Multiplicao de Bacillus subtilis em vinhaa e viabilidade no controle da meloidoginose, em cana-de-acar 1283

Revista Brasileira de
Engenharia Agrcola e Ambiental
v.15, n.12, p.12831288, 2011
Campina Grande, PB, UAEA/UFCG http://www.agriambi.com.br
Protocolo 165.09 27/10/2009 Aprovado em 27/09/2011

Multiplicao de Bacillus subtilis em vinhaa e viabilidade

no controle da meloidoginose, em cana-de-acar

Rodrigo B. Cardozo1 & Fabio F. de Arajo1

R ESU M O
Objetivou-se, com este trabalho, avaliar o controle da meloidoginose e o crescimento da cana-de-
acar, em funo da aplicao de Bacillus subtilis ao solo aps multiplicao em vinhaa. Bioensaios
foram conduzidos em laboratrio com avaliao do crescimento de B. subtilis em meio lquido com
interesse na melhor composio de meio de cultura, a partir da vinhaa. No experimento em casa de
vegetao foi utilizado solo coletado em rea de cultivo de cana com histrico de alta infestao com
Meloidogyne spp. No solo acondicionado em vasos efetuou-se o plantio da variedade de cana-de-
acar RB 72454, cujos tratamentos foram: controle; vinhaa pura (50 m 3 ha -1); Bacillus subtilis em
suspenso aquosa (50 m 3 ha -1); B. subtilis multiplicado na vinhaa para 50 m 3 ha -1 e 100 m 3 ha -1. A
multiplicao de Bacillus subtilis em meio de cultura base de vinhaa (25%) foi significativamente
superior em comparao com o meio de cultura caldo nutriente. A aplicao de B. subtilis em suspenso
aquosa promoveu o crescimento e a reduo da reproduo dos nematides em cana-de-acar durante
o experimento. A aplicao de B. subtilis multiplicado na vinhaa no proporcionou os benefcios de
estmulo ao crescimento e controle da meloidoginose na cana-de-acar, encontrados com a aplicao
apenas da bactria no solo.

Palavras-chave: resduos orgnicos, Meloidogyne, fitopatologia, controle biolgico

Multiplication of Bacillus subtilis in vinasse and viability

to control root-knot in sugarcane

A B ST R A C T
This work aimed to evaluate the control of root-knot nematodes and sugarcane growth in function of
Bacillus subtilis in soil after multiplication in vinasse. Laboratory tests were developed to define the best
concentration of vinasse on the composition of culture medium to optimize the growth of B. subtilis. For
the experiment in the greenhouse, soil collected in the area of sugarcane cultivation was used. The
following treatments were established: control, vinasse (50 m3 ha-1), Bacillus subtilis in aqueous suspension
(50 m3 ha-1); B. subtilis multiplied in vinasse (50 and 100 m3 ha-1). The multiplication of Bacillus subtilis in
pure vinasse (25%) was significantly superior when compared to nutrient solution. The application of B.
subtilis in aqueous solution promoted growth of sugarcane and reduced reproduction of the nematodes
in the roots during the experiment. The use of B. subtilis, multiplied in vinasse did not achieve the
benefits to promote growth and control of nematodes in sugarcane, found with the application of only
bacteria in soil.

Key words: organic residues, Meloidogyne, phytopathology, biological control

1
Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE), Faculdade de Cincias Agrrias, Rod. Raposo Tavares, Km 572. CEP 19067-175 Presidente
Prudente, SP. E-mail: cardozocomz@terra.com.br; fabio@unoeste.br

