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Esta proeza técnica, ao alcance de um nimero crescente de laboratérios, s6 & possivel ‘acas ao desenvolvimento acelerado das técnicas de sinte- se quimica, catalisado pelo advento das téenicas da Enge- sharia Genética. O alargamento continuo do campo de apl- caglo dos fragmentos sintéticos de ADN, assim como 0 aspecto mais fundamental do estudo estrutural de certas seqiiéncias partculares, constituiram estimulos poderosos para os quimicos orginicos cujos exforgos conduziram 20 sjustamento e 20 aperfeigoamento das téenicas de sites. ‘Apresentamos neste artigo um apanhado geral da qui rica usada na sintese de ADN, tal como ela ¢ praticada atualmente. PRINCIPIOS DA SINTESE QUIMICA DE ADN. a) Resumo das etapas da s{ntese A sintose quimica em solugio de um oligodesoxinucleo- {ideo comporta a3 seguntes etapa: 1 — Preparagio dos quatro desoxinucleotideos, corres- pondentes a desoxitimidina, desoxicitidina, desoxiadeno- sina e desoxiguanosina completamente protegidos, “buil- ding blocks” de base da sintese. 2. — Desprotesso seletiva de dois desoxinuéleotideos a condensarse um com o outro, de maneira a liberar em cada ‘um dos blocos unicamente as fungSes implicadas na forma: io da ligagdo internucleotidica. 3. — CondensagSo dos compostos assim gerados para formar um dimero inteiramente protegido. 4 — Extensfo da cadeia de ADN repetindo as reagGes das etapas 2 e 3 até a obtengio de um oligodesoxiribonu- ceotideo completamente protegido. 5 — Desprotegao seqsencial e controlada do oligodeso- xiribonucleotideo. 6 — Isolamento, purificagto e caracterizagao, Quanto a extensfo da cadeia desoxiribonucleotidica, realizada em fase s6lida, sfo necessérias algumas etapas suplementares: 4) — funcionalizaggo de um polimero insokivel. fi) — fixago do primeiro desoxiribonucleotideo prote- ‘do da cadeia oligodesoxiribonucleotidica a sintetizar, sobre a fungi do suporte sido. ill) ~ clivagem da cadeia de ADN do suporte solido. ') Preparacdo dos blocos de base da sintese. ‘As substincias de base da sintese de ADN sio os qua- tro desoxiribonucleosideos: desoxitimidina, desoxicitidina, ‘QUIMICA NOVA/ABRIL 1985 108ESQUEMA 1 oS Lon desoxiadenosina ¢ desoxiguanosina; (obtidos por degrada- ‘¢f0 de ADN de origem natural). (Esquema 1). Na molécula desoxinucleosidica podem-se distinguir ‘és centros que vlo ser objeto de trés formapbes distintas: as bases, as fungSes hidroxilicas em posiglo 5° e em posi- 03", 1) Protegéo das funges aminas exocicicas ‘As bases que possuem fungGes aminas primérias (a timi dina no possui) tém que ser protegidas. Esta proteedo ¢ permanente, visto que o centro amina- do nio esti implicado nas reagGes de extensio oligomérica. Portanto os grupos protetores devem ser estiveis a0 longo de todas as etapas de sintese, No entanto eles devem poder ser retirados no fim da sintese em condigdes que preser- ‘ver a integridade da molécula final. Os grupos que, nas estratégias de sintese mais utilizadas, melhor satisfizeram estas condicbes, s¥0 0 grupo bensollo para a desoxicitid- nae a desoxiadenosina e 0 grupo isobutanoilo para a deso- xiguanosina®. A sua introduglo tem que ser seletiva a fim de no bloquear os grupos hidroxilicos do ciclo desoxiri- ofuranosilo. Estes grupos so objeto de uma protegdo transit6ria