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  • COLLINS BRAGA BONATO - Introdução A Métodos Cromatográficos, 7 Edição (1997)

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    Guilherme Lucchini
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    Cromatografia

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    COLLINS; BRAGA; BONATO - Introdução a Métodos Cromatográficos, 7ª Edição (1997)

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    COLLINS BRAGA BONATO - Introdução A Métodos Cromatográficos, 7 Edição (1997)

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    Na montagem da coluna em tubo de material maledvel, deve-sefechar a extremidade inferior & quente (ou por grampeamento c se faz dois ou trésFuros para evitar formagio de bolhas de ar quando do enchimento, ‘A compactagio 6 feta deixando-se eair no (ubo um tergo da quantidade (otal do adsorvente, de cada vez, de uma altura de 20 em, por duas ou trés vezes. A coluna torna-se rigida podendo ser segura por garras. A amostra, preparada como foi descrito anteriormente, 6 colocada no topo da coluna de adsorvente, Em seguida, acrescenta-se a fase mével até que sua linha de frente atinja a base da coluna (pode-se deixar uir algumas gotas, se necessirio), Acescolhia da fase mével ¢ as dimens ies da coluna esto na dependéncia dos resultados da analise da mostra por cromatografia em eamada delgads, cujo adsorvente contém indicador fluorescente. A coluna, pds desenvolvimento, 6 exposta A luz ultravioleta¢ se faz delimitagdes das faixas, contendo os adsorvatos separados, as quais sio cortadas, usando uma lamina afiada, As fatias deverdo ser cortadas com cautela, € tem seguida elutdas com solventes apropriados (éteretiico, cloroférmio, metanol, ete.). No caso de ter sido usiao tubo de vidro, este deve ser invertido e abrindo-se a torneira o recheio se desliga. A aplicagio de i, Tiganddo uma bomba compressora na extremidade do tubo onde se encontra a torneira, também faz. ‘com que 0 recheio se desligue. A seguir separam-se as faixas que foram delimitadas com a luz ultravioleta, Parase (er uma separagio ideal 6 conveniente usar um Gnico solvente como eluidor, da mesma mancira {cromatogeafia em camacla delyada, Em caso de se usar um eluidor misto, 0 adsorvente deveré ser umidecido com o mesmo, depois seco ¢, em scguida, usado no enchimento, A proporgio do adsorvente ec amostea, enquanto na coluna Gimida 6 de 30:1, nesta técnica 6 de 70:1 em caso de uma separagio média © 1 caso de uma separagao dificil € de 300:1. Pode-se usar até 50 g da amostra numa coluna seca de 2m de altura ” ‘Com esta técnica pode-se separar até enantidmeros tais como: cO,CHs cu SCHy c 4 CO,CHy 4 0 10. USO DA CROMATOGRAFIA POR ADSORCAO ML. ‘Sio varias as éreas de pesquisas nas quais este tipo de cromatografia 6 utilizada, como por exemplo; a. Em laboratérios de quimica orginica para separar ¢ purificar reagentes © materiais obtidos por sinteses; b. Em laboratéries de produtos naturais, os quais sio normalmente submetidos a este métodg ‘cromatogrifico em eseala preparativa e analitica; ©) Em laborat6rios de andlises clinicas para separar esterOides de urina ou de sanguc, etc, REFERENCIAS BROWNING, D.R. Cromatografia, Toray-Masson, $.A., Barcelona, 1971. HEFTMANN, E. Chromatography, 2 edigio, Reinhold, New York, 1967, SHRINER, R.L3 FUSON, R.C; CURTIN, D.Y. ¢ MORRIL, T.C, Ideniificagao Sistematica dos Compostos Organicos: Manual de Laboratério, 6 edigio, Guanabara Dois, Rio de Janciro, 1983, ieaancinns A CAPITULO V CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA Augusto Cesar C. Spadaro Faculdade de Ciéncias Farmacéuticas de Ribeirao Preto Universidade de Sao Paulo n 1. INTRODUCAO As primeciras observagbes registradas na leitura, referentes & troca idnica, foram feitas por WAY e por THOMPSON em 1850. Estes quimicos, especializados em solos, descobriram, nas primeiras décadas