DESVENDANDO O

DIAGNÓSTICO DA LVC

Dr. Luiz Eduardo Ristow

Dr. Afonso Alvarez Perez Junior
 LVC (Leishmaniose Visceral Canina)
ETIOLOGIA
Protozoário: Leishmania chagasi
da família dos Trypanosomatidae,
pertencente ao Complexo Leishmania
donovani
Vetor: “mosquito palha” Lutzomyia
longipalpis - Prefere picar ponta de
orelha e nariz. Crepuscular e Noturna –
voa baixo – 1 a 3 mm.
 LVC (Leishmaniose Visceral Canina)
epidemia em franca expansão geográfica

Ocorre em 20/27
Estados do
Brasil!
Mais de 90% dos casos de Leishmaniose
Visceral das Américas ocorrem no Brasil
 LVC – Etiologia e Vetor
Este protozoário necessita de 2 hospedeiros, sendo
um hospedeiro vertebrado (homem, canídeos, etc.)
e um hospedeiro invertebrado (mosquito palha)
 LVC –Vetor
Importante ressaltar que flebotomíneos não
são mosquitos pois não tem fase larval na
água e sim na matéria orgânica;
Não tem preferência pelo interior das
residências: 84% está no Peridomicílio.
 No hospedeiro vertebrado ele
penetra através da picada do
mosquito infectado, as promastigotas
se transformam em amastigotas,são
fagocitadas, se dividem – rompem os
macrófagos e são novamente
fagocitadas- e pelo sistema hémato-
linfocitário alcançam os órgãos do
sistema mononuclear fagocitário
(medula óssea, baço, fígado, sistema
linfático, etc) onde se reproduzem
mais por fissão binária na forma
amastigota. JÁ NAS 1ª HORAS.
 LVC - Patogenia
• Tempo de incubação bastante variado que vai de 2 meses
até 6 anos. Em geral os primeiros anticorpos são
observados após 45 dias da infecção.

• No mosquito, o período entre a contaminação e a

eliminação da forma infectante (promastigota
metacíclica), atinge de 4 a 21 dias.

• A doença decorre da invasão do agente nas vísceras, sua

reprodução e colonização das células do hospedeiro
vertebrado, principalmente as células do Sistema
Mononuclear Fagocitário. Naqueles animais sensíveis
haverá maior manifestação dos sinais clínicos.
 Implicações imunológicas

Resistência
•Resposta imune celular
•Resposta
• Th1
•Aumento nos níveis de IFN-γ
•Aumento dos níveis IL- 2 e IL-12
• Aumento dos níveis de IgG2

Susceptibilidade

• Resposta imune humoral

• Resposta Th2
• Níveis baixos de IFN-γ
• Aumento dos níveis de IL-10 e IL- 4
www.fcfrp.usp.br • Aumento dos níveis de IgG1
Novos mecanismos de transmissão da LVC
• Transmissão vertical da LVC -
TRANSPLACENTÁRIA

- Andrade et al., (2002): Placenta de cadelas

- Rosypal e Lindsay (2005): Modelo murino
- Rosypal (2005): Cadela Beagle
- Silva et al., (2009): 1º relato no Brasil
- Santos et al., (2009): Cadelas sintomáticas e
assintomáticas
 Transmissão Venérea da LVC
Primeiro relato de transmissão venérea da LVC (Silva et al.,
2009);

- 6 das 11 cadelas foram positivas para Leishmania sp pela

técnica da PCR;

- 2 das 11 cadelas apresentaram soroconversão detectadas

pelas técnicas de ELISA e RIFI,

A transmissão venérea da LVC é unidirecional,

partindo do macho infectado para fêmeas susceptíveis.
 Transmissão por Transfusão
da LVC
•Leishmania sp. pode ser transmitida pelo
sangue total ou frações de células
mononucleares de cães infectados para
animais receptores, independentemente da
condição clínica do doador (de Freitas et al.,
2006);
•Três dos sete cães que receberam sangue
de doadores infectados desenvolveram
títulos sorológicos para LVC por IFA (Owens
et al., 2001);
Leishmaniose felina
Um Novo Desafio?
 Sinais Clínicos
Fase Aguda
Linfadenomegalia generalizada
Febre
Prostração
Ausência de lesões na pele