R. Bras. Eng. Agrc. Ambiental, v.15, n.12, p.12831288, 2011.

1284 Rodrigo B. Cardozo & Fabio F. de Arajo
INTRODUO
A vinhaa um resduo gerado em grande abundncia, nas
destilarias de produo de lcool. O resduo lquido
caracterizado como de colorao escura e produzido na taxa
mdia de 13 L para cada litro de lcool apresentando, em sua
constituio, uma mistura de compostos orgnicos e
inorgnicos (Paulino et al., 2011). J foram estudados os efeitos
da aplicao da vinhaa sobre as caractersticas e propriedades
fsica, qumica e mecnica do solo; no entanto, so poucas as
informaes relativas aos efeitos na propriedade biolgica,
principalmente sobre a atividade supressiva aos fitopatgenos
do solo (Pedrosa et al., 2005).
Com o aumento da rea cultivada com cana-de-acar,
sobretudo no Estado de So Paulo, a cultura se tem expandido
para novas fronteiras agrcolas com predomnio de solos pobres
e arenosos. Com isto, os problemas fitossanitrios na cultura
aumentaram, entre os quais se destaca a ao deletria dos
fitonematides (Moura, 2000). Dinardo-Miranda & Menegatti
(2003) estimam que na cultura da cana-de-acar os danos
causados pelos nematides reduzam cerca de 20% da produo
da cultura. Com relao estratgia de controle, a aplicao de
nematicidas na ocasio do plantio se apresenta como a prtica
mais utilizada, em especial por esta apresentar resultados
imediatos. Entretanto, o uso de nematicidas de forma contnua
em plantios de cana-de-acar tem sido questionado quanto
eficcia do controle e pela inconstncia dos resultados (Barros
et al., 2003).
A aplicao da vinhaa em grandes volumes no solo
proporcionou resultados positivos quanto ao controle de
nematides em cana-de-acar (Pedrosa et al., 2005). possvel
que o efeito do resduo estudado esteja associado queles
atribudos adio de matria orgnica que, segundo Lordello
(1984), est relacionado liberao de cidos graxos volteis
nocivos aos nematides, alm de criar condies favorveis
proliferao de micro-organismos que atuam como inimigos
naturais desses fitoparasitos (Rodriguez-Kbana, 1986). Apesar
disto, a utilizao de dosagens menores de vinhaa precisa ser
mais investigada haja vista que o aporte de matria orgnica
ao solo menor.
Uma opo vivel para o controle de fitonematides que
no seja o controle qumico convencional nem a utilizao de
dosagens excessivas de resduos orgnicos, o controle
biolgico (Coimbra & Campos, 2005). Algumas espcies
microbianas, como os estreptomicetos e Bacillus subtilis, foram
avaliadas como interferentes no ciclo dos fitonematides
apresentando potencial para utilizao no controle dos parasitas
no solo (Kavitha et al. 2007; Sousa et al., 2006). Ficou
demonstrado que isolados de B. subtilis no apenas produzem
metablitos txicos que afetam o movimento de nematides
mas tambm podem inibir a ecloso de juvenis e o processo
pelo qual eles penetram nas razes (Arajo et al., 2002). Alm
disto, a produo de proteases por Bacillus subtilis (Lian et
al., 2007) e a induo de enzimas de defesa na planta hospedeira
(Kavitha et al., 2007) so mecanismos atribudos rizobactria
no controle dos fitonematides.
Lodo de estao de tratamento de efluentes foi avaliado
como meio de cultura para Bacillus subtilis com resultados de
R. Bras. Eng. Agrc. Ambiental, v.15, n.12, p.12831288, 2011.
multiplicao da bactria considerados satisfatrios (Arajo
et al., 2006). O resduo sucroalcoleiro apresenta caractersticas
qumicas favorveis ao desenvolvimento de micro-organismos
destacando-se a concentrao de matria orgnica e acares
totais (Shi & Zhu, 2007). Alm do mais, vrios grupos de micro-
organismos so estimulados para multiplicao aps a aplicao
de resduos orgnicos no solo, os quais podem estar
envolvidos em algum modo de ao de controle biolgico dos
nematides (Arajo & Bettiol, 2005).
Com a justificativa de se estudar a viabilidade do controle
de nematides por Bacillus subtilis e tambm da necessidade
de se aliar a disposio da vinhaa no solo ao controle biolgico
objetivou-se, com este trabalho, avaliar a multiplicao da
bactria em vinhaa e sua aplicao no controle de nematides
e crescimento de cana cultivada em solo naturalmente infestado
com o parasita.
