)

Desgaste Abrasivo Patela

presente (%)

Desgaste Adesivo Patela

3.5.2- Avaliao do comportamento mecnico do PVA por Ensaio Mecnico

de Fluncia Indentao (EMFI)
O EMFI costuma ser utilizado para a caracterizao mecnica in situ da
cartilagem

articular

natural,

com

intuito

de

avaliar

seu

comportamento

viscoelstico em funo do tempo (41,101). Para tanto foram utilizadas

seis amostras GE00; seis amostras da CA e seis amostras de cada um dos GEs
(n=24), as quais se encontravam refrigeradas at o momento do ensaio, conforme
descrito no item 3.5.1.

Material e Mtodos

85

Os ensaios foram realizados em uma mquina universal de ensaios

mecnicos EMIC modelo DL300, Figura 5a com uma clula de carga de
capacidade para 100N (10kgf) e, acoplada a esta, um penetrador (indentador) de
ponta esfrica com 1,6 mm de dimetro.
Conforme Figura 5b, o indentador era posicionado perpendicularmente
ao implante de PVA e movimentado para baixo a uma velocidade de 0,1mm/s at
que a fora de compresso atingisse o valor pr-determinado de 0,5kgf. Uma vez
atingida a fora pr-determinada, a carga era mantida por 180 segundos e a
distncia de penetrao do indentador (h), e o tempo (t) eram registrados pelo
software de aquisio de dados TESC verso 3.04. Ao final do ensaio de cada
amostra, obtinha-se o respectivo grfico de penetrao versus tempo.
A partir do valor da penetrao do indentador aps 180 segundos,
calculou-se o mdulo de fluncia indentao (dureza) conforme mtodo descrito
por (101), modificado por (41) conforme equao abaixo:

0 , 42.e 2

4
9.10 . p 1 e a
E=

h
16. r

a=

(2.r.h h ) [cm]
2

Onde: E= mdulo de fluncia [kgf/m2]; p= carga aplicada [kgf]; r= raio do

indentador [cm]; e= espessura da amostra [cm]; h= altura de indentao
(penetrao do indentador) (cm).

Material e Mtodos

86

Figura 5- Ensaio Mecnico de Fluncia a Indentao. (a) mquina universal de

ensaio mecnico com clula de carga de 100N e amostra fixada a um
dispositivo especial durante a realizao do teste. (b) detalhe do
indentador de ponta esfrica com 1,6mm de dimetro sobre o cndilo
com implante de PVA.

3.5.3- Anlise dos minerais nas amostras de PVA por espectrometria de

fluorescncia de raios-X (EDXRF)
Com o objetivo de se quantificar os elementos minerais Clcio (Ca),
Fsforo (P) e Enxofre (S) nas amostras de PVA, retiraram-se aleatoriamente trs
amostras dos defeitos de cada um dos GEs (n=12), mais trs amostras (n=3) de
PVA no implantadas totalizando 15 amostras.
Em espectrofotmetro de fluorescncia de Raios-X por disperso em
energia equipado com um tubo de Rdio e um detector de semicondutor Silcio,
com resoluo de energia de 165 eV (linha Mn Ka) marca Shimadzu,
modelo EDX 700, as amostras do PVA foram depositadas em celas especficas de
polietileno Chemplex e submetidas irradiao por 100 segundos.

Material e Mtodos

87

As condies selecionadas no momento da irradiao foram: 3mm de

colimao do feixe incidente, voltagem aplicada ao tubo de Raios-X de 15 kV por
100 s de irradiao e 25% de tempo morto do detector. Os espectros de RX foram
interpretados utilizando-se o programa AXIL e para as determinaes
quantitativas

dos

caractersticas

dos

componentes
elementos

analisados,
foram

as

usadas

intensidades

para

das

correlaes

linhas

com

as

concentraes (20).

3.5.4- Avaliao por microscopia ptica (MO)

Para a anlise de MO foram selecionadas aleatoriamente 15 amostras
de cada um dos GEs (n=60) e quatro amostras de cada um dos GCs (n=16) que
aps

fixadas,

realizou-se

descalcificao

com

soluo

de

cido

Etilenodiaminotetra Actico Sal Dissdico (EDTA), cido Clordrico (HCl),

Tartarato de Sdio e de Potssio mais gua destilada por 15 dias, conforme
protocolo utilizado pelo Laboratrio de Anatomia Patolgica (LAP) do Hospital de
Clnicas (HC) da Unicamp.
Concludo o processo acima, as amostras foram lavadas em gua
destilada corrente por 60 minutos para retirada do sal de Clcio residual e excesso
do descalcificador e foram mergulhadas em lcool 70%.
Conforme Figura 6, para cada amostra dos GEs e dos GCs, com auxilio
de navalha descartvel e obteve-se uma seco transversal na regio da difise
proximal de cada fmur (a) a qual foi desprezada e foram mantidos apenas os
cndilos direito e esquerdo com tamanho aproximado de 30 mm e, neles realizouse um corte sagital (b) que resultou em duas amostras iguais (c), as quais foram
colocadas em porta amostras identificados para o preparo dos cortes para a
incluso em parafina e confeco dos cortes histolgicos.