Fase Crônica
Linfadenomegalia • Onicogrifose
Caquexia • Anemia
Alopecia • Hepatoesplenomegalia
Úlceras cutâneas • Disfunção renal
Dermatites esfoliativa • Trombose
 LVC – Sinais Clínicos
Dermatológicos:
• Reação no local da infecção = associado à picada do
mosquito vetor. “Cancro de inoculação”; cerca de 20
dias após a infecção.
• dermatite seborréica
• alopecia periorbital
• hiperqueratoses
• nódulos subcutâneos
• Onicogrifose ( unhas grandes )
• ausência de prurido
• erosões e úlceras (pontas de orelha/focinho)
 LVC – Sinais Clínicos
• linfadenomegalia
• emagrecimento
• abatimento, fadiga, prostração
• febre
• anemia
• nefrite
• hepatoesplenomegalia
• hemorragias (melenas, epistaxe)
• poliartrites
• lesões oculares (blefaroconjuntivites/ceratoconjuntivite/hemor-ragias
retinianas)

Em condições naturais 60% dos cães infectados

são assintomáticos ou seja sem sinais clínicos!!
Prevenção e Controle
Controle – Vetor
• Ação inseticida e repelente: Plantas
repelentes (Citronela
e Neem)

• Controle do meio
ambiente
 Controle – Vetor
• Controle com Inseticida:

- Direcionado para as formas adultas

- inseticidas residuais são eficientes
em reduzir a população de flebotomos
- aplicação de inseticidas nas casas e
redes impregnadas com inseticidas
- Utilização num raio de 150 metros (caso humano)
- Dificuldade: custos e liberação dos moradores
 Controle do Vetor
• CONTROLE REPELENTE
• Coleira impregnada com DTM a 4% / Dissolução lenta
na camada lipídica da pele do cão - Ótimos níveis em
todo o corpo após 2 a 3 semanas

• Indicada somente para cães (não p/ Felinos)

• Proteção permanente até 6 meses

 Controle do Vetor
•CONTROLE REPELENTE

Combinação de Permetrina x Imidacloprida

– demonstrou ação repelente e inseticida em áreas endêmicas

(Mencke et al., 2003)

Recomenda-se a aplicação a cada 21 dias (90-92%)

Imunoprofilaxia

Leish-tec®

Leishmune®

Canileish ® - Europa

Impedem a transmissão
Educação
Em condições naturais 60% dos cães infectados
são assintomáticos ou seja sem sinais clínicos!!
Para isto contamos com o apoio
laboratorial. Exames Laboratoriais são
uma importante fonte de informações,
indispensáveis para tomada de decisões
na busca de soluções para cada situação.
 Achados Laboratoriais
Parâmetro Frequência (%)
Hipergamaglobulinemia 70 – 100