MATERIAL E MTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no perodo de
novembro de 2007 a outubro de 2008, em Presidente Prudente,
SP. Utilizaram-se amostras de vinhaa concentrada (40oBrix e
30% de matria seca) obtidas na empresa Destilaria Santa Eliza,
Penpolis, SP. O resduo foi analisado em laboratrio para a
determinao de composio qumica apresentando a seguinte
concentrao de macronutrientes em base seca (g kg-1): 9,2 de
N; 0,5 de P; 15,1 de K; 3,3 de Ca; 3,3 de Mg; 5,8 de S. O pH
(CaCl2) do resduo era 3,9. O isolado de Bacillus subtilis
utilizado nos experimentos foi o AP-3, relatado como promotor
de crescimento de plantas (Arajo et al., 2005).
Para avaliao do crescimento de B. subtilis em vinhaa,
formulaes de meio de cultura foram preparadas com doses
crescentes de vinhaa, ajustando-se os seguintes tratamentos:
Vinhaa concentrada; 50% de vinhaa + 50% de gua destilada
e 25% de vinhaa + 75% de gua destilada e meio de cultura
padro (caldo nutriente). Os meios foram preparados para
volume final de 50 mL acondicionados em erlenmeyer (250 mL).
O pH de todos os meios utilizados foi ajustado para 7,0. O meio
de cultura caldo nutriente foi preparado base de peptona (5
g L-1) e extrato de levedura (3 g L-1). Os meios de cultura foram
autoclavados (121 oC por 20 min.) e aps resfriamento
inoculados com 1 mL de suspenso de Bacillus subtilis (AP-3)
em gua destilada, contendo aproximadamente 1.108 ufc mL-1.
Os recipientes, aps inoculao, foram colocados em mesa
agitadora orbital (120 rpm) e deixados sob agitao a
temperatura ambiente, durante cinco dias. Decorrido este
perodo avaliou-se a concentrao de bactrias no meio de
cultura, pelo mtodo de diluio seriada e a contagem de
unidades formadoras de colnias em placas com meio gar
nutriente. Todas as determinaes de crescimento foram feitas
em triplicata.
No meio de cultura que apresentou a maior concentrao
bacteriana foi determinada, tambm, a curva de crescimento de
Bacillus subtilis. Para isto, aps a inoculao do Bacillus
subtilis neste meio de cultura e conforme j descrito, o mesmo
foi colocado em mesa agitadora orbital (120 rpm) durante sete
dias realizando-se a contagem diria da concentrao de
 Multiplicao de Bacillus subtilis em vinhaa e viabilidade no controle da meloidoginose, em cana-de-acar
bactrias no meio, pelo mtodo de diluio seriada e contagem
em placas com meio gar nutriente.
Para avaliao do efeito da introduo de B. subtilis no
solo sobre o crescimento da cana, conduziu-se um experimento
de casa de vegetao. Inicialmente, foram coletadas amostras
de solo em rea agrcola, sob cultivo de cana, da Usina Alto
Alegre, Presidente Prudente, SP, com histrico de alta
infestao por nematides. Pela anlise de extrao de
nematides do solo realizada conforme descrito em Arajo &
Bettiol (2005), detectou-se a presena de 200 juvenis de
Meloydogine spp em 100 cm3 de solo. A anlise de fertilidade
do solo realizada segundo van Raij et al. (2001), apresentou os
seguintes valores: pH (CaCl2) - 5,0; 14 g dm-3 de M.O.; 6 mg dm-3
de P; 2,5 mmolc dm-3 de K; 14 mmolc dm-3 de Ca; 4 mmolc dm-3 de
Mg; 36 mmolc dm-3 de CTC e 58% de saturao de bases. As
amostras de solo coletadas foram homogeneizadas, peneiradas
e colocadas em vasos com capacidade de 15 kg de solo. A
variedade de cana-de-acar RB 72454 foi plantada nos vasos
pela transferncia de colmo contendo cinco gemas. Para a
conduo do experimento foram deixados dois perfilhos por
vaso.
O experimento foi delineado em blocos inteiramente
casualizados, com cinco tratamentos e quatro repeties. Os
tratamentos foram efetivados pela aplicao de B. subtilis
multiplicado na vinhaa e suspenso em gua, sendo dispostos
da seguinte forma e respectivas taxas de aplicao: 1 - Controle;
2 - vinhaa (50 m3 ha-1); 3 - Bacillus subtilis em suspenso
aquosa (50 m3 ha-1); 4- Bacillus subtilis multiplicado em vinhaa
(50 m3 ha-1) e 5 - Bacillus subtilis multiplicado em vinhaa (100
m3 ha). No tratamento Bacillus subtilis em suspenso aquosa
utilizaram-se clulas multiplicadas em tubos com meio slido
as quais foram, posteriormente, raspadas e diludas em gua
para concentrao final de 5,0 x 108 clulas mL-1. Nos tratamentos