deste século, a capacidade destes em remover fons NH} de solugGes que os atravessavam, substituindo-os por uma quantidade equivalente de fons Ca2+ . A partir destas observagdes, varias tentativas foram realizadas no sentido de produzir trocadores inorgdnicos mais apropriados. As principais dificuldades encontradas ram principalmente quanto ao acesso da substincia a ser trocada no material utilizado como suporte, refletindo em uma baixa capacidade de troca e dificuldades na regeneragao deste, para ser novamente ulilizado. Os trabalhos de GANS evidenciaram estas tentativas. Utilizando proporgées moleculares de 1Al203 :10Si02 ele obteve um produto que nao se dissolvia na 4gua c cra resistente a desintegracao. ‘Apesar das dificuldades encontradas, a recompensa destes esforgos foi obtida com a utilizago do processo de troca como Ca?* , Pb?* e Mg?* ‘ica para suavizar a dureza da 4gua, denominacdo dada a gua que € rica em cétions Em 1917, a literatura registra uma das primei 5 tentativas do emprego da troca idnica para resolver problemas analiticos de investigagao bioquimi , descrevendo a utilizagao deste método para a determinagao do teor de amOnio na urina, em trabalho desenvolvido por FOLIN ¢ BELL. Por volta de 1935, comegaram a ser produzidas resinas de troca iénica organicas, muito mais eficientes, passando a constituir um meio quimico de extraordinério valor em processos analiticos. Ostrabalhos desenvolvidos pelos pesquisadores do Projeto PlutGnio da Comissio de Energia Atomica nos Estados Unidos promoveram grandes avangos na separacao de Anions e cétions por troca idnica, que despertaram a atengio de pesquisadores de outras éreas para este processo cromatogréfico. Ostrabalhos pionciros de MOORE e STEIN na separacao de aminodcidos, de FRUTON na separagao de peptideos ¢ de COLIN c col. na separagio de écidos nucléicos ¢ derivados mostraram o valor do método no campo bioquimico, tendo iniciado uma era nesta drca, B 2. 0 MECANISMO DE CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA Na cromatografia por troca idnica.a fase estacionéria ¢ altamente carregada, sendo que solutes com cargas de sinais contrérios a esta sio seletivamente-adsorvidos da fase mével. Os solutos adsorvidos podem ser subseqlentemente eluidos, por deslocamentos com outros fons, com o mesmo tipo de carga, porém com maior forga de interacdo com a fase estacionéri Os diferentes graus de afinidade eletrostatica entre o trocador € 0s ions da fase mével regem este tipo de cromatografia. A separacio de materiais por cromatografia por-troca idnica-esté-baseada.na adsorsio ‘eversivel ¢ diferencial dos fons da fase mével pelo grupo trocador da matriz. A diferenga de afinidade entre ‘98 fons da fase mével ea matriz € devido a diferencas de carga, sendo possivel controlé-la utilizando fatores como o pH e a forga iénica. (© mecanismo da ago de um trocador idnico esta resumido na Figura V-1. O trocador ca ‘caso, est em equil ical contendo os fons X* (a). B* € C2* sio materiais a serem separados, Quando determinada quantidade de tais amostras sio colocadas com 0 trocador ocorre a adsorgio, liberando quantidade equivalente dos fons X* , anteriormente ligados & matriz (b). Apos a adsorgio € aplicado um eluente, que contém fons Z* com uma afinidade pouco maior pelos grupos trocadores da mateiz, Estes fons vao provocar a liberacdo da substancia B* ,ligada mais fracamente & matriz que a substiincia C?* (¢). Passando a seguir 0 segundo cluente, contendo os fons W* com maior afinidade ainda pela matriz, haver4 a liberagao do material C?* , ¢ assim, a separagio dos materiais B* C2* (d).0 feito dos fons de maior afinidade relativa a X* , isto 6,Z* © W* , pode também ser conseguido por concentragées erescentes deste, alterando 0 equilibrio entre a fase mével ea fase estacions ico, neste com o eluent atctt He - re), s Os ctt ott = st ct a > e 4 e FIGURA V1 Esquema do mecnino de roca ie, Bt eC sso mater is a serem separados. X°,7.