Material e Mtodos

88

Figura 6- Esquema do cndilo dos GEs com implante de PVA para a anlise por
microscopia ptica. Linha pontilhada seco sagital cndilo aps
descalcificao.

Utilizando-se

equipamento

automtico

programvel

denominado

tratador de tecidos Shandon modelo Citadel 1000, realizou-se a desidratao

em gradientes de lcool 70%, 80%, 90%, 100% e 100% (v/v) por 60 minutos cada
banho e diafanizao com Xilol (dois banhos) de 60 minutos cada um deles e,
finalmente, as amostras foram embebidas em dois banhos de parafina (60 minutos
cada um), sob temperatura de 65C e realizada a confeco dos blocos.
Foram obtidos cortes histolgicos com 4m de espessura utilizando-se
micrtomo rotatrio automtico Leica modelo RM2155 que foram corados e
contra-corados com Hematoxilina e Eosina (HE) e visualizados por microscpio
ptico Leica modelo DMLB 100S com software de captura das imagens Leica
IM 50 para aumentos de 25x, 200x e 400x respectivamente.
As imagens obtidas foram numeradas e sem identificao de qual GE
pertenciam e foram encaminhadas juntamente com ficha confeccionada com os
critrios e escores para a serem avaliadas por dois avaliadores.
Material e Mtodos

89

Tabela 3- Critrios e escores utilizados na avaliao por MO dos GEs.

Critrios de Avaliao

Escores

clulas inflamatrias (CI)

tecido de granulao (TG)
ausncia
(+)

fibras colgenas (FC)

presena moderada
(++)

matriz ssea (MO)

neotecido sseo (TN)

presena intensa
(+++)

reabsoro ssea (RO)

desabamento neotecido (DN)

3.5.5- Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) das Superfcies dos

cndilos dos GEs e GCs e das Patelas
Procedeu-se anlise por MEV em cinco amostras dos cndilos e suas
patelas de cada um dos GEs (n=20) e tambm quatro amostras de cada um dos
GCs (n=16) selecionadas aleatoriamente e desidratadas parcialmente em
gradientes de lcool 70, 80, 90 e 100% (v/v) por 60 minutos cada banho.
O processo de desidratao total das amostras foi atingido utilizando-se
de equipamento de ponto-crtico Balzers modelo CPD 030, onde as mesmas
foram submetidas ao resfriamento pr-estabelecido de 5C em atmosfera com
CO 2 por 15 minutos seguida de aquecimento mximo de 45C por mais 12
minutos at atingir a presso de 80 bar, onde se alcanava o ponto crtico e a total
desidratao de cada amostra.

Material e Mtodos

90

Em seguida, as amostras foram fixadas com fita condutora em porta

amostras e metalizadas com Ouro por meio do equipamento Sputter Coater
modelo Bal-Tec SCD.
A anlise das amostras dos cndilos e das patelas dos GEs e GCs foi
realizada em equipamento JEOL JXA modelo 860 para aumentos de 100 at
1000x. As anlises foram realizadas no Laboratrio de Microscopia Eletrnica do
DEMA da Faculdade de Engenharia Mecnica (FEM) da Unicamp.

Material e Mtodos

91

Material e Mtodos

92

4- RESULTADOS

93

94

4.1- Teste de inchamento dos implantes do hidrogel de PVA

Os resultados obtidos do teste de inchamento do PVA na concentrao
utilizada de 10% e aps reticulao na dose de 25KGy apresentaram grau de
entumescimento de 43% (2) aps 24 horas em soluo de NaCl 0,9% sob
temperatura ambiente de 23C (2) com a manuteno do mdulo de fluncia
conforme descrito por Bavaresco (2004) (7).

4.2- Resultados anlises in vitro

4.2.1- Avaliao da citotoxidadei e direta do PVA comc Vero pelo Mtodo
MTT
A Figura 7 apresenta os resultados qualitativos da toxicidade direta e
indireta do hidrogel de PVA com clulas Vero, em contraste de fase aps 24 horas
de cultivo.

Figura 7- Anlise qualitativa da toxicidade do PVA com clulas Vero. (A) controle
negativo; (B) controle positivo; (C) toxicidade indireta ao PVA
(D) toxicidade direta ao PVA.
Resultados

95

O grfico da Figura 8 apresenta os resultados quantitativos da

toxicidade direta e indireta do hidrogel de PVA com clulas Vero pelo mtodo do
MTT.

Figura 8- Resultado quantitativo da toxicidade direta e indireta do PVA com

clulas Vero pelo Mtodo MTT. Mdias e desvios padro: CPT 0,17
(0,26); CNT 0,57 (0,35); PVA (ECI) 0,42 (0,38); PVA (ECD)
0,43 (0,25). Nvel de significncia 0,05.

Resultados

96

4.2.2- Avaliao da Citotoxidade Indireta do PVA com Clulas Vero pelo

Vermelho Neutro (VN)
A Figura 9 refere-se ao resultado do teste de toxicidade direta do PVA
com clulas Vero avaliada pelo mtodo do VN.

Figura 9- Resultado quantitativo da toxicidade direta e indireta do PVA com

clulas Vero pelo Mtodo VN. Mdias e desvios padro: CTP 2,47
(0,67); CNT 3,77 (0,09) e PVA 3,03 (1,16). Nvel de significncia 0,05.

