AVALIAÇÃO NUTRICIONAL DE PROTEÍNAS DO
GRÃO-DE-BICO (Cicer arietinum L.) POR MÉTODO
QUÍMICO E MICROBIOLÓGICO*
RESUMO: Um método microbiológio para determinação
do valor nutricional relativo (VNR) de proteínas de
alimentos, utilizando o Enteroccocus zymogenes, foi
estudado com relação a sua factibilidade e sensibilidade
em detectar diferenças na qualidade nutricional de
proteínas de grão-de-bico e o efeito do tratamento
térmico nestas. Neste trabalho também foi avaliada a
possível correlação entre os resultados do método
microbiológico e aqueles determinados pelo do Cômputo
de Aminoácidos Corrigido pela Digestibilidade Protéica
(CACDP). O método microbiológico mostrou-se
eficiente em distinguir entre os diferentes aspectos
nutricionais das frações protéicas do grão-de-bico, e foi
sensível aos efeitos do tratamento térmico. Uma
correlação positiva significativa entre os métodos
testados foi encontrada (R=0,8142). Os resultados
encontrados para o método do E. zymogenes corroboram
seus aspectos de rapidez e simplicidade.
PALAVRAS-CHAVE: Grão-de-bico; Enteroccocus zy-
mogenes; avaliação nutricional; digestibilidade de
proteínas; cômputo químico.
Introdução
Os métodos de avaliação da qualidade nutricional
de proteínas que se utilizam de modelos animais, como ratos
ou porcos, em substituição a seres humanos, nem sempre
podem se tornar rotina, considerando-se as instalações
físicas exigidas, grandes quantidades de amostras, tempo
necessário, custos, além das questões bioéticas, em que toma
importância a discussão da substituição do uso de animais.
Nesse sentido, novos métodos são propostos e estudados,
buscando a maior correlação com a situação real para
humanos, pela medida de um ou mais dos principais
parâmetros que determinam a qualidade de uma proteína,
a saber, a quantidade de aminoácidos essenciais, a
digestibilidade protéica e a biodisponibilidade de seus
aminoácidos7,10. Para atender as necessidades da dinâmica
*Trabalho realizado com auxílio financeiro do PADC-FCF-UNESP.
**Departamento de Alimentos e Nutrição-Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara-UNESP-14801-902-Araraquara-SP-Brasil
Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.17-22, 2004
Olga Luisa TAVANO**
Sinézio Inácio da SILVA JÚNIOR**
Aureluce DEMONTE**
Valdir Augusto NEVES**
industrial, o método deve ser capaz de avaliar os efeitos dos
diferentes processamentos sofridos pelos produtos
alimentícios sobre suas características nutricionais,
oferecendo ao mesmo tempo, rapidez de resposta e baixo
custo.
Ford6 propôs um método baseado na resposta de
crescimento de Enterococcus zymogenes frente à qualidade
da amostra de proteínas. A resposta está relacionada com
as necessidades de aminoácidos para crescimento desse
microrganismo, que apresenta como essenciais um conjunto
de aminoácidos muito semelhante ao descrito para seres
humanos. No entanto, suas necessidades absolutas são:
valina, metionina, isoleucina, leucina, arginina, histidina,
triptofano e ácido glutâmico. Dessa maneira, a lisina,
também considerada um dos aminoácidos essenciais para
os seres humanos, não é considerada de necessidade
absoluta, embora sua ausência prejudique o crescimento do
microrganismo6. Quando comparado a outros métodos in
vivo, suas principais vantagens são: a pequena quantidade
de amostra necessária, sua simplicidade e rapidez de
resposta.
O método do CACDP (Cômputo de Aminoácidos
Corrigido pela Digestibilidade Protéica) foi primeiramente
recomendado pela FAO/WHO, em 1989, como alternativa
ao PER (Protein Efficiency Ratio)11, tomando como base o
computo químico de aminoácidos da proteína avaliada e
sua digestibilidade verdadeira, determinada através de
ensaios in vivo, com ratos. Porém, trabalhos recentes já
apresentam resultados de CACDP em que a digestibilidade
protéica in vitro é utilizada para tal correção, tornando o