que pode ser especificamente removida apos acilagdo dos grupos aminados* (Exemplo: esquema 2). ‘Uma protecio suplementar original foi recentemente Introduzida por virias equipes, destinada a proteger a fun- ‘fo lactimica da desoxiguanosina, fonte de reages secun- Gérias durante as reagOes de condensagio ¢ de fosforila aot. 2) Transformagio dos grupos hidroxilicos ‘As fungGes hidroxilicas em posic#o 5" ¢ 3° tém de ser uma protegida por um grupo protetor transit6rio, a outra fosforilada. A escolha do centro a fosforilar depende da estratégia adotada, ‘A estratégia que consiste em fosforilar a posigo 3° deu até agora os melhores resultados através.dos métodos co- 108 ‘QUIMICA NOVA/ABRIL 19885, ESQUEMA 2 wa ™~ iio oy shecidos pelos nomes gerais de fosfatotriéster e de fosfito- triéster. ‘A protegfo do grupo hidroxilico em posigZo 5° tem de ser temporéria. Ela tem que ser removida antes de cada etapa de condensaio, durante a extensio da cadeia deso- xiribonucleotidica. O grupo protetor deve, neste caso, ppossuir as propriedades seguintes: 4) — poder ser introduzido seletivamente em posigho 5° deixando intacta a fungdo hidroxilica em posigao 3", i) — poder ser retirado em condigdes suaves que no dem lugar a nenhuma reagio secundaria; Ii) — ser estavel em todas a8 etapas de sintese, de des protegio e de purificaglo que se seguem & sua introdugéo, ix) — eventualmente facilitar, pela sua introdugo, a pu- sificago dos intermediérios de sintse, Entre outros grupos introduzids com bons resultados, © 4,4-dimetoxitrtilo € um dos mais conetamente adots- dos*, E introduzido através do seu cloretotirando benefi- cio da sua seletividade pela posigfo 5 eondicionada por fatores estéricos. (Exemplo: exquema 3). © grupo 4,4'dimetoxititilo pode ser quantitative & rapidamente retirado em condigdes de baixa acidez (Ex. fcido dicloroscétco, brometo de zinco) sem ruptura ou com ruptura insgnificante da lgagto glicos(dica esta rea ‘0 conduz & formasto do cation dimetoxitrtlo decor l- raja, uj absorbincia pode ser medida espectrofotometsi- camente. Esta medida € particulammente Gt na sintese ‘em fase sblida pois ela é a Unica indicacgo da eficdcia das reagées de condensagfo durante a construgdo da cadeia oligonucleotidica. G) A fosforilagéo em posigdo 3° dos nucleosideos pro- tegidos nas bases ¢ no grupo hidroxilico em 5” pode condu- 2ir, segundo a estratégia excolhids, a um bloco complets- ‘mente protegido, ou a uma espécie fosforlada ativa capaz de reagir diretamente com outro bloco desoxinucleotidi- co desprotegido em posigfo 5" para formar a liga inter nucleotidica. ‘Numerosos agentes de fosforilago tém sido utiizadosdcr cay Desoxtadenoaina ic em sintese de oligodesoxiibonucleotideos, sobretudo na smetodologia do fosfatotiéster (Esquema 4). ‘Um dos substtuintes do dtomo de fésforo protege de rmaneira permanente o anion fosfato, responsivel pelos fr cos rendimentos das reagSes de condensacéo, assim como pela dificuldades crescentes de purificagfo e de solubilida- de com 0 comprimento dos oligdmeros, surgidas na meto- dologiaincial dos fosftodiéster®. © outro substituinte tem um papel de prote;éo tempo- ria, destinada a ser substituida pela lgasto fosfato inter. ucleotidica. O grupo protetor permanente deve possuir uma estabil- dade total durante as reagSes de