De maneira geral, os resultados obtidos pelos testes de toxicidade

realizados utilizando-se de clulas Vero pelos mtodos MTT e VN mostraram que
o PVA foi considerado atxico.

Resultados

97

4.2.3- Investigao da adeso e morfologia celular do PVA com clulas Vero

por Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
A Figura 10 apresenta os resultados e o padro morfolgico de
crescimento das clulas Vero sobre o PVA. Pode-se observar a intensa presena
de clulas aderidas e espalhadas sobre o PVA com morfologia irregular,
ora alongada ora mais retradas e, na maioria das vezes achatadas. Em algumas
delas observa-se vesculas e/ou micro vilosidades na superfcie e sinais de diviso
celular sobre as amostras. Em algumas situaes observamos tambm clulas
interligadas por finos prolongamentos.

ca

Figura 10- Microscopia Eletrnica de Varredura das clulas Vero cultivadas sobre
o PVA por 24 horas. Observa-sena superfcie do PVA: clulas em
diviso (cd); agregado celular (ac); clulas aderidas(ca) e clulas em
espalhamento(es).

Nas imagens obtidas por meio da MEV foi possvel observar que o
padro morfolgico de crescimento das clulas Vero sobre o PVA foi mantido.
De maneira geral, os resultados obtidos pelos testes de toxicidade
realizados utilizando-se de clulas Vero mostraram que o PVA foi considerado
atxico para os testes ECI e ECD, indicando-o para a realizao de testes
preliminares in vivo.
Resultados

98

4.2.4- Avaliao da Citotoxidade Indireta do PVA com Clulas Mesenquimais

(MSCs) pelo Mtodo MTT
A Figura 11 apresenta os resultados do teste de toxicidade indireta com
MSCs pelo mtodo MTT.

Figura 11- Resultado quantitativo da toxicidade indireta do PVA com clulas

MSCs pelo Mtodo MTT. Mdias e desvios padro: CTP 0,10 (0,07);
CNT 0,25 (0,15); PVA 0,35 (0,18). Nvel de significncia 0,05.

O teste quantitativo de toxicidade indireta do PVA frente s MSCs

apontou que o PVA foi caracterizado como atxico.

Resultados

99

4.2.5- Investigao da adeso e morfologia celular do PVA com MSCs por

Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)
A Figura 12 apresenta as imagens de MEV do PVA onde possvel
observar as clulas aderidas e espalhamento das MSCs sobre o mesmo e
tambm

presena

clulas

com

morfologia

irregular,

sendo

que

ora

apresentavam-se alongadas, ora mais retradas e na maioria das vezes achatadas

sobre as superfcies e, em algumas delas, observou-se vesculas e/ou
microvilosidades na superfcie e sinais de diviso celular sobre as amostras.

Figura 12- Microscopia Eletrnica de Varredura da superfcie do PVA com clulas

mesenquimais cultivadas por 24 horas. Clulas aderidas (*) sobre o
PVA e seus prolongamentos (seta).

Observou-se menor quantidade de clulas sobre o PVA na presena

das MSCs quando comparadas com as clulas Vero da Figura 10. O aspecto
caracterstico das MSCs foi mantido com clulas bipolares estreladas e alongadas
com prolongamentos partindo de vrios pontos da clula.

Resultados

100

4.2.6- Quantificao da Atividade da Enzima Fosfatase Alcalina (ALP)

A

Figura

13

apresenta

os

resultados

referente

anlise

semi-quantitativa relativa produo da mesma frente s clulas MSCs.

Figura 13- Quantificao da atividade da enzima ALP sobre MSCs cultivadas

sobre substrato de PVA.

Resultados

101

4.2.7- Colorao de Vermelho de Alizarina S (ARS)

A Figura 14 apresenta os dados qualitativos para as clulas que
cresceram sobre o PVA. Observa-se formao de ndulos de mineralizao com
incorporao do corante ARS nas MSCs aps 21 dias de diferenciao
osteognica, o que indica formao de matriz ssea mineralizada.

Figura 14- Imagens das MSCs aps 21 dias de diferenciao osteognica em

contato com o PVA. Colorao com Vermelho de Alizarina S (ARS).
Aumento 200x.

Resultados

102

A Figura 15 representa os dados semi-quantitativos para as clulas que

cresceram sobre o PVA de acordo com a extrao colorimtrica do corante
Vermelho de Alizarina.

Figura 15- Quantificao da formao de matriz mineralizada avaliada pela

incorporao do corante Vermelho de Alizarina S (ARS).

Resultados

103

4.3- Resultados anlises in vivo

4.3.1- Avaliao da superfcie do implante de PVA e da cartilagem articular
adjacente via estereomicroscpio
As imagens da Figura 16 correspondem s amostras dos cndilos e
suas respectivas patelas dos grupos dos GEs. As amostras foram fotografadas por
estereomicroscpio Leica modelo MZ 7.5 com luz incidente para aumentos de
10x respectivamente.

Figura 16- Imagens capturadas via estereomicroscpio dos cndilos com implante
de PVA dos GEs (a) e suas respectivas patelas (b). Aumento 10x.

Resultados

104

A Tabela 4 apresenta os resultados dos GEs referente a freqncia

mdia relativa dos critrios atribudos analisados por estereomicroscopia.