método mais simples e de mais rápida realização. Neste
trabalho foram utilizados resultados de digestibilidade in
vitro das amostras de grão-de-bico para determinação do
CACDP.
Os objetivos deste trabalho foram: verificar a resposta
do método microbiológico na avaliação da qualidade
nutricional de amostras de proteínas de grão-de-bico, bem
como sua sensibilidade aos efeitos do tratamento térmico.
Também foi verificado a possível correlação entre os resultados
do método microbiológico e do Cômputo de Aminoácidos
25
Corrigido pela Digestibilidade Protéica (CACDP).
Material e métodos
Material
Foram utilizadas sementes de grão-de-bico (Cicer
arietinum L.), variedade IAC-Marrocos, provenientes do
Instituto Agronômico de Campinas, Campinas, S.P. As
enzimas pepsina e pancreatina, pronase, componentes do
tampão glicerofosfato foram obtidas da Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO. A cepa de Enterococcus zymogenes
(NCDO 592) foi obtida do “American Type Culture
Collection”, Rockville, USA. Todos os outros reagentes
foram de grau analítico.
Métodos
Preparo da farinha
As sementes foram maceradas em água destilada
(4°C/12 h) e manualmente descorticadas. Os cotilédones
foram secos em estufa com circulação forçada de ar (40 C),
moídos e tamisados até passagem em peneira de granulação
de 60 mesh. A farinha obtida foi desengordurada utilizando-
se n-hexano, sendo então utilizada para os diferentes estudos
e extrações de proteínas.
Isolamento das frações protéicas
O isolamento das frações protéicas do grão-de-bico
foi realizado com base nas diferenças de solubilidade entre
proteínas em soluções extratoras diversas. A extração das
frações protéicas, albumina, globulina total e glutelina, foi
realizada com base no descrito por Sathe & Salunkhe12. A
farinha descorticada e desengordurada foi dispersa em NaCl
0,5 M (1:10 m/v) e após agitação (1h/ 4°C) e centrifugação
(9000g x 60min) o sobrenadante, contendo a fração solúvel
em sal, reservado. A fração prolamina foi extraída do resíduo
remanescente em etanol 70%, e a fração glutelina extraída
na seqüência utilizando-se solução de NaOH 0,1N. As
proteínas solúveis em sal foram separadas em albuminas e
globulinas por diálise contra água destilada (24h a 4°C) e
centrifugação (9000g x 60 min), onde as globulinas foram
recuperadas na forma de precipitado. As frações obtidas
foram congeladas (-20°C) e liofilizadas.
A globulina principal (11S) foi separada da globulina
total como descrito por Kumar & Venkataraman9. Uma
alíquota da globulina total foi suspensa em NaCl 10% (1:20
m/v) e esta solução diluída 10 vezes com água destilada.
Após centrifugação (5000g x 30min) o precipitado foi
novamente suspenso em NaCl 10% e esta suspensão diluída
20 vezes com água destilada, seguido de centrifugação. O
precipitado obtido contendo a globulina principal foi
removido com água destilada, congelado (- 20°C) e
liofilizado.
26
Determinação de proteínas
Os teores de proteínas foram determinados pelo
método de Kjeldahl2 utilizando-se os fatores 6,25 e 6,38,
para conversão dos teores de nitrogênio em proteínas,
respectivamente para as proteínas do grão-de-bico e caseína
.
Tratamento térmico
Parte da farinha e frações protéicas foram submetidas
a tratamento térmico em autoclave (121°C/15 min), em
presença de água destilada (proporção de 1:6 m/v),
imediatamente resfriada, novamente liofilizada e tamisada
até passagem em peneira de 60 mesh.
Determinação do valor protéico pelo método
microbiológico
As amostras foram previamente hidrolisadas com
uso de pronase (1:25, enzima:substrato) em tampão -
glicerofosfato de sódio, pH 8,0, 48ºC/3 h, sob agitação. Após
ajuste de pH para 7,2 e esterilização a frio por ultrafiltração,
foram ensaiadas em quadruplicata, com base no descrito
por Ford6, pela inoculação de cultura de Enterococcus
zymogenes em meio contendo todos os nutrientes necessários