eliminagdo dos grupos protetores temporirios e durante as reagdes de condensa- ¢0. Néo deve interfer negativamente com o rendimento 6 a eficécia destastikimas. Ele tem no entanto que ser ret- rado especificamente no fim da sintese sem provocar a rup- tura concorrente das ligagdesinternucleotidicas. ESQUEMA 4 Yr we e u 8 ny ox p= base petegidn bets Dinetoxitritile als aiguite , alguito aubeeienizo «+. we arilo, 2-ettlartlo Reetlitiosrilo, artlo aubativetdo Xe tetazolo, oxtbansotriazolo elore «. o* ey oa 4 a? © grupo protetor transitério deve ser suficientemente estivel para permitiro isolamento, a purificagao e a estoca sgem_dos blocos desoxinucleotidicos completamente. pro- ‘tegidos. A sua eliminagZo deve ser especifica ¢ répida em condigdes que preservem os grupos protetores permanentes © 0 grupo protetor temporirio em posicio 5’. s grupos ortodorofenilo (com Y = 0) permanente ¢ 0 cianoetilo (R = CHCH,CN, com Z = 0) temporirio sio ‘exemplos de grupos muito utilizados na metodologia dos fosfatotriéster’ (Exemplo: esquema 5). © grupo protetor permanente correntemente utilizado 1na metodologia do fosfitotréster 6 0 radical metilo. O ter- ceiro substituinte do étomo do fésforo é um grupo azodial quilo introduzido em substituigdo de um tomo de cloro, (© qual confere uma reatividade particularmente forte ao in- termedifrio fosfocloridrito (utilizado durante o desenvolv- ‘mento iniial do método)*, que o tora instavel ede empre £9 povco comodo. re Ee oo er | QUIMICA NOVA/ABRIL 1985 107s compostos diisopropilamino -e morfolinofosforoami- dito possuem um bom compromnisio reatividadeestabilida- de (Exemplo: esquema 6). E importante sublinhar que o sucesso da sintese quimica de ADN baseiase sobretudo na preparacio destes blocos de base, isto é, na escolha dos diferentes grupos protetores, no rendimento das diferentes reagdes o na pureza dos de- soxinucleotideos completamente protegidos. ESQUEMA 6 ©) Reagfo de condensagéo Para poder condensar dois desoxinucleotideos pelo mé- todo do fosfatotréster, 6 necessirio liberar separadamente por um lado a fungéo fosfato e por outro 0 grupo hidrox.- co em 5" das suas proterSes temporirias. Por exemplo, 0 grupo dimetoxitrtilo é retirado em condigdes dcidas su ves € 0 grupo cianoetilo, em condigbes bisias suaves. Evi SE, es, om 0 ° — A on = Y Tag lk \ > - O- m5; Ors, 5 ® 108 ‘QUIMICA NOVAVABRIL 1885, (<dentemente a reagio de condensacio necesita da formaco de espécies ativas capazes de reagir com bons rendimentos, sem formagao de produtos secundérios. ‘A ativagdo do fosfatoditster ¢ freqientemente realiza 4a pela apo conjugada de um cloreto de arlosulfonio e de ‘uma amina heterocicica, ou de uma sulfonamida preparada antecipadamente a parti deste tipo de compostos"® (Esque- ma). ‘A ativacto dos fosforoamiditos ¢ realizada por um agen- te de protonaglo, écido fraco (Ex.: 0 tetrazolico, pKa= 4,9) que acelera a partida do grupo dialquilamina ¢ favoriza o ataque pela fungdo hidroxifica que vai estabelecer a ligacio internucleotidica'™. Nao € portanto possivel dentro desta ‘metodologia eliminar o grupo dimetoxitrtilo em condi ‘es écidas em presenga do grupo fosforoamidito (Esquema y ESQUEMA 8 4) Construrio da cadeia oligodesoxinucleotidica Na sfntese em solugfo ¢ pela metoddlogia do fosfato- ‘tiéser, podese fazer a extensfo