Tabela 4 - Mdia da frequncia relativa dos critrios atribudos aos GEs

Mdia da Frequncia Relativa dos GEs
Critrios
Avaliados

timo%

Bom%

Ruim%

GE03

GE06

GE12

GE24

GE03

GE06

GE12

GE24

GE03

GE06

GE12

GE24

83

71

93

98

17

25

60

69

70

89

38

27

26

83

71

93

98

17

25

PVA
superfcie
CA
adjacente
Patela
superfcie

sem crescimento

crescimento < 50%

crescimento > 50%

GE03

GE06

GE12

GE24

GE03

GE06

GE12

GE24

GE03

GE06

GE12

GE24

85

94

78

70

13

22

26

Formao
Neotecido

Presente%

Ausente%

GE03

GE06

GE12

GE24

GE03

GE06

GE12

GE24

14

100

100

100

86

11

100

96

88

100

95

100

100

100

95

100

100

100

Colapso
PVA
Desgaste
Abrasivo
PVA
Desgaste
Adesivo
PVA
Desgaste
Adesivo
Patela
Desgaste
Abrasivo
Patela

Resultados

105

Abaixo seguem os grficos gerados de acordo com os critrios e

escores avaliados na Tabela 2 referente aos GEs.

Figura 17- Grfico da mdia dos valores referente ao aspecto da superfcie do

PVA dos GEs avaliados. timo (86%); bom (13%) ruim (1%).

Figura 18- Grfico referente mdia dos valores referentes ao aspecto da

superfcie do PVA dos GEs avaliados. timo (72%); bom (25%);
ruim (3%).
Resultados

106

Figura 19- Grfico referente mdia dos valores referentes ao aspecto da

superfcie da patela dos GEs avaliados. timo (86%); bom (13%);
ruim (1%).

Figura 20- Grfico da mdia dos valores referente presena e ou ausncia de

neotecido formado sobre a superfcie do PVA dos GEs avaliados.
timo (82%); bom (17%); ruim (1%).

Resultados

107

Figura 21- Grfico da mdia dos valores referente ao colapso do implante de PVA
dos GEs avaliados. Ausente (97%); presente (3%).

Figura 22- Grfico da mdia dos valores referente presena e ou ausncia de

desgaste do tipo adesivo sobre a superfcie do PVA dos GEs
avaliados. Ausente (96%); presente (4%).

Resultados

108

Figura 23- Grfico da mdia dos valores referente presena e ou ausncia de

desgaste do tipo abrasivo sobre a superfcie do PVA dos GEs
avaliados. Ausente em 100% das amostras.

Figura 24- Grfico referente mdia dos valores referente ao desgaste do tipo
abrasivo na superfcie da patela dos GEs avaliados. Ausente (99%);
presente (1%).

Resultados

109

Figura 25- Grfico da mdia dos valores referente ao desgaste do tipo adesivo na
superfcie da patela dos GEs avaliados. Ausente (99%); presente (1%).

A Figura 26 apresenta o resultado dos cndilos dos GCs (a) e suas

respectivas patelas (b).

Figura 26- Imagens observadas via estereomicroscpio dos cndilos sem

implante de PVA dos GCs e das suas respectivas patelas (B).
Aumento 10x.
Resultados

110

4.3.2- Avaliao do comportamento mecnico do PVA por Ensaio Mecnico

de Fluncia Indentao (EMFI)
Os grficos da Figura 27 referem-se aos resultados obtidos no EMFI
referente ao CA, GE00 e GEs.

Figura 27- Grficos referentes ao ensaio mecnico de fluncia iIndentao

dos grupos CA, GE00 e dos GEs.
Resultados

111

Abaixo segue grfico com os valores mdios dos mdulos de fluncia

indentao referentes aos grupos de estudo.

Figura 28- Grfico do mdulo mdio de fluncia indentao em funo do tempo

de seguimento referente aos grupos de estudo CA, GE00 e GEs.

Resultados

112

4.3.3- Anlise dos minerais nas amostras de PVA por espectrometria de

fluorescncia de Raios-X (EDXRF)
A Tabela 5 apresenta os valores mdios e o desvio padro referente a
absoro dos componentes CA, P e S presentes nas amostras de PVA dos GEs e
do grupo controle GOO.

Tabela 5- Valores das mdias das concentraes dos componentes minerais

Clcio, Fsforo e Enxofre dos GEs e do material no implantado
(GOO).
Tabela Absoro Minerais: mdia e desvio padro ( )
Seguimento

Clcio

Fsforo

Enxofre

GOO

0,016 (0,001)

0,028 (0,002)

0,043 (0,013)

GE03

0,057 (0,060)

0,053 (0,034)

0,051 (0,004)

GE06

0,049 (0,033)

0,044 (0,015)

0,059 (0,014)

GE12

0,061 (0,043)

0,054 (0,031)

0,045 (0,011)

GE24

0,236 (0,225)

0,104 (0, 090)

0,048 (0,005)

Resultados

113

O grfico da Figura 29 apresenta os valores mdios das concentraes

de Clcio, Fsforo e Enxofre presentes no implante de PVA e no GOO.

Figura 29- Grfico referente s concentraes dos componentes minerais Clcio,

Fsforo e Enxofre presentes
(no implantado) e nos GEs.