* e W* sto ons contidos nos cluenles 1,2 3, respectivamente. Para que a coluna possa ser novamente utiizada, ela preci ser regencrada, isto 6 ser equilibrada com I. Neste caso, 0s fons do eluente tém uma ‘menor afinidade pelo grupo trocador da matriz, mas a condigao de equilbrio ¢aleanda fazendo-se passar pela coluna um volume do eluente igual a 5.10 ” vezes a sua capacidade. Deste modo, 6 possivel ocorrer a troca de fons, eliminando aqueles contidos nos eluentes anteriormente utilizados. Sendo assim, o grau de afinidade 6 superado pela maior concentragio de fons (e), Um perfil de eluigdo hipotético, referente a situagio representada neste esquema, pode ser visualizado nna Figura V-2. @e/\ © MEDIDA RELATIVA DAS SUBSTANCIAS VOLUME EFLUENTE FIGURAV-2 Perfil de eluigto hipottico,obtido na steagho cromatogeica representada na Figura V-l. As setas 1,2¢ 3 referem-se 4s mudangas dos eluentes da colunacromatogrtics, 3. AMATRIZ ‘A matriz de um trocador € constituida de um material poroso, natural ou sintético, inerte, insolvel em gua e em solventes orginicos, apresentando ligagdes covalentes a grupos trocadores idnicos. As matrizes, ‘quanto a0 material que as formam, sio classiicadas em inorginicas e organicas, sendo naturais ou sintéticas. Por serem, em geral, mais eficientes, s40 amplamente utilizadas como matrz, resinas organicas altamente polimerizadas, com ligagdes cruzadas. Dependendo do grupo trocador ligado covalentemente & matriz, 0s trocadores inicos sio classificados ‘em anidnicos e catiOnicos. Os trocadores aniénicos, como o pr6prio nome indica, trocam dnions ¢ apresentam, portanto, grupos ‘nicos positivos ligados & matriz (Figura V-3). Os trocadores catiénicos, inversamente, trocam cétions © apresentam grupos iénicos negativos ligados & matriz (Figura V-4). 5 9 © a > & S e FIGURA V.3._Exquema de um trocadoraidnico. FIGURAV-4 _Exquema de um trocadoreattnico. (Osinal - representa 0 grupo trocador; 0 sinal +, 08 edions que so adsorvdos, O sinal + representa 0 grupo trocador Uigado a matrg; 0 sinal-, 0s dnions que so adsorvidos. 3.1. Trocadores inorginicos naturais Como citado anteriormente, os solos apresentam minerais que sao capazes de atuar como trocadores idnicos. Segundo KRESSMAN, o cétion do mineral ativo do solo possui uma camada de estrutura cristalina No grupo dos aluminio-silicatos, por exemplo, as camadas sao compostas de planos de étomos de aluminio esilicio, Muitos minerais possuem camadas cristalinas compostas de dois planos tetraédricos unidos em um ‘octaedro plano, ficando os fons trocaveis entre as camadas destes planos. Para ocorrer a troca inica em um mineral, a estrutura molecular precisa ser suficientemente aberta para permitir 0 acesso dos fons a serem trocados. O tipo de estrutura difere muito de um para outro tipo, mas estes trocadores, em geral, apresentam pequena capacidade de troca, S40 atacados por écidos ou por bases, sendo a propriedade de troca de fons afetada por valores de pH diferentes de 7,0. 3.2. Trocadores inorganicos sintéticos ‘Uma das primeiras tentativas de se obter trocadores sintéticos inorginicos coube a GANS, fundindo Virias outras sinteses alternativas foram tentadas com a finalidade de testar as propriedades do trocador, cuja principal limitagdo € a de apresentar baixa capacidade de troca, além de ter vazao lenta, causando problemas na regeneracio, Todavia, era insoldvel na Agua e resistente & desintegragao. Trocadores sintéticos podem ser preparados a partir de 6xido de metais do grupo IV, como. zircénio € 0 t6rio e de dcidos do grupo V e VI, sendo um exemplo o fosfato de zircdnio, Estes materiais apresentam a vantagem de serem muito estéveis a temperatura e & radiagéo nuclear. 