da cadela polinucleotii ca de maneira alternada no sentido 3°~+5" ou 5'-3" visto que se pode desproteger 0 grupo hidroxilico na extremida- de 57, ov trifosfato na posiclo 3° do oligbmero em cons- ‘rugdo. Dois oligdmeros podem igualmente ser condensados tum com 0 outro. Devido a sensiblidade dos fosforoamidi- tos as condizSes lgeiramente Scidas esta flexbilidade pré- prin 206 tresterfosfatos nfo se aplica ao método do fost. totréster que nfo foi desenvolvido em solugfo. A sintese fm solugfo permite a deteogHio de reapBet secundérias de smaneira mais direta que as{ntese em fase sida; ela permite 4 identificagio © compreensfo da origem dos produtos ‘QUIMICA NOVAVABRIL 1085 100parasitas © portanto posibilita a intervengio sobre of pe Fimetros corretores (Esquema 9). ‘A extensfo da cadeia de ADN em fase s6lidarealiza-se numa $6 direpo (em geral 3°->5') a parti de um desoxi- ribonucleosideo fixo por uma das fungBes hidroxilicas a uum suporte sblide. A fixagfo efetuase, em geral, através, da formagio de uma ligagio am‘dica entre um 2teroxi 3*sueciniloribonucleosideo e um polimero insolivel ami- nado (P-NH,)" (Esquema 10), ESQUEMA 10 orf pr ettosina, adenine, quanina provegiaa ov tinina. 110 ‘QUIMICA NOVA/ABRIL 1885 © poliestirenodivinilbenzeno, a resina composta polidi- ‘metilacrlamida-kieselguhr, a silica, as esferas de vidro de pporosidade controlada, a celulose, 0 co-polimero teflon- poliestiteno so exemplos de polimeros insotiveis corren- ‘temente utlizados. ‘A extensio da cadeia polinucleotidica em fase solida consiste na repetiglo de um ciclo que compreende essen- ialmente: 1) A reaglo de desprotegto do grupo hidroxilico em 5° do primeiro nucleosideo (ou da cadeia em crescimento) fixo no polimero insolivel. 2) A reagfo de condensagfo entre a fungfo hidroxiice liberada ¢ a espéie nucleotidica introduzida em solucfo e ativada “in si” no étomo de f6sforo em posicdo 3 Com o método do fosfatotriéster uma terceira reasfo de ‘oxidaglo do fosfito em fosfato ¢ necessria. Uma reagSo suplementar 6 por vezes efetuada. Ela visa 0 bloqueamento 4a ligeira percentage dos grupos hidroxilicos que nfo reagiram na reagfo de condensagio a fim de desativiclos para as reagdes ulteriores, Os reagentes em excess0, 08 subprodutos ¢ 08 solven- tes das reagdes ¢ de lavagem sto eliminados por simples filtragdo do suportesblido (Esquema 11), © isolamento do produto ligado a0 polimero insohivel 6 por conseqiéncia, simples ¢ répido em relagdo aos méto- dos convencionais em solugfo, O conjunto das operacdes prestase bem & automatizagio, ‘Uma desvantagem da fase solida ¢ a cinética desfavors- vel. Para conseguir reagSes completas dentro de tempos razodvels & indispensével utilizar excessos importantes de reagentes cuja pureza é portanto erftica. Tragos de impure- 1as reativas podem inibir completamente a reaglo de con- densagio. Em fase solida, a acumulagdo de produtos indesejéveis 6 inevitivel visto nfo haver purificagfo em nenhuma etapa da extensio do fragmento de ADN. Uma maneira de mini mizar este inconveniente consiste em utilizar dimeros ou tcimeros preparados em soluglo, estratégla que nés adota- ‘mos e que diminui de um fator 2 ou 3 0 nimero de reagdes fetuadas no polimero insolive. @s portnero snsorsverESQUEMA 11 2p "Bp %» m1) oeeprotacto sepatiefo 2) condenuncko --— [ele nes a] . a hi § ant pa onfe fo, coed -f -(c8), baa o 8S 4 be » dineeoniteitite 1p = citosina ov adenina o& guanina protagida 2 «+ grupo protetor do fontato P= polinere tnsotives © comprimento do fragmento de ADN, que é possivel obter por sintese quimica, depende evidentemente do ren- dimento da etapa de condensagio que tem que ser mantido (© mais alto possivel (90 a 95%) de maneira reprodutivel. Nés preparamos corretamente fragmentos de 30 a 40 nu- dleotideos pelo método do fosfatotriéster. Do ponto de vista das vantagens e inconvenientes, os métodos do fosfato- tigster e do fosfitotriéster sfo equivalentes no momento tual. ©) Desprotegio, isolamento e putificacso ‘A desprotegdo do fragmento de ADN é uma operacio delicada que deve preservar a integridade do edificio mole- cular. ReagGes incompletas ou uma degradagfo parcial con- duzem a uma mistura complexa de produtos. ‘A desprotegio compée-se de 3 etapas distintas: 1) — transformagio dos grupos triesterfosfatos em dies- terfosfatos; Ul) — Desprotegso das bases; IID) ~ A desprotecdo da fungio OH terminal em 5”. 1) A desprotecfo dos grupos fosfatos € uma fonte poss- vel de rupturaintermucleotidica. Esta pode ser minimizada utilizando reagentes seletivos antes de desproteger as bass. Se a extensio da cadeia de ADN for realizada pelo méto- do do fosfatotréster em fase sblida, a clivagem do suporte insolivel efetuase com 0 mesmo reagente de desprotegso dos grupos fosfatos clorofenilados, por exemplo com o 2 itrofenilcarbaldoximato de tetrametilguanidina. O gri- po metiloutilizado com 0 método do fosftotrister é deslo- ‘ado por ataque nucleofflico pelo anion tiofenalato antes da clivagem. Esta ¢ efetuada com amoniaco em condicSes suaves. I) As aminas exociclicas das bases s8o desaciladas por smondlise a $0°C. Este tratamento provoca uma ruptura, que nfo 6 desprezivel, das ligagdes fosfatos internucleot!- dicas quando 0 fosfato esté na forma de trister; esta é a razfo pela qual se converte antecipada e seletivamente 0 fosfatotriéster em foxfatoditster. IN) O grupo protetor da fungfo hidroxilica em posicso 5° & 0 altimo a ser retirado (pelo dcido acético 80% no caso do grupo dimetoxitritilo). E conservado até o fim para impedir a formagdo de tristeres fosfbricos ciclicos que conduzem a estruturas oligodesoxiribonucleotidicas com ligagbes 5+, durante as primeras etapas de desprotegz0. Devido a0 seu ‘cardter hidréfobo, 0 grupo dimetoxitrilo protetor da fungfo S'OH faclita 0 tsolamento do produto ‘por cromatografia de silica em fase inversa (Esquema 12). Os métodos de isolamento e de purificagfo correntemen- te utilizados sf0 a cromatografis de DEAE-celulose, de Se- fadex, de camada fina de silica, a cromatografia Liquida a alta pressfo (HPLC) com coluna de silica de fase inversa ou de troce de cations ¢ a eletroforese preperativa em poli ilamida. ‘A caracterizagéo do produto isolado marcado numa das extremidades com um radioisbtopo pode ser efetuada QUIMICA NOVA/ABRIL 1966, mpelo método de sequenciamento de ADN de Maxam e Gilbert. E no entanto necessério um reajustamento das condigaes das reagBes aot fragmentos de pequeno compri- mento"*. Um outro método, conhecido pelo nome de “Wandering spot”, basca-s na andlise em duss dimensBes (cletroforese em acetato de celulose, seguida de cromatogra- fia