Baixa relação Alb/Glob 76

Elevação Proteína Sérica Total 64 – 91

Anemia Normocítica/cromica 21 – 94

Leucopenia 22

Leucocitose 8 – 24

Trombocitopenia 29 – 50

Hiperazotemia e Creatininemia 38 – 45

Elevação das enzimas hepáticas 16 – 61

Proteinúria 29 – 91

Positividade Autoimune (ANA) 31 - 47

QUEM DÁ O DIAGNÓSTICO É O MÉDICO
VETERINÁRIO
Juntamente com a avaliação clínica dos
animais; dados epidemiológicos,
freqüência e incidência de sinais clínicos,
nos permitem a definição do diagnóstico
(Medicina veterinária baseada em
evidencias).
• Os exames laboratoriais individuais devem
ser usados para fins diagnósticos
(CERTEZA) a fim de evitar uso errôneo de
medicamentos e vacinas baseado apenas
em suposições já que muitas doenças
apresentam sinais clínicos similares.
• No caso LVC, define prognostico legal de
morte (MS – RIFI 1:40).
 Existem 4 expectativas ou “ Desejos “
envolvidos no Diagnóstico Laboratorial
da Leishmaniose:
1- Proprietário quer que dê Negativo ;
2- Serviço de Zoonose (Saúde Pública)
quer controlar (suspeito = positivo);
3- M. Veterinário quer esclarecer “DE
UMA SÓ TACADA”;
4- Laboratório quer relatar o resultado
encontrado e não pode se envolver nos
desejos para evitar influências.
TESTES SOROLÓGICOS:
 RIFI * + ELISA*
* Técnicas aceitas pelas autoridades
sanitárias Brasil – REALIZAR APENAS
C/ KITS REGISTRADOS NO MAPA .
- FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO;
- HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA;
- AGLUTINAÇÃO EM LÁTEX;
- IMUNOPRECIPTAÇÃO EM GEL
- WESTERN BLOT
• Coleta do Sangue para obter o SORO – mínimo
1 ml – colhido na seringa e colocado no Tubo de
Tampa Vermelha – sem anticoagulante (MAS
COM ACELERADOR DA COAGULAÇÃO, para
não dar hemólise e falso positivo).

SEMPRE USAR SORO !!!

Métodos disponíveis no TECSA:
1-Sorologia LVC- ELISA + RIFI -2 dias
2-Sorologia LVC+ Pesq. de Hemat. -2 dias
3-Sorologia LVC+PTF - 2 dias
4-Sorologia LVC+Imunohist. - 5 dias
5-Imunohist. para LVC - 5 dias
6-Pesquisa Direta para LVC- 5 dias
7-PCR para LVC - 3 dias
8-Perfil Diag.: Sorologia+IHQ+Cultura-25 dias
 FUNDAMENTOS
• Positivo ou Reagente ?
Palavras com significados diferentes e
conseqüências diferentes
• Indeterminado?
• Indeterminado num teste sorológico significa que o
resultado obtido apresentou-se perto do ponto de
corte (valor teórico estabelecido pelo fabricante ou
legislação a partir de uma equação teórica. No caso de
RIFI significa observação de fluorescência não típica
devido a característica do soro.
 IFI (RIFI) – Reação de
Imunofluorescência Indireta
Resultados:
• Reagente (1:40 ou maior)
• Não Reagente
• Indeterminado
L. major-
like
( Inesp.)
• RIFI: se não L. chagasi, se for L. major (rede
MS) resultado positivo para todos os
tripanosomatídeos!!!!
Ponto de Corte
– No Brasil positivo é > ou = 1/40 para inquéritos
caninos
– No Brasil é > ou = 1/80 para sorologia humana
– E no resto do mundo ?
 PONTO DE CORTE DA RIFI
• O MS, LACEN e SERVIÇOS DE ZOONOSE CONSIDERAM O
TÍTULO DE 1/40 COMO POSITIVO EM CÃO ( E 1/80 PARA
HUMANOS);

• A maioria dos pesquisadores hoje

considera 1/160 como título mínimo.

• Dr. Luigi Gradoni –Istituto Superiore de Sanitá -Itália –1/160

• Dra Joaquina Martín-Sanches-1/160 trabalho publicado
pelo CDC dos EUA em 2009
• Dr Lluis Ferre - 1/320
 TECSA utiliza kits importados
que contem antígeno específico
do parasito causador da LV :
L. chagasi
• Nossas leituras são realizadas por Profissionais
com vários anos de experiência em Leitura de
Leishmaniose .
• Na nossa larga experiência em Laboratório Diag. é
por realizarmos milhares de exames de LVC.
• Uma das mais importantes formas
de aumento do poder diagnóstico,
ou seja obter fechamento
conclusivo, é o SOMATÓRIO DE
EXAMES.

