UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR, EMBRIOLOGIA E GENÉTICA
CURSO DE LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Leonardo Henrique dos Santos

Proposta de protocolo de identificação de DNA não-humano

proveniente de apreensões em eventos como “Farra do Boi”

Florianópolis,
2023
 Leonardo Henrique dos Santos

Proposta de protocolo de identificação de DNA não-humano

proveniente de apreensões em eventos como “Farra do Boi”

Trabalho Conclusão do Curso de Graduação em

Licenciatura em Ciências Biológicas do Centro de
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa
Catarina como requisito para a obtenção do título de
Licenciado em Ciências Biológicas
Orientador Profª. Dra. Andrea Rita Marrero

Florianópolis,
2023
 Ficha de identificação da obra

A ficha de identificação é elaborada pelo próprio autor.

Orientações em
http//portalbu.ufsc.br/ficha
 Leonardo Henrique dos Santos

Proposta de protocolo de identificação de DNA não-humano

proveniente de apreensões em eventos como “Farra do Boi”

Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de
Licenciado e aprovado em sua forma final pelo Curso de Graduação em Ciências Biológicas.

Florianópolis, 22 de março de 2023

Profa Dra Daniela Cristina De Toni

Coordenadora do Curso

Profa Dra Andrea Rita Marrero

Orientadora

Dr Fabio Wiggers Especialista Isabela Farias Macedo

Fundação Municipal do Meio Ambiente Universidade Federal de Santa Catarina

Florianópolis - SC Florianópolis - SC
Este trabalho é dedicado à minha esposa Rayla Rocha, que me
incentivou a chegar onde eu estou e aos meus pais que
sempre me apoiaram.
AGRADECIMENTOS

À minha esposa que tanto me incentivou e que foi inspiração para que eu chegasse até aqui.

Aos professores e professoras que passaram por esse caminho e que terei o prazer de levar
comigo em minha memória.

Aos meus pais que tanto se orgulharam do caminho em que segui e me apoiaram em todas as
decisões que tomei.

À minha gatinha e meu coelhinho que transformaram as tristezas em alegrias nos momentos
em que mais precisei de companhia durante essa trajetória.

À Universidade Federal de Santa Catarina e todo o quadro de funcionários que fazem a

Universidade ter toda a excelência e qualidade na formação dos seus discentes.

À minha orientadora pelos ensinamentos durante a construção deste trabalho, além das aulas
de genética muito enriquecedoras.
“(...) a ignorância gera mais frequentemente confiança do que
o conhecimento: são os que sabem pouco, e não aqueles que
sabem muito, que afirmam de uma forma tão categórica que
este ou aquele problema nunca será resolvido pela ciência”.
(DARWIN, 1871).
RESUMO

A Farra do Boi é uma festa tradicional polêmica que ocorre em algumas regiões do Brasil,
principalmente no sul do estado de Santa Catarina. Durante este festival, os participantes
perseguem e atormentam um touro, muitas vezes levando o animal a ferimentos ou morte. O
festival é considerado por muitas organizações de bem-estar animal como uma forma de
crueldade animal e, portanto, é ilegal no Brasil. No entanto, continua a ser praticada em
algumas áreas, principalmente nas comunidades rurais, onde é vista como uma tradição
cultural. Aqueles que apoiam o festival argumentam que é uma parte importante de sua
cultura e que os touros não são prejudicados excessivamente. No entanto, os opositores
argumentam que o festival é uma prática bárbara e ultrapassada que deveria ser proibida. Nos
últimos anos, houve esforços de ativistas dos direitos dos animais e funcionários do governo
para reprimir o festival e fazer cumprir as leis contra a crueldade animal. No entanto, o
festival continua sendo uma questão controversa e polêmica no Brasil. Neste trabalho são
apresentados protocolos que podem ser integrados à rotina de laboratórios de biologia
molecular com intenção de identificar e aplicar a legislação disponível.

Palavras-chave: Barcode. COI. DNA não humano.