em camada fina de DEAE-celulose) dos fragmentos do dligonucleotideo sintético marcado numa extremidade, ob- ‘tidos por digestio parcial com uma exonuclease’. Este mé- todo restringe-s a fragmentos de comprimento inferior a 20 nucleotideos. ALGUMAS APLICACOES RECENTES DA SINTESE DE ADN NO NOSSO LABORATORIO DA U.LB. ‘As aplicagies dos cligodesoxiribomucleotideos de se- qéncia definida cobrem quase todos 0s aspectos da inves- tigagdo que implicam a recombinagio de ADN, tanto no que diz respeito a construcdo, & identificagio e a caracte- rizagdo de clones bacterianos particulars, como 8 manipu- lagdo do ADN clonado com o fim de modificar a sua estru- ‘ture. Nos campos da determinacdo de seqiéncias de ADN, do estudo das inter-reagdes proteina-ADN ou da andlise estru- tural do ADN, 08 oligodesoxiribonucleotideos sintéticos tém-se revelado uma arma extremamente itil ‘A nossa equipe de sintese quimica de ADN, do departa- mento de Biologia da U.L.B. (Université Libre de Bruxelles) faz parte de um grupo de investigadores formados em dife- rentes disciptinas tals como a Biologia, a Genétice, « Quimi- ca ea Imunologia. A coordenagdo das competéncias ¢ onjugagio dos esforgos conduziram a alguns sucessos no dominio da Engenharia Genética aplicada a Medicina. O nosso trabalho consiste em fornecer sondas de oligodesox- ribonucleotideos de seqUéncia definida que possbiitaram a varredura (“screening”) de bancos de clones ¢ 0 isolamen- to de cepas de bactérias que produzem proteinas humanas de interesse terapéutico, tais como a alfa-l-antitripsina, a antitrombina III € a uroquinase™*, Efetuamos igualmente a sintese total da seqigncia de ADN que codifica para a somatocrinina humana (140 pares de bases) ¢ introduzi- mola num vetor plasmidico afim de exprimir este fator hormonal na bactéria. Estes exemplos ilustram de manei- 12 no limitativa @ importincia da quimica de sintese dos cidos nucléicos em qualquer programa de Engenharia Genética: podemos prever, sem alguma divida, que esta importancia continuard a aumentar intensivamente no fu- tro, AGRADECIMENTOS Desejo deixar aqui expresso os meus agradecimentos as seguintes pessoas pela sua colaboracto: ne ‘QUIMICA NOVAJABRIL 1985 Dr. A. Heraog, P. Jacobs, P. Hérion, T. Cabezon, B. CColay, J. Urbain A. Bollen, Ses. (ras) A. Vander Straten, F, Brockly, O. Chuchana, R. Lauriau, A. Van Elsen e D. Siberdt, do Departamento de Biologia Molecular da ULB. (Cniversté Libre de Bruxelles). Este trabalho foi efetuado gracas 20 apoio da Region Wallonne-CG.C. T., IRSIA, UCB-Bioproducts, Smith- Kline/Rit e 0 FNRS (Fonds National de la Recherche Scien- tifique), Belgica Brasilia, Fevereiro de 1984, Referéncias: "G5, Powers, RL. Jones, CA. Randall, M.H. Caruthers, J. van’ de Sande ¢ H.G. Khorana. J. Am. Chem. Soc. 97, 975 1975). 7 ELL. Brown, R. Belaaje, MJ. Ryan © H.G. Khorana. Methods in Enzymology 68, 109 (1979). 3GS. Ti, BL. Gaffney © R.A. Jones. J, Am. Chem. Soc. 104, 1316 (1982). 4S. Jones, CB. Reese, §, Sanda © A. Ubasawa, Tet Lett. 23(47) 4755 (1981). ) HLP. Daskoloy, M. Sekine © T. Hata Bull Chem. Soe. Japan 54,3076 (1981). ©) BL. Gaffney ¢ RA. Jones. Tet Lett. 23(22) 2257 (1982). 4) T Trichtinger, R. Charubala¢ W. Plederer. Tet Lett. 24(7) 711.4983). ©) M. Sokine, J. 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