6 3.3. Trocadores com mati orginica natural Certas substancias, como a 1d, 0 cabelo, 0 couro (proteinas), a celulose ¢ 0 agar (polissacarideo) ossuem propriedades trocadoras de capacidade muito baixa. As protetnas so constituidas de aminodcidos, que sio compostos anfoteros e, portanto, podem se ‘comportar como cétions ou anions, dependendo do pH a que estdo expostas. AA celulose, como agar, possui também propriedades trocadoras. Mediante tratamento quimico simples, em geral, sulfonacéo, pode-se obter materiais trocadores cati Drocessamento, os produtos obtidos sio heterogénias ¢ de pouco valor prético; a tentativa de se empregar © carvio como a matriz trocadora ilustra bem isso. icos. Todavia, com tal Em 1934, foi demostrado que certos carvées, sofrendo granulacao e posteriormente tratados com écido, sulférico, davam origem a trocadores catiGnicos que eram estéveis quimicamente ¢ fisicamente em meios 4cidos alcalinos. Nesta época, a descoberta representou considerével avango, desde que trocas envolvendo 08 fons hidrOnio puderam ser realizadas, até entao muito dificeis. Os grupos sulfénicos cram, em grande parte, responséveis pela troca de eétions, como também grupos carboxilicos produzidos simultancamente a reagio de oxidagio. O carvio submetido a este tratamento quimico foi usado para desmineralizar a gua 33.1. Os trocadores com matriz de celulose Acelulose é um biopolimero de 1c apresentando ligagées cruzadas de pontes de hidrogénio, tendo grupos hidroxflicos que sio facilmente oxidaveis a grupos carboxilcos, sendo esta a razo que capacita a celulose como trocador. Todavia, para efeito pratico a celulose precisa ser tratada quimicamente. Agentes ‘oxidantes transformam grupos hidroxflicos a carboxilicos de uma maneira homogénea, € a celulose, assim modificada, pode ser dtil como um trocador. Por tratamento quimico conveniente € possivel ligar a celulose a grupos trocadores catidnicos © aniénicos. Também, dependendo da finalidade, pode ser dado um baixo nivel de substituigio dos grupos hidroxila, visando uma baixa densidade de carga, que permite a eluicao de moléculas de policletrdlitos sob condigdes brandas, ou entéo, uma alta densidade mais apropriada para a cromatografia de pequenas ‘moléculas altamente carregadas. Noestado nativo, as cadeias polissacaridicas de celulose so unidas por ponte de hidrogénio formando regides microcristalinas, Interpostas estas regides existem outras amorfas, com um menor nimmero de pontes de hidrogénio. A hidrolise 4cida limitada produz uma perda preferencial da regido amorfa, esultando em celulose microcristalina No fim da década de 1970 foi colocado no mercado 0 DEAE-Sephacel, um trocador aniénico Preparado a partir de celulose microcristalina de alta pureza, previamente hidratada, com particulas esféricas, porosas, de didmetro variando de 40 - 160 1m, pronta para uso, apresentando ligagses cruzadas com epiclorohidrina, além das pontes de hidrogénio encontradas naturalmente na celulose, Os trocadores com matriz de celulose tém a vantagem de apresentar poros largos, facilitando assim 0 acesso das substncias aos grupos trocadores e permitindo boa qualidade de vazio da fase movel. n 3.3.2. Os trocadores com matriz de dextrano ‘Dextrano ¢ um biopolimero formado por unidades de glicose, unidas predominantemente por ligagies @-D (1-6) ¢ produzido pr bactrias TLeueonostoe misenteroides, Leuconostoc dextraniclum),tendo como substrato inicial a sacarose. Sob o nome comercial de Sephadex (Pharmacia) ¢ produzido um polimero modificado de dextrano, ‘onde as macromoléculas apresentam igagoes cruzadas de ponte de hidrogénio entre as suas cadeias, obtendo assim uma estrutura porosa tridimensional. Por causa do seu alto contetido de grupos hidroxflicos, 0 Sephadex € fortemente hidrofilico € as particulas esféricas, produzidas deste material, io capazes de inchar consideravelmente em contato coma ‘gua, sendo possivel formar virios tipos de poros conforme a sua capacidade de absorver gua. Por tratamento quimico adequado, é possivel ligar grupos trocadores as particulas esféricas de Sephadex. Os trocadores iénicos com matriz de Sephadex sao derivados do Sephadex G-25 e Sephadex G-50, sendo que estes dois tipos diferem entre si quanto & porosidade das particulas esféricas. 