Resultados

114

nas

amostras

do grupo

GOO

4.3.4- Avaliao por Microscopia ptica (MO)

As Figuras 30, 31, 32 e 33 apresentam os resultados da anlise
histolgica por microscopia ptica dos GEs estudados.

Figura 30- Microscopia ptica do GE03. Viso panormica do defeito

osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o mesmo
aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido (nt) ao redor do
implante aumento 200x. Tecido de granulao (TG). Aumento 400x.
Colorao HE.

Resultados

115

os

nt

at

FC

Figura 31- Microscopia ptica do GE06. Viso panormica do defeito

osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o mesmo
aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido (nt) ao redor do
implante aumento 200x. Tecido de granulao (TG). Aumento 400x.
Colorao HE.

Resultados

116

at

nt

MO

Figura 32- Microscopia ptica do GE12. Viso panormica do defeito

osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o mesmo
aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido (nt) ao redor do
implante

aumento

200x.

Matriz

Aumento 400x. Colorao HE.

Resultados

117

ssea

mineralizada

(MO).

at
nt
os

TN

Figura 33- Microscopia ptica do GE24. Viso panormica do defeito

osteocondral com PVA ausncia de neotecido (at) sobre o mesmo
aumento 25x. Detalhe da formao de neotecido (nt) ao redor do
implante

aumento

200x.

Tecido

Aumento 400x. Colorao HE.

Resultados

118

sseo

neoformado

(TN).

A Tabela 6 apresenta os resultados dos escores referente aos critrios

dos GEs.

Tabela 6- Mdia da dos critrios atribudos aos GEs sendo: um(+) ausncia do
item avaliado; 2(++) moderada presena e 3(+++) intensa presena.
Mdia Critrios e Escores Atribudos aos GEs
Critrios Avaliao

Clulas inflamatrias (CI)

Tecido de granulao (TG)

Fibras colgenas (FC)

Matriz ssea (MO)

Neotecido sseo (TN)

Reabsoro ssea (RO)

Desabamento neotecido (DN)

GE03

GE06

GE12

GE24

Escores*

100

83

55

88

(+)

17

45

12

(++)

(+++)

83

83

73

100

(+)

17

17

27

(++)

(+++)

83

91

38

(+)

50

17

50

(++)

50

12

(+++)

17

17

(+)

83

83

27

50

(++)

73

50

(+++)

17

25

63

(+)

83

50

45

25

(++)

25

55

13

(+++)

100

83

83

88

(+)

17

17

12

(++)

(+++)

100

100

100

100

(+)

(++)

(+++)

Resultados

119

Abaixo segue sequncia dos grficos com as mdias relativas de

acordo com os critrios e escores (Tabela 6) e dos GEs.

Figura 34- Grfico da mdia referente ao critrio clulas inflamatrias dos GEs
avaliados. Ausente (81%); presena moderada(19%); presena
intensa = 0%.

Figura 35- Grfico da mdia referente ao critrio tecido de granulao dos GEs
avaliados. Ausente (68%); presena moderada (32%); presena
intensa (0%).

Resultados

120

Figura 36- Grfico da mdia referente ao critrio fibras colgenas dos GEs
avaliados. Ausente (9%); presena moderada (69%); presena
intensa (22%).

Figura 37- Grfico da mdia referente ao critrio matriz ssea mineralizada dos
GEs avaliados. Ausente (9%); presena moderada (61%) presena
intensa (30%).

Resultados

121

Figura 38- Grfico da mdia referente ao critrio tecido sseo neoformado dos
GEs avaliados. Ausente (37%); presena moderada (53%) presena
intensa (10%).

Figura 39- Grfico da mdia referente ao critrio reabsoro ssea do tecido

sseo neoformado dos GEs avaliados. Ausente (88%); presena
moderada (12%) presena intensa (0%).

Resultados

122

Figura 40- Grfico da mdia referente ao critrio desabamento do tecido sseo

neoformado dos GEs avaliados. Ausente (100%) do total das
amostras.

Resultados

123

A Figura 41 apresenta os resultados da anlise histolgica por

microscopia ptica dos GCs estudados.

TFC

TC

GC03

GC06

TFC

TFC

GC12

GC24

Figura 41- Microscopia ptica dos GCs. Nota-se a formao e manuteno do

tecido fibrocartilaginoso (TFC) preenchendo completamente o defeito
sseo

osteocondral

em

todos

Aumento 400x.

Resultados

124

os

grupos.

Colorao

HE.

4.3.5- Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) das Superfcies dos

cndilos e das Patelas
Para a realizao da MEV, os cndilos dos GEs e GCs foram
desidratados em equipamento de ponto crtico sob temperaturas que variavam de
5 a 45C e presso de zero a 80 bar em atmosfera contendo CO 2, portanto em
todos os GEs observa-se dimenso original reduzida.

4.3.5.1- MEV das Superfcies dos Cndilos e das Patelas dos GEs

Figura 42- Microscopia Eletrnica de Varredura da superfcie do PVA dos GEs.

Detalhe menor aumento de 10x. Maior aumento 1000x.

Resultados

125

GE03

GE06

GE12

GE24

Figura 43- Detalhe da regio medial da contra-superfcie (patela) dos GEs.