Ex. HIV { ELISA + RIFI}

 Diagnóstico sorológico ELISA

http://www.managingdesire.org
KIT ELISA BIOGENE
•Especificidade MEDIA de 94,3% (pode alcançar 100%)
•Sensibilidade MEDIA de 89% (pode alcançar 96,4%)

Dados da BULA DO KIT

baseado em trabalhos UFPE, UFCG, UFRN.
Resultado da OD – densidade ótica
– é estabelecido em Relação ao
Cutoff
140

120

100

Cut-off: 0,100
Frequency

80

60

40

20

0
-0,05 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 0,6 0,65 0,7
S/P
 Kits ELISA Bio-Manguinhos
ELISA (triagem) e RIFI (confirmação)– rede pública: Ag total de Leishmania major.

Inform. de bula RIFI ELISA ELISA

Amostra soro soro Papel de filtro
(eluato)
Sensibilidade 90% 94,5% 79,5%
Especificidade 80% 91,8% 90,2%

Atenção para a sensibilidade e especificidade diferentes de cada método e

para cada teste(antígeno)!
 Cad Saúde Pública 2004 Jan-Feb;
20(1):259-65 Pub 2004 Mar 08
[Quality of diagnosis of canine visceral leishmaniasis in epidemiological
surveys: an epidemic in Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, 1993-1997]
Alves WA, Bevilacqua PD

“... Como implicações práticas nas atividades de controle da LV canina na

capital mineira, o programa sacrificou 12.924 animais falsos positivos e
deixou de sacrificar 2.003 animais falsos negativos...”
• O resultado depende do Ag usado nos testes

–ELISA utilizado TECSA : Ag HSP70=

proteína recombinante (S7) Biogene.
Mais especifico para L chagasi
NEGATIVO em cães vacinados

–ELISA inquéritos: Ag = bruto L. major

Baixa especificidade (alto FALSO-
POSITIVO)
• Fechamento conclusivo é necessário o
SOMATORIO DE EXAMES.
PRIMEIRO PASSO
• Sorologia ELISA S07 + RIFI (L. chagasi)
• Hemograma / Proteínas totais e frações
• Pesquisa/Sorologia de Hematozoários
(Erlichia, Babesia, Neospora e
Trypanosomas)
• Fechamento conclusivo é necessário o
SOMATORIO DE EXAMES.

SEGUNDO PASSO
• Reteste nova amostra após 30 ou 60 dias
• Parasitologico = IHQ = PCR = Pesquisa do
agente
Alterações na detecção Sorológica:
-Fase de Pré-soroconversão
-Animal antes de 4 meses de idade
-Após 2 anos de infecção
-Animais em Tratamento
-Uso contínuo de Corticosteróides
-Hemólise acentudada
-Leishmaniose Tegumentar
 Exames
confirmatórios

Parasitológicos:
Pesquisa Direta
Imunohistoquímica.

Moleculares:
PCR

Microbiológicos:
Cultura
 Imunohistoquímica
AUMENTA A SENSIBILIDADE DO TESTE
PARASITOLÓGICO .
ESPECIFICIDADE: 100%
SENSIBILIDADE: 80% Poli-sintomáticos
Depende do grau de parasitemia , do tipo de
material biológico coletado e do Profissional que
fará a leitura da lâmina.
Em todos os estudos apresentados a maior carga
parasitária foi encontrada em LINF. Reativos.
 <= Aspirado de linfonodo