0s trocadores ibnicos bascados no Sephadex G-25 apresentam ligagdes cruzadas firmes, resultando em particulas de poros menores que aquelas com matriz de Sephadex G-50, que apresentam poros maiores, sendo estes, portanto, mais indicados para a cromatografia de substncias com massas moleculares elevadas (ver Capitulo V1). (OpHe a forcaidnica dos eluentes sio fatores que influenciam no grau de inchamento destes trocadores que, sendo esféricas ¢ altamente porosos, permitem boas condigées de vazio da fase mével. 333, Trocadores com matriz de agarose © agar 6 um polimero natural complexo extraido da alga Rhodophyciae. Ele ¢ formado por cadcias, polissacaridicas de agarose e agaropectina, Os grupos carregados presentesneste polissacarideo io 0 sulfato eo carboxflico. A agarose contém menor nimero de grupos sulfatos, em relagao & agaropectina, sendo por isso menos carregada. A agarose foi introduzida por POLSON como um gel para cromatografia por exclusio. PORATH € col. prepararam um gel de agarose, live de sulfato, com ligagbes cruzadas de bis-epoxi ou epicloridrina. Este tatamento resultou em um gel mais insoldvel e com ligagdes cruzadas mais homogéneas. Como exemplos de trocadores que utilizam a agarose como matriz, podemos citar a DEAE-Sepharose CL-6B (anidnica) ¢ a CM-Sepharose CL-6B (catiénica). Estes trocadores apresentam uma matriz de grande rigidez, aliada a uma porosidade equivalente Aquelas com matriz de dextrano modificado, tendo ainda boas qualidades de vazao da fase mével. 3.4. Os trocadores organicos sintéticos Em 1935, ADAMS ¢ HOLMES desenvolveram resinas i / " , resinas com propriedades trocadoras ¢ bastant insolveis. Estas resinas foram obtidas por condensagio de fenbis poifdrieos com formaldeides-O teabalhy destas pesquisas dev infcio a uma fase tecnolégica de grande amplitude, possibilitando a produgio 4: matrizes, de varios graus de porosidade, trocadoras de cétions ¢ de anions. (evegen Otrabalho pioneirode ADAMS e HOLMES produziu resinas trocador i ras d in Fu Nn p TUT as de cétions. A estrutura tipica on oH oH on cH, “Cy CHa: He ‘cH,OH CH on He on on on on FIGURA V5 Estruturatipca dae resinas desenvolvidas por ADAMS e HOLMES, por condensacto de fendis com formaldefGo. © grupo responsével pela troca idnica 6 0-OH, que funciona como indica a equagéo, em meio écido e neutro. Resina OH + NaCl == Resina-ONa + HCL «com maior eficiéncia, em valores de pH mais altos: Resina OH + NaOH =< Resina-ONa + HzO ‘Todavia, tas resinas apresentavam pequena capacidade de troca, pelo fato da baixa tendéncia do H* de desligar do grupo OH. Para aumentar a capacidade de troca destas resinas foram introduzidos grupos ‘sulfonicos, em ataques a determinados sitios nos anéis arométicos. A estrutura molecular tipica destas resinas 6 apresentada na Figura V-6. S034 SO3H oH on —cH, CH CH,” cHy ‘CH,OH on on Hy CHe on on CH chy chy on oH S054 SO5H FIGURAV-6 _Estrutura tiica das resnassulfonadas, produridas pela condensacSo de fenbis com formaldeido. Desta man a resina passou a ser multifuncional com grupos trocadores sulfénicos ¢ hidroxilicos, sendo que, em condigbes dcidas e ncutras, somente 0 primeiro apresenta efetiva capacidade de troca; em meio basico, os grupos OH contribuem também na troca de cétions. ‘Um notével avango nas resinas trocadoras ocorreuem 1942, quando D'ALELIO sintetizou resinascom base no estireno eruzado com diviilbenzeno, abtendo pequenos grinulos. As resinas trocadoras écidas (catiénicas) foram preparadas por sulfonagao do anel benznico com Scidos sulférico concentrado ou com 9 &cido clorosulfénico. Elas tm maior quantidade de grupos sulfénicos, em coimparagio aos citados anteriormente (Figura V-6) ¢, em conseqiacia, maior capacidade de troca. ‘A