Resultados

126

4.3.5.2- MEV Superfcies dos Cndilos e Patelas dos GCs

GC03

GC06

GC24

GC12

Figura 44- Microscopia Eletrnica de Varredura da superfcie do defeito vazio dos

GCs. Detalhe menor aumento de 10x. Maior aumento 1000x.

Resultados

127

GC03

GC06

GC24

GC12

Figura 45- Detalhe da regio medial da contra-superfcie (patela) dos GCs.

Resultados

128

5- DISCUSSO

129

130

5.1- Anlise dos resultados obtidos

Todos os procedimentos utilizados em todas as etapas do presente
estudo foram realizados de maneira adequada e seguiram os padres cirrgicos
essenciais.
O comportamento viscoelstico da cartilagem articular no depende
apenas

das

propriedades

mecnicas

intrnsecas

da

matriz

extracelular,

mas, tambm, da resistncia ao escoamento da gua intersticial atravs desta

quando o tecido deformado.
importante ressaltar que, in vitro, a cartilagem articular se comporta
mecanicamente de modo diferente se comparada com seu comportamento in vivo,
ou seja, in vitro ela no recupera o equilbrio e sua dimenso originais aps a
retirada da carga de compresso, porque essa recuperao in vivo resultado de
uma srie de fatores como a concentrao e tipos de ons dissolvidos na gua
intersticial, sua viscosidade, temperatura e contedo macromolecular que
governam a elasticidade e a capacidade de absoro de gua de sua estrutura
(48, 63, 64).
Dentre vrios pesquisadores LIPSHITZ, (2005) e MOW, (1989),
comprovaram que a maior porcentagem de carga aplicada suportada pelo
lquido sinovial responsvel pela lubrificao natural da junta articular e, depois,
pela matriz extracelular.
Observou-se neste trabalho que, independentemente dos tempos de
seguimento estudados, o hidrogel de PVA manteve-se ntegro com ausncia de
clulas gigantes, no foi observado processo inflamatrio que poderia ter sido
causado pela presena do biomaterial.
O mtodo de reticulao via radiao promove a formao de
estruturas fortes, porm complacentes com a formao de stios capazes de
absorver e reter o lquido sinovial para todos os GEs estudados, o que se acredita
ter favorecido o bom desempenho mecnico observado.
Discusso

131

Graindorge et al. (2000), avaliaram as alteraes na morfologia

superficial da cartilagem articular quando ocorrem processos de desgaste a fim de
entender a sua degenerao em casos de osteoartrite, e concluram que o
processo de desgaste articular sem a presena do lquido sinovial pode ocorrer j
nos primeiros intervalos de tempo justamente pela ausncia de regime de
lubrificao, tornando-se catastrfico ao longo do tempo devido ao aumento da
rea de contato entre as cartilagens.
Observou-se ausncia de processos de desgaste em todos os GEs,
o que nos levou a concluir que a estrutura reticulada do PVA tenha garantido a
presena de liquido sinovial promovendo a manuteno do processo de
lubrificao, o que impede o contato entre as superfcies e, conseqentemente,
o desgaste.
Por meio do ensaio de fluncia a indentao a carga submetida esta
suportada e distribuda pela matriz slida sendo possvel determinar o
comportamento de deformao da matriz da cartilagem (4,32,47,61,62,63).
Da mesma maneira que na cartilagem articular, quando aplicada uma
carga de compresso sobre um polmero, esta se distribui, neste caso,
entre as macromolculas emaranhadas, provocando o deslizamento entre as
mesmas. A facilidade com que se d esse deslizamento intercadeias
influenciada pela estrutura polimrica ou, ainda, pela fora de ligao entre as
macromolculas.

5.1.1- Teste de inchamento do PVA

Conforme Bavaresco (2004), amostras de PVA no reticuladas, ou seja,
com dose de zero KGy, apresentam-se solveis em gua e, conforme resultados
obtidos, em doses que variaram de 0 a 150 KGy, o mdulo de fluncia a
indentao (dureza) (E (MPa) e grau de equilbrio de intumescimento ou da
capacidade de absoro de gua (Equilibrium Water Content - EWC (%) foram
Discusso

132

obtidos na dose de 25KGy, com mdulo de fluncia de 3,0 (0,4) MPa com grau
de intumescimento de 45 (0,5) demonstrando assim a importncia da reticulao
para a melhora do comportamento mecnico do PVA.
Solues aquosas de PVA reticuladas via radiao ionizante sem que
haja nenhum tipo de tratamento qumico prvio, obtm-se um hidrogel menos
resistente mecanicamente que aqueles reticulados via processo qumico.
Isso ocorre porque devido liberao de gs hidrognio durante o
processo, obtm-se uma estrutura macromolecular porosa o que diminui sua
resistncia mecnica a compresso e trao. A etapa de acetalizao altera
significativamente as propriedades mecnicas do PVA quando comparado ao
processo de reticulao sem este tratamento qumico. As amostras obtidas aps a
acetalizao apresentaram um timo aspecto sem presena de bolhas.
O aumento da resistncia mecnica do hidrogel de PVA pode ser
atribudo a reticulao intermolecular formada pelas ligaes C-O-C geradas na
formao de diteres (acetais) por meio da reao de aldedos com alcois sob
condio de catlise, durante o processo de acetalizao.
As cadeias reticuladas formadas durante o processo de acetalizao,
quando submetidas posterior reticulao por irradiao ionizante so conectadas
umas com as outras por meio de ligaes fortes do tipo covalentes.
Estes tratamentos alm de aumentar a resistncia mecnica impedem que ocorra
o processo denominado radilise, evitando a formao de bolhas no produto
final (7).