ABSTRACT

The Farra do Boi is a controversial traditional party that takes place in some regions of Brazil,
mainly in the south of the state of Santa Catarina. During this festival, participants chase and
torment a bull, often leading the animal to injury or death. The festival is considered by many
animal welfare organizations to be a form of animal cruelty and is therefore illegal in Brazil.
However, it continues to be practiced in some areas, mainly in rural communities, where it is
seen as a cultural tradition. Those who support the festival argue that it is an important part of
their culture and that the bulls are not harmed excessively. However, opponents argue that the
festival is a barbaric and outdated practice that should be banned. In recent years, there have
been efforts by animal rights activists and government officials to crack down on the festival
and enforce laws against animal cruelty. However, the festival remains a contentious and
controversial issue in Brazil. This work presents protocols that can be integrated into the
routine of molecular biology laboratories with the intention of identifying and applying the
available legislation.

Keywords: Barcode; COI; non human DNA

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 - Divisão regional de Santa Catarina em regiões geográficas intermediárias (IBGE 2017)
Figura elaborada por Instituto COURB (2019) ………………………………………………………….?

Figura 02 - A Farra do Boi causa conflito entre dois artigos da Constituição Federal de 1998.
Enquanto o Artigo 215 preza pelo direito a manifestações culturais, o Artigo 225 zela pelo ambiente
ecológico equilibrado. (Fonte elaborada por Andrea Marrero, 2023)…………………………………...

Figura 3 diagrama explicando as etapas do Barcode (Fonte adaptado de

https//www.biome-id.com/english-1/molecular-services-1/dna-barcoding/) ……………………………

Figura 04 – roteiro dos passos necessários para obtenção de identificação de amostra por Barcode
DNA
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 13
1.1 Farra do Boi – aspectos sociais 15
1.2 Farra do Boi – aspectos jurídicos 16
1.3 Identificação Forense de DNA não humano 19
2 OBJETIVOS 21
2.1 Objetivo Geral 21
2.2 Objetivos específicos 21
3 MATERIAL E MÉTODOS 21
PASSO 1. Coleta das amostras 22
PASSO 2. Extração e amplificação do DNA 23
PASSO 3. Processamento da Amostra 23
PASSO 4. Sequenciamento do fragmento COI 24
PASSO 5. Identificação das espécies e análises estatísticas 24
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 24
REFERÊNCIAS 26
ANEXOS 28

ANEXO 1. Protocolo de extração Meeker et al (2007) 28

ANEXO 2. Protocolo de extração de DNA de sangue por protocolo “Salting out” 29
ANEXO 3. Protocolo de extração de DNA modificado de Aljanabi e Martinez (1997) 31
ANEXO 4. Quantificação de DNA com Nanovue 32
ANEXO 5. Reação em Cadeia da Polimerase – PCR 33
ANEXO 6. Gel de Agarose e Eletroforese 34
 13

1 INTRODUÇÃO
O Estado de Santa Catarina está situado na região sul do Brasil tendo como limites o
Paraná (ao norte) e Rio Grande do Sul (ao sul), Misiones, Argentina (a oeste) e uma extensa
área em contato com o Oceano Atlântico. Devido à diversidade topográfica de seu relevo, é
possível encontrar paisagens muito diversificadas em curtas distâncias. Além das praias
reconhecidas mundialmente para turismo, também a serra e o planalto fazem parte dos
cenários de Santa Catarina, que está inteiramente no bioma da Mata Atlântica. De acordo com
o IBGE (2017) o estado estava dividido em seis mesorregiões (capital, planalto, sul, vale,
norte e oeste) agora identificadas em sete Regiões geográficas intermediárias ou imediatas
Florianópolis, Criciúma, Lages, Chapecó, Caçador, Joinville e Blumenau (ou Vale do Itajaí)
identificadas na figura 1. A economia gira em torno dos setores industriais, extrativistas e
pecuaristas.

Figura 01 - Divisão regional de Santa Catarina em regiões geográficas intermediárias (IBGE 2017) Figura
elaborada pelo Instituto COURB (2019).