Figura V-7 nos mostra o esquema do preparo destasresinas. As unidades divnilbenzeno estabelecem €s com outras cadeias. O grau de ligacdes cruzadas (porosidade) ¢ dado pela quantidade de divinilbenzeno presente na mistura polimerizante, sendo que porcentagenstipicas so de 1,2, 4 8, 2 16 A porosidade é selecionada conforme o propésito a que se destina, sendo comumente designada por X-1, X-2, X-12, ete,, onde 0 ntimero indica a porcentagem em divnilbenzeno no polimero. As resinas de troca basica (anidnicas)sio preparadas por clorometilagio seguida por uma reagio com ‘uma amina terciéria ou outro reativo apropriado. A estrutura deste tipo de trocador pode ser imaginada com base na Figura V-7, substituindo-se grupos sulfonicos (-SO"s H* ) por -CH2-N*R3 com OH" ou Cl’ ‘Além das resinas poliestuénicas e polifendlicas, outras sio obtidas usando o metacrilato como matéria bsica de construgio. [As resinas trocadoras deste tipo sio muito resistentes, tém grande estabilidade quimica, sio monofuncionais, tendo alta capacidade de troca em toda faixa de pH. Hcy GHC OH Cy CH= O07 POLIESTIRENO LINEAR i A i sy areal ae x oe a POLIESTIRENO com Lisacio cRUZADA CH=CH, cc, OH CH Soy = cH—cH,—CH™-CH,—CH—CH, CH=CH, L 2%. 2 CH=CH, CH CH, CH—CH,—CH Hy C26 cH ~cH- FIGURA V.7_Polimerizagho ¢ sulfonacHo das resinas com base no estireno-di 3.5. Matrizes utilizadas em cromatografia liquida de alta eficiéncia As resinas de estireno-divinilbenzeno foram pioneiramente utilizadas para a produgao de particulas trocadoras (de aproximadamente 10 um) para cromatografia por troca inica de alta eficiéncia. Estas particulas trocadoras tém sido muito usadas, No entanto, apresentam a desvantagem de ter baixa rigidez & deformagio por pressio e por dificultar a difusio das moléculas da substancia-amostra para 0 interior do trocador. O resultado, utilizando este tipo de matriz, é uma coluna de menor eficiéncia, comparada com outras onde estes problemas sio contornados. Devido a isto, outros tipos de particulas trocadoras foram idealizadas por serem mais adequadas & cromatografia liquida de alta eficiéncia, Estas particulas sao constitufdas de um suporte rigido que 6 revestido com um polimero de estireno-diviilbenzeno, silicone ou fluorearbono ¢ derivatizado com grupos trocadores sulfénico ou aménio quaternério, Dependendo do tipo de suporte empregado, estas particulas sio chamadas peliculares, com nicleo s6lido de silica ou porosas. Estes suportes ficam recobertos com uma fina camada do material trocador e, assim constitufdos, so muito resistentes & deformagao por presséo, facilitando a difusdo das moléculas para o interior da pelicula de revestimento. Isto resulta em um aumento na eficiéncia da coluna comparada aquelas formadas unicamente por polimeros. No entanto, estes contém uma menor quantidade do material trocador, com menor capacidade que os baseados nas resinas. 3.6. Trocadores idnicos Ifquidos nica pode também ser realizada por trocadores I idos, que revestem A separagio por troca suportes peliculares ou porosos. Eles sio constituidos, em geral, de liquidos organicos, imiscfveis em 4gua, que apresentam grupos idnicos ou ionizaveis. ‘Assim, o suporte inerte fica revestido por um filme liquido, Para os trocadores catidnicos so usados alquilésteres do Acido fosfbrico e/ou alquilésteres do Acido alcano-fosfénico. Os trocadores liquidos anidnicos utilizam aminas de alta massa molecular ou compostos de aménio quaternério (por ex. trioctilmetilaménio). 