5.1.2- Ensaios in vitro do PVA

Os testes de viabilidade celular pelos mtodos do MTT, VN e o teste de
adeso por MEV, indicaram que no houve interferncia do PVA na viabilidade,
adeso e morfologia indicando atividade celular adequada. Tais resultados foram
confirmados conforme j descrito por Rodrigues et al. (2012) e Chen (2009).
Discusso

133

Os resultados obtidos relativos ao ensaio de ECI e ECD ao PVA

utilizando-se clulas Vero avaliada pelos mtodos de microscopia de luz e do
MTT, no foram observados sinais qualitativos de toxicidade quando comparados
com o CPT. Mesmos resultados foram obtidos no teste do mtodo VN,
Figura 9.
Na anlise por MEV, pode-se observar clulas aderidas, espalhadas e
em sua maioria com morfologia irregular (ora mais retradas) e, na maioria das
vezes achatadas. De maneira geral, foi possvel observar que o padro
morfolgico e de crescimento das clulas Vero sobre o PVA foram mantidos
conforme Figura 10.
Resultados semelhantes aos obtidos do PVA na presena das clulas
Vero foram encontrados na presena das MSCs avaliadas pelo mtodo MTT,
Figura 11, de modo que o PVA tambm foi considerado atxico quando
comparado com o CPT.
A cintica de adeso e proliferao observadas nas clulas em
condies de manuteno e rotina foi mais lenta quando comparadas com as
clulas Vero utilizadas nesse estudo. Os achados so condizentes com os
descritos pela literatura (50).
Nas imagens por MEV, Figura 12, o aspecto das clulas MSCs sobre o
PVA foi mantido. As mesmas encontravam-se espalhadas, aderidas e com
morfologia irregular (alongadas ou retradas) e, na maioria das vezes, achatadas
com a presena de vesculas e/ou microvilosidades na superfcie e sinais de
diviso celular.
A anlise da diferenciao osteognica pela ao da enzima ALP e pelo
corante ARS mostraram ausncia da interferncia na diferenciao de MSCs/MO
de ratos (Chen 2009), confirmando assim sua diferenciao osteognica,
Figuras 13 e 14.

Discusso

134

Por estar envolvida diretamente no processo de mineralizao da matriz

orgnica pelas clulas sseas, a enzima ALP comumente utilizada como
marcador da diferenciao ssea. Conforme Figura 13, os resultados indicaram
que o PVA no interferiu na capacidade das MSCs produzirem ALP.
A Figura 14 apresenta imagens das MSCs marcadas com ARS aps
21 dias de diferenciao osteognica sobre o PVA. Foi possvel observar (setas)
os ndulos de mineralizao pela incorporao do corante, mostrando que houve
formao de matriz ssea mineralizada. A Figura 15 apresenta os resultados
quantitativos obtidos, confirmando que o PVA no interferiu no processo de
diferenciao das MSCs aps 21 dias diferenciao osteognica.

5.1.3 - Avaliao por Estereomicroscopia

De acordo com Graindorge (2000), a ausncia de lquido sinovial
acelera rapidamente o processo de desgaste da CA.
Observou-se que a mdia da frequncia relativa dos GEs avaliados por
especialistas, Tabela 4, que o aspecto da superfcie do PVA, da cartilagem
adjacente e da contra-superfcie (patela) em todos os GEs foram mantidos.
Foram observadas na maioria das amostras ausncias de: colapso do implante,
crescimento de neotecido sobre o mesmo, desgastes do tipo abrasivo e ou
adesivo nas amostras avaliadas, Figura 16.
A manuteno das superfcies adjacentes (PVA e patela) foi observada
em todos os GEs, indicativo de que o fluido sinovial esteve presente em todos
eles.
De acordo com os resultados obtidos por microscopia estereoscpica
conforme Figuras de 17 a 25 foram considerados satisfatrios para todos os
tempos de seguimento estudados.

Discusso

135

Na Figura 26 dos GCs, observa-se que todos os defeitos foram

totalmente preenchidos por tecido fibrocartilaginoso. Presena de indcios de
desgastes do mesmo, das contra-superfcies (patelas) e da cartilagem articular
adjacente foram observados. Tais indcios podem ser justificados pela ausncia de
lubrificao suficiente e ou irregularidade do neotecido formado.