para seu crescimento excetuando-se os aminoácidos,
provenientes da proteína teste. A cultura foi incubada por
48 horas a 37°C. Ao final do período as amostras foram
esterilizadas em autoclave (121°C/15 min) e as medidas de
crescimento realizadas por acidimetria, titulando-se o
conteúdo de cada tubo com NaOH 0,1N até pH 7,2. Os
resultados das médias dos volumes gastos na titulação,
subtraído o volume do branco de cada amostra (com inóculo
inativo), foram utilizados para expressão do valor nutritivo
relativo (VNR) das amostras como percentuais do valor
encontrado para a caseína (Sigma C-7078).
Determinação da digestibilidade in vitro
A determinação da digestibilidade protéica in vitro
foi realizada através da medida do percentual de hidrólise
de cada amostra após tratamento com seqüência de enzimas
pepsina e pancreatina, como descrito por Akeson &
Stahman1. Os percentuais de hidrólise foram calculados pela
quantificação dos grupamentos amino liberados por reação
com reagente OPA (ortoftaldialdeído), conforme descrito
por Church et al4. Uma curva analítica do aminoácido L-
leucina foi utilizada como referência.
Determinação do perfil de aminoácidos
A análise das amostras foi efetuada após hidrólise a
110°C/22 horas em HCl 6N a vácuo. A separação foi
realizada em coluna de troca iônica, seguida de reação pós-
coluna com ninidrina em analisador de aminoácidos da
marca Dionex (DIONEX Ion chromatography, Model DX-
300, Dionex Corporation, USA). A determinação de
Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.17-22, 2004
triptofano foi realizada após hidrólise enzimática com
pronase e reação colorimétrica com p-dimetil amino
benzaldeído (DAB), segundo Spies13.
Cálculo do cômputo de aminoácidos corrigido pela
digestibilidade
O cômputo dos aminoácidos corrigido pela
digestibilidade foi calculado considerando-se os aminogramas
das amostras, como descrito por Sarwar & McDonough11,
corrigidos pelos valores de digestibilidade in vitro.
Resultados e discussão
A farinha descorticada e desengordurada de grão-
de-bico apresentou 25,01% de proteína, sendo suas
principais frações constituintes: a globulina total,
representando cerca de 47,85% da proteína total, seguida
pela fração albumina (18,63%) e fração glutelina (10,02%).
A globulina 11S, globulina majoritária no grão-de-bico,
representou 42,52 % da globulina total. A fração prolamina,
que representou apenas 0,17% da proteína total da farinha,
não foi utilizada nos demais ensaios realizados.
Na Tabela 1 foram reunidos os cômputos de
aminoácidos das proteínas de grão-de-bico e da caseína,
além das recomendações da FAO/WHO8 para humanos na
idade pré-escolar e adulta. Em uma análise geral, destacam-
se as albuminas e as glutelinas, apresentando melhores perfis
de aminoácidos. As globulinas (total e principal) foram as
frações mais deficientes em aminoácidos essenciais, com
quantidades de metionina, triptofano e treonina para
globulina total e principal, e valina no caso da globulina
principal, inferior ao recomendado (Tabela 1).
Apesar dos teores de sulfurados terem apresentado
valores baixos, 78% da recomendação da FAO/WHO, o
primeiro limitante na proteína total da farinha de grão-de-
bico foi o triptofano, com percentual inferior ao
recomendado (56,4%). O restante dos aminoácidos da
farinha apresentou teores superiores às recomendações.
De acordo com os dados de digestibilidade in vitro
(Tabela 2) pode-se verificar a mesma tendência detectada
pelo método microbiológico (Tabela 4) quanto ao efeito do
aquecimento sobre as amostras. Esse tratamento mostrou-
se benéfico em relação a maioria das proteínas, excetuando-
se, a glutelina, onde podemos perceber um prejuízo nos
valores relativos à amostra aquecida.
A redução na digestibilidade da glutelina após seu
aquecimento reflete-se no cálculo do cômputo de
aminoácidos corrigido pela digestibilidade (Tabela 3) que
passa de 41,66 para 27,35.