4, OS GRUPOS TROCADORES 0s tipos de grupos ligados a matriz classificam os trocadores iénicos em fortes, médios ¢ fracos. Os trocadores idnicos fortes so aqueles completamente ionizados em grande faixa de pH. A Figura V-8 esquematiza as curvas tipicas de trocadores Acido e basico fortes. Os trocadores idnicos fracos ¢ médios io aqueles em que o grau de dissociagio € influenciado pelo pH, sendo que, devido a este fato, a capacidade destes trocadores varia em fungao do pH. Na Figura V-9 temos as curvastipicas de trocadores écido e bésico fortes. a1 FIGURA V8 FIGURA V9 CAPACIDADE CCapacidades tipcas de trocadores (—)écidoe bésco (~~) fortes. CAPACIDADE Capacidades ipicas de trocadores de Sido (} e bésico (~~) facos, 82. is acl Nos Tablas 71 « 12 tomes explo de alge ios de tocadres ics comers send clsieadsquato fog do grap trocar. Taba Exemplos de alguns tipos de trocadores baseados em polfmeros sintéticos hail ‘Constinuigto ‘Formula dos “Marcas reglstradas de trocadores equivalentes® cman iam Geaaee faa ESS = ete reel eC t oe Aste emaiieatin stenont fas pre tems See ot er a a s sm te sate Sepeotgen scnptonst Ke ome mk ime aah os a £ 2 i er cee sec nr ctpea ene ecm ct att ee snes see ert erties = Eieemeee noi Tava Sxempls de alguns ies de tredoresbaseads em pliers natura i Te de Denis exes tempo Faont Race ite eon season = he kane oh ca cinconie Dane ign tee sme ot engtne, HUNTED eget we a = ears Se Semen cr etn totes cine AE ent «REACT eats i Se Rcer Ear semun nemanm —ON'GHENOO came 3 PROPRIEDADES DE TROCADORES IONICOS 5.1. Capacidade De uma mancira geral, a capacidade de um trocador é uma medida da quantidade de troca de fons que pode ocorrer entre a matriz.¢ 0s fons presentes na fase movel. ‘A capacidade total é a quantidade de grupos carregados, ou potencialmente carregados, que podem ser trocados por grama de peso seco do trocador. A capacidadc total € expressa em meq/g ou meq/100 mi, de supensio da resina, sendo determinada por titulagéo. A capacidade disponivel € a capacidade real do trocador sob determinadas condigées. Ela ret > APY > Balt > poet > sePt > Cart > Cot > NI > Cut > Zn > Mgt > Mn?* > Agt > Cet > Be?* >Rbt > Cat > NH} > KY >Nat> Ht > Lit > He* E para anions, a seguinte order S03 > CrO# > citrato® > tartarato® > NOs > AsOy > POY > MoO} > acetato” > T > Br > Cl > OH >F Todavia, em altas concentragSes a ordem de afinidade pode ser bem diferente, sendo 0 efeito da valencia diminuido, as vezes a6 invertido. O mesmo fendmeno pode ser produzido por temperaturasaltas ou por mudanga da fase mével. la seletividade de um trocador consideraremos 0 equilibrio: Para uma medida quanti Mt + RH = HY + RM onde R-H € 0 trocador protonado ¢ R-M o trocador ligado ao fon M . Nesta situagio, pode-se escrever: alt x aRM aM? x aR-H onde a ¢atividade das formas indicadas e Kp 0 coeficiente de distribuigéo, Kp Em geral, quanto mais alto 0 valor do coeficiente de distribuigo mais fortemente o fon interage com otrocador. O coeficiente de distribuigdo ¢ uma fungo de muitos pardmetros experimentais como pH, carga, ibnica, porosidade do trocador, forgaidnica, tipo de solvente utilizado e temperatura. Asidéias aqui expostas servem apenas como guia para iniciar as operagées de uma coluna trocadora de fons. Em resumo, 0 trocador ‘idnico prefere: os fons que tém alta carga; 'b. os fons que tém pequeno tamanho (solvatado); fons altamente polarizsveis; 4. fons que tém fracas interagées com a fase mével. 85 6. FATORES QUE INFLUENCIAM A CROMATOGRAFIA POR TROCA IONICA 6.1. A escolha do trocador iénico Acescolha de um trocador idnico deve ser orientada em funcdo da finalidade a que se destina. As colunas cromatogréficas utilizadas em técnicas preparativas apresentam maior secgao transversal que aquelas utilizadas em técnicas analiticas. Além disso, em geral, os trocadores iénicos usados em cromatografia preparativa apresentam poros maiores, com particulas trocadoras também maiores (150 - 300m), que facilitam a vazdo, tendo, portanto, grande capacidade. Ostrocadore nicos utilizados em cromatografia analitica, em geral, apresentam poros menores com particulas trocadoras menores (40 - 75 um) tendo, em geral, menor capacidade mas alta resolugio. A utilizagéo de colunas com pequena secgéo transversal implica em picos mais altos mais estreitos, aumentando a sensibilidade de forma independente do método de detecsio utilizado, causando, no entanto, maior resisténcia a vazio. ‘A porosidade de um trocador inico nio altera o mecanismo de ligago dos fons presentes na fase mével, mas influencia na sua capacidade, pois impede o acesso de moléculas maiores a grupos trocadores ‘805 poros interiores da matriz. Conhecendo-se 0 material a ser separado, com finalidade analitica ou preparativa, escolhe-se 0 trocador conveniente (aniénico ou catidnico) com base nas suas propriedades dcido-bases. 