5.1.4 - Avaliao por EMFI

Aumento no mdulo de fluncia ao longo do tempo pode ser justificado
pelo adensamento do tecido sseo no fundo do defeito Kempson (1971),
Malmonge et al. (1997).
A Figura 27 refere-se aos grficos individuais de cada um dos GEs.
Os resultados mostraram que os valores obtidos foram da mesma ordem de
grandeza da cartilagem articular natural.
A Figura 28 apresenta resultados dos grupos CA, GE00 e GEs,
onde se observa maior mdulo de fluncia foi obtido na CA com significativa
resistncia mecnica do comportamento visco elstico quando comparada com os
demais grupos estudados.
Os valores de penetrao do indentador foram maiores nos GEs.
Tal resultado pode ser justificado pela deformao da rede polimrica do PVA
quando foi submetido fora de compresso.
Foi

observada

menor

resistncia

mecnica

no

GE00

quando

comparado aos GEs. Esse resultado justificado pelo fato de o implante

encontrar-se solto no interior do defeito que foi confeccionado e o PVA
implantado e realizado o EMFI no mesmo dia, ou seja; no havia formao de
qualquer tipo de tecido ao redor do mesmo.
Os valores de MPa apresentaram crescentes variaes conforme
aumento do tempo de seguimento em todos os GEs, ou seja; o PVA suportou a
carga recebida, no sofreu ruptura e alm disso ofereceu ambiente estvel e
adequado para a formao e manuteno do neotecido cavidade receptora.
Discusso

136

5.1.5- Avaliao EDXRF

A Tabela 5 apresente os resultados da avaliao por EDXRF,
onde se observa a incorporao dos minerais Clcio e Fsforo em todos os GEs
de acordo com o aumento do tempo de seguimento quando comparados s
amostras no implantadas, Figura 29.
Os resultados confirmam aqueles obtidos nas Figuras de 30 a 33
da MO, onde houve a diferenciao do tecido inicial de granulao no GE03 em
sseo ao final de 24 semanas. O Enxofre manteve-se inalterado em todos dos
grupos.

5.1.6 - Avaliao por MO

De maneira geral sabido que todo implante, mesmo os inertes quando
implantados so envolvidos por cpsula de tecido fibroso Mow et al. (1984).
A Tabela 6 referente s mdias dos critrios atribudos aos GEs e
analisados por especialistas, apresentam resultados que, em sua maioria
confirmaram o bom desempenho do PVA em todos os GEs, com ausncia de
clulas gigantes e inflamatrias, presena e manuteno do neotecido formado,
demonstrando que o implante de PVA ofereceu superfcie propicia s interaes
celulares em todos os GEs.
Os resultados obtidos pela MO de acordo com as Figuras 30, 31, 32 e
33, observou-se a formao e manuteno do neotecido em todos os GEs
estudados, demonstrando o comportamento inerte do PVA avaliado.
A Figura 41 refere-se aos GCs. Observa-se formao e manuteno de
tecido fibroso conjuntivo denso desorganizado preenchendo totalmente os defeitos
em todos os GES.

Discusso

137

5.1.7- Avaliao dos cndilos e patelas por MEV

Graindorge (2000), estudando as alteraes da morfologia superficial
da cartilagem articular em casos de osteoartrite, conclui que esse processo de
desgaste ocorre rapidamente na ausncia do lquido sinovial e que mudanas no
mecanismo de lubrificao aceleram de modo drstico a degenerao articular
pelo aumento da rea de contato e do atrito entre superfcies cartilaginosas.
A Figura 42 mostra que no presente estudo no foi observado desgaste
do PVA por adeso ou por abraso na superfcie do PVA de todos os GEs.
A integridade das superfcies da regio medial das patelas, Figura 43, foram
mantidas.
Os resultados sugerem que a presena e exudao do lquido sinovial
entre as mesmas durante o processo de movimentao da articulao tenha sido
essencial para a manuteno do PVA aps tempos de seguimento.
Alm disso, podemos ressaltar que o processo de acetalizao e
reticulao via radiao do PVA promoveu a formao de estruturas fortes,
porm complacentes com stios capazes de absorver e reter o lquido sinovial
minimizando o atrito e desgaste entre as superfcies de contato.
A avaliao microscpica por MEV foi de grande importncia para
identificar a presena ou no de mecanismos de desgaste que pudessem ser
gerados durante o processo de cicatrizao ou mesmo aps este pela
movimentao da superfcie da patela sobre o PVA.
As Figuras 44 e 45 referem-se s imagens dos cndilos e patelas dos
GCs. Alteraes significativas em todos os grupos foram observadas, ou seja;
presena de mecanismo de desgaste do tipo adesivo e ou abrasivo em todos os
grupos.
Os resultados confirmam que a presena do neotecido formado gerou
mecanismos catastrficos nas superfcies, sugerindo que o processo de
lubrificao no foi eficiente na presena do neotecido formado.
Discusso

138

6- CONCLUSES E SUGESTES
PARA TRABALHOS FUTUROS

139

140

Nas condies em que foi realizado este estudo e baseando-se nos

resultados obtidos, concluiu-se que o PVA:
1) estimulou ou no interferiu com a proliferao celular na presena de clulas
Vero e MSCs mostrando-se no citotxico;
2) permitiu a adeso celular, a diferenciao das clulas da linhagem osteognica
com manuteno da morfologia celular;
3) suportou a carga e no sofreu desgaste ou abraso pela contra superfcie da
patela;
4) apresentou boa interao com o tecido sseo receptor em todos os grupos e
adsorveu clcio e fsforo em todos os GEs.

SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

testar o PVA em defeitos crticos confeccionados rente e abaixo da CA em
modelo animal de maior porte;
associar o PVA MSCs indiferenciadas e testar in vitro e in vivo.

Concluses e Sugestes para Trabalhos Futuros

141

Concluses e Sugestes para Trabalhos Futuros

142

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