em que o Bacillus subtilis foi multiplicado em vinhaa utilizou-
se o meio de cultura com melhor desempenho de crescimento
de B. subtilis na etapa anterior, obtendo-se a concentrao
final de 5,0 x 108 clulas mL-1. As aplicaes de todos os
tratamentos foram distribudas em trs pocas (30, 60 e 90 dias)
aps o plantio da cana. Durante este perodo foi efetuada a
reposio hdrica mantendo-se a umidade do solo prximo
capacidade de campo.
Para avaliao do crescimento da cana foi efetivada,
inicialmente, a medio de altura das plantas, aos 90 dias; aos
105 dias as plantas foram retiradas dos vasos e separada a
parte area das razes. A parte area foi cortada prximo raiz e
acomodada em sacos de papel, que foram levados ao
laboratrio; logo aps, as amostras foram acondicionadas em
estufa de ventilao forada (60 oC) at peso constante visando
determinao da massa seca de parte area. As razes foram que o pico de crescimento bacteriano aconteceu entre o quinto
lavadas em gua corrente para a retirada da terra aderida
superficialmente; em seguida, foram acomodadas na bancada
sob temperatura ambiente, durante 12 h, visando perda do
excesso de umidade; em continuao, as razes foram pesadas
e submetidas extrao de juvenis e ovos de Meloidogyne
spp. Seguindo-se metodologia descrita por Arajo & Bettiol
(2005). Aps a contagem dos juvenis (J2) e dos ovos de
Meloidogyne spp. em cmara de Peters efetivaram-se os
clculos de diluio para expresso dos resultados em juvenis
1285
e ovos do nematide por grama de raiz de cana.
Os dados obtidos foram transformados (raiz quadrada +
0,5) e submetidos anlise de varincia utilizando-se o programa
Sisvar (Ferreira, 2000). De acordo com os valores de F obtidos
nas anlises de cada varivel, realizou-se teste de comparao
de mdia, empregando-se o teste t (5%).
RESULTADOS E DISCUSSO
A vinhaa apresentou-se vivel para uso como meio de
multiplicao de Bacillus subtilis, j que no bioensaio de
crescimento bacteriano os resultados revelaram desempenho
satisfatrio do crescimento de B. subtilis quando comparado
com o meio caldo nutriente (Tabela 1). A melhor performance
de crescimento ocorreu no tratamento com meio de cultivo
base de 25% de vinhaa; este tratamento superou, de forma
significativa, os outros tratamentos, inclusive o caldo nutriente
(meio padro), podendo ento ser recomendado para utilizao
na multiplicao de B. subtilis. A recomendao para diluio
da vinhaa vai de encontro presena de baixas concentraes
de cidos alifticos, aldedos e alcois que so txicos para
clulas bacterianas (Couallier et al., 2006). Por outro lado, a
biodegradao da vinhaa aumenta da concentrao de cidos
orgnicos no meio com a consequente reduo do pH e inibio
do crescimento bacteriano (Cibis et al., 2006); entretanto, os
resultados encontrados confirmam que a vinhaa pode ser
utilizada como meio de cultura para a produo de esporos de
B. subtilis, conforme Shi & Zhu (2007), os quais concluram
que o resduo contm concentraes considerveis de material
orgnico e inorgnico solveis disponveis ao crescimento
bacteriano.
Tabela 1. Crescimento de Bacillus subtilis em unidades
formadoras de colnia (UFC) por mL durante cinco dias,
utilizando-se diferentes concentraes de vinhaa*
Tratamentos UFC (x108) mL-1
Vinhaa pura 01,30 b
Vinhaa 50% 01,91 b
Vinhaa 25% 11,50 a
Caldo nutriente 01,81 b
DMS 00,95 b
CV (%) 27,10 b
* Mdias seguidas de mesma letra no diferem pelo teste t (5%)
A curva de crescimento de B. subtilis no meio de cultura
base de vinhaa (25%), de melhor desempenho no bioensaio
anterior, denominado meio V25, durante sete dias, demonstrou
e o sexto dia (Figura 1). Este perodo pode ser indicado para
produo da bactria com a finalidade de obteno de maiores
concentraes de clulas. O modelo quadrtico foi o que melhor
se ajustou para representar a curva de crescimento bacteriana
com coeficiente de regresso (R2) significativo a 5% de
probabilidade.
Com base na definio da melhor concentrao de vinhaa
e no perodo de crescimento para multiplicao de B. subtilis,
conduziu-se o experimento com a aplicao dos tratamentos
R. Bras. Eng. Agrc. Ambiental, v.15, n.12, p.12831288, 2011.
1286 Rodrigo B. Cardozo & Fabio F. de Arajo