6.2. A selegao da fase mével ‘A fase mével pode ser consttuida por solugdes dcidas, bisicas ou ainda por solugdes tampées. Nestas, podem ser adicionados sais neutros ou solventes organicos, com a finalidade de se aumentar a seletividade para determinado propésito. ‘Quando a fase mével é uma solugao tampéo, sua escolha ¢ fungo do valor em que se pretende manter co pH. A faixa de boa capacidade tamponante esté a0 redor do pKa ( +1) do 4cido conjugado empregado no preparo do tampao. Na literatura encontram-se vérios tampées utilizados em cromatografia por troca sendo 0s mais comuns 0 fosfato, 0 borato, o Tris (Tri-hidroximetilaminometano), 0 citrato ¢ o acetato. Em aplicagoes preparativas em que nao se deseja obter residuos salinos utiliza-se os tampées voléteis, como 0 acetato de piridina. A concentragio dos tampoes geralmente utilizados em cromatografia por troca iénica est4 na faixa de 1x 10° M a 5x 10°" M, no entanto concentragées maiores também podem ser usadas. A adigdo de sais neutros, como 0 cloreto de s6dio no tampio de eluigdo, aumenta a forga iénica da fase mével ¢, assim, se tem uma outra varidvel para modificar a afinidade do trocador idnico pelos materiais —y ? ‘usados como amostra; a diminuigdo de 2a 3°C na temperatura causa um apreciével aumento no pH. Além disso, as macromoléculas podem sofreralterages considerdveis na sua conformagao na faixa de temperatura 45-50°C, implicando em alteragées no comportamento cromatogréfico. Para propésitos bioquimicos preparativos, a cromatografia € frequentemente realizada a baixa temperatura (ao redor de 4*C) para prevenir a desnaturagao de macromoléculas termolAbeis como as Protefnas. Neste caso, otratamento prévio do trocadoriénico, a montagem da coluna, bem como a regulacdo 3 =x a _ - —- VOLUME DE ELuIcao (mt) HIGURAV.12 _Aparethos simples para 9 producto de gradients lineares, cOncavos converos. Noreservatrio 2 dos aparelhos ahomogenizacio da mistura de dos tampoes de diferentes pls ov de mesmo pil temosa presence de agitador «Foxe inicaalerente ‘A forma do gradiente também varia em fungao do volume de tampao eluente utilizado. O aumento de volume leva a uma diminuigdo da inclinagio da curva do gradiente, 0 que resulla em um aumento na resolugio Figura V-13 ilustra este fato, uilizando um gradiente linear a um determinado volume, a0 dobro deste volume e a0 quadruplo do primeiro volume (por ex. 100 mL, 200 mL. e 400 ml.) 80 100 8 « 50 A er X (mu S a Goo a ° 2 04 — nh 2x(mU) < = Zoo a a 4x(mb = 50 9 b+ 7 2y 3y sy loy CONCENTRAGAO SALINA NO EFLUNTE FIGURA V.13 _Ffeitodo volume dos tamptes de um gradient linear na resolucio. Ae Nstosubstanciasaserem separadas Sendo {que A responde & modanga de inclnacio do gradient, ¥ € concentrag30 do tampo no reservatério Te 10Y €2 concentra n0 ampo no reseratério 2 APLICACOES, ‘A cromatografia por troca iénica apresenta muitas aplicagoes analiticas © preparativas, tanto em pesquisa, como nas indistrias. A desionizagao da gua e de muitos licores agucarados de frutos, bem como a despigmentagao destes s mais rotineiras da cromatografia por troca inica, sendo produzidas resinas especificas sio as aplicag( para tais finalidades. Em quimica analitica este tipo de cromatografia € usado na anélise de elementos, geralmente complexados, na andlise de fons ou na sua eliminagdo quando estes interferem na dosagem de uma

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