Tabela 1 - Composição de aminoácidos essenciais (mg/100 mg proteína) de proteínas de grão-de-bico (Cicer arietinum
L.) var IAC - Marrocos, caseína e comparação com os padrões da FAO/WHO.

Padrões FAO/WHO
Cômputo de Aminoácidos

Pré-
Aminoácido Adultos Globulina Globulina
escolares Farinha Albumina Glutelina Caseína
Total Principal
TRE 3,4 0,9 3,93 5,21 2,95 2,88 4,35 3,8
(115%) (153%) (86,8%) (84,7%) (128%) (112%)
VAL 3,5 1,3 4,06 4,55 2,95 4,15 5,05 5,5
(116%) (130%) (84,3%) (119%) (144%) (157%)
MET + 2,5 1,7 1,95 4,75 0,99 0,87 1,87 3,5
CIS (78,0%) (190%) (39,6%) (34,8%) (74,8%) (140%)

ILE 2,8 1,3 3,83 4,27 4,05 4,06 4,52 4,4

(137%) (152%) (145%) (145%) (161%) (157%)
LEU 6,6 1,9 7,73 7,18 7,81 7,60 7,68 7,6
(117%) (109%) (118%) (115%) (116%) (115%)
TIR + 6,3 1,9 9,0 7,71 9,64 9,32 9,18 7,0
FEN (143%) (122%) (153%) (148%) (146%) (111%)

LIS 5,8 1,6 7,31 9,33 6,61 6,52 7,89 6,8

(126%) (161%) (114%) (112%) (136%) (117%)
HIS 1,9 1,6 2,86 3,02 3,08 2,97 2,99 2,5
(150%) (159%) (162%) (156%) (157%) (131%)
TRP 1,1 0,5 0,62 0,70 0,78 0,80 1,09 1,0
(56,4%) (63,6%) (70,9%) (72,7%) (99,1%) (90,9%)
Os resultados entre parênteses representam o computo químico, percentuais relativos de cada aminoácido ao valor de referência da
FAO/WHO8 para pré-escolares.
Valores sublinhados representam o primeiro limitante da amostra.
*Valores para caseína Sigma C-7078 obtidos através de informações do fornecedor.

Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.17-22, 2004 27

 Tabela 2 - Digestibilidade in vitro de proteínas de grão-de-bico, após hidrólise com seqüência
de enzimas pepsina-pancreatina, antes e após tratamento térmico (121°C/15 min).

Digestibilidade in vitro
Amostra
% de hidrólise % relativo à caseína
a
Caseína C-7078 65,99 2,90 100

Farinha crua 42,20b 1,19 63,95ae 1,80

Farinha aquecida 53,00cde 4,76 80,31bcf 7,22

Albumina crua 40,10b 0,88 60,77a 1,34

Albumina aquecida 51,01c 0,47 77,31b 0,71

Globulina Total crua 47,51d 1,33 72,98c 2,02

Globulina Total aquecida 68,49a 2,04 103,79d 3,10

Globulina Principal crua 48,16cd 3,43 72,98bce 5,20

Globulina Principal aquecida 61,53e 3,91 93,25f 5,93

Glutelina crua 55,70ce 5,07 84,41bf 7,68

Glutelina aquecida 36,56b 3,84 55,40a 5,81
Resultados representam médias desvio padrão, de três determinações.
Valores em mesma coluna contendo letras iguais sobrescritas não apresentam diferenças significativas (p<0,05).