Aspirado de medula óssea =>

Biópsia para exame histológico
e
imunocitoquímico
 Pesquisa de amastigotas

Biópsia para exame histológico

e
imunocitoquímico
• A técnica de imuno-histoquímica utiliza-se
da junção da técnica de histopatologia e
parasitológico com técnicas imunológicas.
• O material é tratado com anticorpos anti-
leishmania e posteriormente são
adicionados anticorpos anti-IgG canino
monoclonais, marcados com a enzima
peroxidase.
• A reação ou marcação positiva revela-se em
tom castanho-claro a castanho-escuro
 Material biológico:
Fragmentos em formol a 10%.
• Linfonodos
• Punção de Baço
• Medula óssea
• Pele
• São confeccionadas dois cortes
histológicos, um para coloração em H&E e
outro para a IHQ propriamente dita.
• Parasitológico – Imuno-histoquímico
 Molecular
PCR - Polimerase Chain Reaction
SENSIBILIDADE : 50% A 88% e
ESPECIFICIDADE DE 100% (?)
Material:
• 1º Linfonodos;
• 2º Medula óssea;
• 3º Biopsias Cutâneas
NÃO REALIZAR COM SANGUE
Técnica Real Time – apenas quando se
trata o paciente- é quantitativa.
 Método Sensibilidade

IHQ 70 - 80%

PCR 38 – 76%

Pesquisa O – 60
agente
Cães PCR positivos apenas diz que o
animal está infectado mas não doente –
títulos altos de IgG comprovam a Doença.
Deu resultado inconsistente, o que
pode ser?
1- Pode ser pessoal mal treinado em RIFI ou com
pouca experiência
2- ou algum problema sério na conservação desta
amostra – por exemplo amostra congelada
3- contaminação bacteriana.

Discuta com o suporte técnico do

laboratório
 1-ALGORITMO DIAGNÓSTICO LVC
Sorologia – Elisa + RIFI

Elisa – NR // RIFI - NR Elisa R // RIFI = 1/80

s/sintomas c/sintomas Animal s/sintomas Animal c/sintomas

Animal sadio Animal c/Falência Nova sorologia Confirma Diagnóstico
Imunológica? – fazer PTF após 30 dias Leishmaniose
IHQ
de linfonodo ou medula
Elisa R Relação Elisa R e RIFI 160
RIFI 1/80 A/G < 0,60
IHQ - IHQ +
Confirma LVC
Aguardar 30 dias
Não refazer
Descarta Confirma
Leish Leish
Elisa R / RIFI 1/160
Elisa R
Novo RIFI 1/40 ou 1/80
Parasitológico : Relação A/G <0,60
PCR punção de
Medula ou IHQ
Aguardar + 60 Parasitológico
dias ou PCR punção de
e refazer Medula ou IHQ
IHQ - ou PCR - IHQ + ou PCR +

IHQ - ou PCR - IHQ + ou PCR +

Descarta
Leish Confirma
Leish Perseguir sorologia
Após + 60 dias
Legenda: NR = não reagente, R = reagente, IHQ = Imunohistoquímica, PTF = Proteínas totais e fração, A/G = relação albumina/Globulina
 ALGORITMO DIAGNÓSTICO LVC -DISCORDANTES

Sorologia – Elisa + RIFI

Elisa – R // RIFI - NR Elisa NR RIFI =1/40 ou 1/80

_ Crioaglutininas? _ Reação cruzada?

_ Erro do Laboratório? _ Soro hemolizado?
_ ”Fim” de soroconversão? _ Leish tegumentar?
_ Cão vacinado?
Repetir nova amostra _ Animal 5 meses – títulos inespecíficos
De imediato _ Animal em tratamento ou tratado
ELISA + RIFI _Início da soroconversão
-Uso Prolongado de corticóide?
Repetir Leish e PTF após 30 a 60 dias
Elisa R Elisa e RIFI - NR
RIFI 1/40 – 1/80

ELISA R // RIFI= 1/40 ou 1/80

Seguir os passos Animal sadio
do algoritmo 1
Animal s/sintomas Animal
Sintomático?
Seguir Algoritmo 1

Confirma LVC
• Exames Sorológicos de animais vacinados.

Animais vacinados apresentam sorologia Não Reagente na

RIFI e ELISA
 OBRIGADO!!!

www.tecsa.com.br
tecsa@tecsa.com.br
Palestra disponível no site a
partir da semana que vem –
página CURSOS e
EVENTOS.
www.tecsa.com.br