10 Tabela 3. Altura de plantas aos 90 dias e massa seca da

parte area aos 105 dias aps o plantio em cana cultivada
9
em solo infestado com nematides em funo da
ufc mL-1-1

8 aplicao B. subtilis em suspenso aquosa e multiplicado

logu.f.c

2
y = -0,24x +2,38x +3,42 em meio com 25% de vinhaa (V25)
7
2 Altura de Massa da parte area
R = 0,82
log

Tratamentos
6 plantas (cm) seca (g planta-1)
Controle 74,8 b1 20,50 b
5
Vinhaa (50 m3 ha-1) 82,0 ab 24,00 ab
0 24 48 72 96 120 144 168 B. subtilis (50 m3 ha-1) 95,5 a 29,25 a
Tempo (h) B. subtilis V25(50 m3 ha-1) 82,3 ab 20,50 b
B. subtilis V25(100 m3 ha-1) 87,5 ab 24,75 ab
Figura 1. Curva de crescimento em unidade formadora DMS 19,3 06,51
de colnias (ufc) de B. subtilis em meio de cultura base 1
Mdias seguidas de mesma letra em cada coluna no diferem estatisticamente pelo teste t (5%)
de vinhaa (25%)
140
no cultivo de cana em solo infestado com nematides. Na Tabela Juvenis

-1
120 b

Nematides grama de raiz

2 se tem o resumo da anlise de varincia, na qual se observou Ovos
que apenas na massa seca de raiz no ocorreu diferenas 100
significativas entre os tratamentos. b
80
O tratamento representado apenas pela presena de Bacillus b ab
subtilis em suspenso aquosa, proporcionou aumento 60 b
significativo na altura das plantas e massa seca da parte area, ab ab
40 a a ab
aos 90 e 105 dias aps o plantio, respectivamente, em
comparao com a testemunha (Tabela 3). Este resultado 20
confirma a ao promotora de crescimento em plantas,
0
proporcionada por Bacillus subtilis (AP-3) j relatada em
avaliao de crescimento de plantas (Arajo, 2008). Os Controle Vinhaa B. subtilis B. subtilis B.subtilis
tratamentos associados vinhaa com e sem B. subtilis no V25 V25(2x)
alteraram significativamente o crescimento da parte area da Colunas de mesma cor e mesma letra no diferem pelo teste t (5%)