Tabela 3 - Cômputo Químico de Aminoácidos Corrigido pela Digestibilidade Protéica in

vitro, de amostras de grão-de-bico.
Cômputo de Aminoácidos Corrigido pela
Amostras Digestibilidade Protéica (CACDP)
% Caseina :
a
Caseína C-7078 54.98 2.63 100 %

Farinha crua 23.80b 0.67 39.68%a 1.12

Farinha aquecida 29.89cf 2.69 49.83%be 4.48

Albumina crua 25.50d 0.56 42.52%c 0.94

Albumina aquecida 32.44c 0.30 54.08%b 0.50

Globulina Total crua 18.81e 0.53 31.36%d 0.88

Globulina Total aquecida 27.12f 0.81 45.21%e 1.35

Globulina Principal crua 16.75g 1.19 27.94%f 1.99

Globulina Principal aquecida 21.41h 1.36 35.70%g 2.27

Glutelina crua 41.66i 3.79 69.46%h 6.32

Glutelina aquecida 27.35bdf 2.87 45.59%ace 4.78
Resultados representam médias desvio padrão, de três determinações.
Valores em mesma coluna contendo letras iguais sobrescritas não apresentam diferenças significativas (p<0,05).

Alguns trabalhos demonstram que o aquecimento
não causa prejuízos significativos na composição de
aminoácidos do grão-de-bico 3,5, e com base em tais
constatações os valores relativos às análises de aminoácidos
das amostras cruas foram utilizados também para as
amostras aquecidas, nos cálculos do cômputo de
aminoácidos. No entanto, no caso da glutelina o
aquecimento pode ter afetado alguns aminoácidos, como
sugerem os resultados obtidos de digestibilidade in vitro
(Tabela 2) e pelo método microbiológico (Tabela 4).
Os dados referentes à avaliação nutricional, pelo
método microbiológico, das proteínas da farinha e frações
protéicas isoladas estão expressos na Tabela 4, como
percentuais relativos ao resultado obtido para a caseína.

28 Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.17-22, 2004

Tabela 4 - Valor Nutricional Relativo (VNR), calculado
com utilização de E. zymogenes, de amostras
de proteínas de grão-de-bico antes e após
tratamento térmico (121°C/15 min).
Amostras VNR (% )*
Farinha crua 69,87a 2,78
Farinha aquecida 93,94bc 6,96
Albumina crua 87.98b 0.43
Albumina aquecida 98.48c 0.49
Globulina Total crua 42.88d 0.88
Globulina Total aquecida 85.33be 3.72
Globulina Principal crua 43.15d 6.57
Globulina Principal aquecida 83.23e 1.51
Glutelina crua 100.03c 1.45
Glutelina aquecida 69.18a 1.18
Valores na coluna com letras sobrescritas iguais não apresentam diferenças
significativas entre si (p 0,05). Os resultados representam médias desvio
padrão de quatro determinações.
* caseína = 100%
Podemos observar que o método microbiológico
mostrou-se sensível em diferenciar significativamente o
valor nutricional relativo (VNR) das amostras de proteínas
do grão-de-bico (Tabela 4). O método também foi capaz de
detectar alterações provocadas pelo tratamento térmico
(121°C/15 min) sobre tais proteínas, refletindo tanto as
melhorias quanto os prejuízos nutricionais, ou seja, foi
possível observar um aumento do VNR para as amostras de
farinha, albumina e globulinas após aquecimento, assim
como o prejuízo na qualidade da amostra de glutelina
quando aquecida, conforme já mencionado.
A farinha aquecida de grão-de-bico apresentou alto
valor nutricional em relação à caseína. Entre as amostras
não aquecidas os maiores resultados foram encontrados para
a fração glutelina (100% em relação à caseína) enquanto
que as globulinas apresentaram os valores mais baixos,
sendo 42,88% para globulina total e 43,15% para globulina
principal.
Quanto ao efeito do tratamento térmico, embora as
amostras de farinha e albumina tenham apresentado os
maiores resultados para o VNR (Tabela 4), as maiores
alterações foram notadas para as amostras de globulina total
e principal, já que o aquecimento resultou em acréscimo de
99% e 93% em seus percentuais de VNR, respectivamente,
em comparação a suas amostras não aquecidas.
Considerando-se os cálculos em percentuais relativos
à caseína, uma boa correlação entre os resultados do cômputo
de aminoácidos corrigido pela digestibilidade (Tabela 3) e
do método microbiológico (Tabela 4), foi encontrada (R =
0,8142), evidenciando comportamento semelhante dos
métodos para amostras de proteínas de grão-de-bico.
Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.17-22, 2004
No entanto, o método microbiológico registrou
valores absolutos superiores para todas as amostras. Este
fato pode, possivelmente, advir de uma diferença
quantitativa da necessidade de aminoácidos relativa do
microrganismo e daquela referente às recomendações da
FAO/WHO para pré-escolares, adotada para os cálculos do
CACDP. Isto sugere que para tal faixa etária os resultados
do VNR poderiam estar superestimados. Isso pode ser
observado no alto valor de VNR obtido para a glutelina
crua em contraposição aos teores de aminoácidos sulfurados
e da digestibilidade in vitro.
Por outro lado, observa-se uma melhor adequação
dos resultados do método microbiólogico às recomendações
de aminoácidos para adultos (Tabela 2), o que leva a supor
que esse método teria uma utilização mais adequada quando
o consumo do produto protéico por seres humanos adultos
estivesse em questão.
Conclusões
O método microbiológico (VNR) mostrou-se
eficiente na avaliação das amostras de proteínas de grão-
de-bico, apresentando-se capaz de detectar as alterações
sofridas pelas proteínas após tratamento térmico. O método
mostrou-se sensível às alterações relativas à melhoria da
digestibilidade protéica ou os prejuízos sofridos pelas
modificações de aminoácidos, ou seja, aquelas relacionadas
à disponibilidade de aminoácidos. Também apresentou uma
boa correlação com o CACDP (R = 0,8142), o que lhe
confere confiabilidade, muito embora os resultados tenham
indicado melhor adequação às recomendações de
aminoácidos para adultos. Acrescente-se a isso a
confirmação dos aspectos de rapidez e grande simplicidade.
Agradecimentos
A Drª Vera S. Baldini do Instituto de Tecnologia de
Alimentos de Campinas (ITAL) pelas análises de
aminoácidos.
TAVANO, O.L.; SILVA JÚNIOR, S.I.; DEMONTE, A.;
NEVES, V. A. Nutritional evaluation of chickpea protein:
microbiological and chemical methods. Alim. Nutr.,
Araraquara, v.15, n.1, p. 17-22, 2004.
ABSTRACT: A microbiological method to measure the
relative nutritional value (RNV) of protein foods, using
Enteroccocus zymogenes, was studied to detect the
differences in nutritional quality of chickpea proteins
and the effect of the heat treatment on these proteins.
This work also verified the possible correlation between
the microbiological method and protein quality
evaluation by Protein Digestibility Corrected Amino
Acid Scoring (PDCAAS). The RNV microbiological
29
 method showed to be efficiently able to distinguish
different nutritional aspects of chickpea protein
fractions, and it was sensible to detect the effect of heat
treatment. A significant positive correlation between
Relative Nutritional Value by microbiological method
and PDCAAS method was found (R = 0.8142). E.
zymogenes method results corroborated its aspects of
quickness and simplicity.
KEYWORDS: Chickpea; Enteroccocus zymogenes;
nutritional evaluation; protein digestibility; chemical
score.
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Alim. Nutr., Araraquara, v.15, n.1, p.17-22, 2004
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