cana. Em trabalho com a utilizao de vinhaa para controle de
nematides em solo, Pedrosa et al. (2005) tambm no
encontraram alterao de crescimento da planta aos 90 dias
aps inoculao dos nematides, com a aplicao de doses de
50 a 1000 m3 ha-1 de vinhaa.
Observou-se, na avaliao de reproduo do nematide,
que apenas o tratamento B. subtilis, no multiplicado na
vinhaa, proporcionou reduo significativa na quantidade de
ovos e juvenis do nematide, nas razes da cana (Figura 2). O
tratamento apenas com a vinhaa (50 m3 ha-1) no inibiu a
reproduo do nematide demonstrando que a vinhaa na
concentrao aplicada no proporciona controle do parasita.
Sharma & Khan (1995) avaliando a adubao mineral e a
infestao Meloidogyne incognita em tomateiro, concluram
que a adio de potssio em concentraes superiores s da
adio de nitrognio e fsforo favoreceu o parasita,
salientando-se que pela anlise qumica efetuada no resduo
foi observada maior concentrao de potssio que os outros
nutrientes. Por outro lado, Pedrosa et al. (2005) afirmaram que
a aplicao de doses de vinhaa acima de 500 m3 ha-1 foi eficaz
no controle de nematides em cana-de-acar.
Figura 2. Juvenis e ovos de Meloidogyne sp em razes
de cana cultivada em solo infestado com nematides,
em funo da aplicao B. subtilis em suspenso aquosa
e multiplicado em meio com 25% de vinhaa (V25).
Experimento de casa de vegetao
A presena de Bacillus subtilis no solo proporcionou
reduo na reproduo do nematide na raiz da cana embora o
mecanismo de supresso no tenha sido determinado (Figura
2). Estudando este mesmo efeito do B. subtilis sobre
Meloidogyne incognita, em beterraba aucareira, Kavitha et
al. (2007), concluram que o aumento na atividade de enzimas
de defesas em plantas tratadas com a bactria pode ter
contribudo para o controle do parasita. Arajo et al. (2002)
concluram, estudando o efeito de B. subtilis sobre o nematide
Heterodera javanica, que umas das formas de ao da bactria
sobre o parasita seria na orientao dos nematides no solo.
Em outro trabalho, avaliando o controle biolgico
proporcionado por B. subtilis, relatou-se que a rizobactria
reduz a reproduo dos nematides de galha em raiz de tomate

Tabela 2. Resumo da anlise de varincia das variveis altura de plantas, massa seca de raiz, massa seca da parte area,
nmero de ovos e juvenis de nematides
Quadrado mdio
Fonte de variao G.L.
Altura Raiz Parte area Ovos Juvenis
Tratamentos 04 0,72* 01,64 n.s 0,52* 15,14* 03,35*
Resduo 15 0,35* 02,37 n.s 0,20* 05,58* 00,88*
CV (%) 5,80* 18,7 n.s 9,29* 25,00* 14,40*
* Significativo pelo teste F (P < 0,05), ns no significativo

R. Bras. Eng. Agrc. Ambiental, v.15, n.12, p.12831288, 2011.

 Multiplicao de Bacillus subtilis em vinhaa e viabilidade no controle da meloidoginose, em cana-de-acar
diminuindo a quantidade de ovos do parasita apresentando,
desta forma, uso potencial para programas de manejo integrado
da meloidoginose em tomateiro (Jonathan et al., 2000; Arajo
& Marchesi, 2009). Recentemente, foi descrita a associao
das proteases microbianas produzidas por Bacillus como
fatores de virulncia contra os nematides (Lian et al., 2007).
Pode-se afirmar que o controle biolgico da meloidoginose
em cana-de-acar com B. subtilis uma alternativa promissora
para compor programas de controle integrado do parasita no
solo. Observa-se tambm que a bactria, quando multiplicada
em vinhaa, teve sua ao reduzida sobre a reproduo do
nematide. A presena do resduo no solo nas doses utilizadas,
pode ter favorecido o parasita e dificultado a ao de controle
do nematide proporcionada por B. subtilis.
CONCLUSES
1. A multiplicao de Bacillus subtilis em meio de cultura
base de vinhaa apresentou desempenho semelhante com o
meio de cultura padro avaliado.
2. A aplicao de B. subtilis em suspenso aquosa promove
o crescimento da cana-de-acar e reduz a reproduo dos
nematides de galhas.
3. A multiplicao de B. subtilis em vinhaa no proporciona
os benefcios encontrados na aplicao apenas da bactria,
quanto ao controle da meloidoginose na cana-de-acar.
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