A ocupação do território catarinense iniciou com os Vicentistas no século XVII,

seguida pelos açorianos e paulistas e marcada por uma leva recente de imigrantes europeus
não portugueses (italianos, espanhóis, alemães e poloneses). Assim como outras regiões do
 14

Brasil, o componente triplo de colonização (ameríndio/ africano/ europeu), é importante

destacar que a contribuição europeia que se percebe é proveniente de ondas mais recentes de
imigrantes que chegaram ao país (Torres, 2014).

O forte componente açoriano da população atual catarinense é atribuído a um

programa de ações da coroa portuguesa entre 1747 e 1753, quando mais de 6000 homens
mulheres e crianças provenientes do arquipélago de Açores e Madeira, desembarcaram no
estado para povoar e defender o Brasil de possíveis ataques de espanhóis. Foram sendo
criadas diversas colônias açorianas em pontos estratégicos do litoral, que depois se
espalharam por outras regiões do Brasil. De acordo com Lago (1971) 6492 açorianos
chegaram ao Brasil até 1753. Foi uma estratégia conveniente para Portugal, uma vez que
Açores passava por uma grave crise de subsistência devido à densidade populacional elevada.

Em Florianópolis, alguns bairros ainda guardam a presença da cultura açoriana,

principalmente por meio da arquitetura, mas também sob um forte aspecto de ancestralidade.
Estudos genéticos realizados em duas comunidades catarinenses fundadas por açorianos
(Costa da Lagoa e São João do Rio Vermelho) mostram que além das colaborações africanas e
nativas indígenas, as frequências de marcadores de ancestralidade são semelhantes àquelas
das comunidades ancestrais europeias (Muniz, 2008).

Além das características de ancestralidade genética, os parentais imprimiram nas

regiões ocupadas as suas tradições (ou memória destas) seja em hábitos laborais, alimentares
ou ditos “culturais”. Diversas festividades no estado são procedentes dos hábitos trazidos por
essas populações, muitas delas acontecendo em outubro, em Blumenau a Oktoberfest, em
Treze Tílias a Tirolerfest, Marejada de Itajaí, Festa do Pinhão em Lages ou Fenarreco de
Brusque. Outras festas folclóricas merecem destaque como o Boi de Mamão (em janeiro e
fevereiro), a procissão do Senhor Jesus dos Passos , a festa do Divino Espírito Santo e a Farra
do Boi (na semana santa).

A participação significativa de povos mediterrâneos e açorianos (bem como

madeirenses) trouxe à costa catarinense, entre muitas marcas, os hábitos da lida pecuarista e a
relação de sobrevivência e diversão no entorno do gado (Lacerda, 2003). Um importante
reflexo de uma época em que as “touradas” eram bastante comuns entre imigrantes. Porém, ao
chegar ao Brasil esses imigrantes receberam pequenos lotes em terras pouco férteis e
mudaram suas atividades de sobrevivência para pesca e agricultura familiar (Martins, 2017).
 15

1.1 FARRA DO BOI – ASPECTOS SOCIAIS

De acordo com Lacerda (1993) se uma pessoa quiser saber o que é a Farra do boi e
procurar no Dicionário do Folclore Brasileiro de Luís da Câmara Cascudo (1962), encontrará
o que se chamava de Boi-na-Vara, essas pessoas logo perceberão, sem problemas, que se
trata de uma manifestação folclórica dentre outras no contexto da cultura do Boi no Brasil,
como é, por exemplo, as vaquejadas e os rodeios.

Uma das prováveis explicações para o ritual seria que ao recolher os barcos, após
intensos trabalhos para o período da Semana Santa (tradição religiosa cristã), a prática
representava uma herança do catolicismo antigo, onde o boi é visto como a figura de Judas, o
traidor de Cristo. Essa simbologia era a carta branca para que os farristas cometam sem culpa
todas as atrocidades, mesmo que diversas instâncias sociais (como associações de proteção
ambiental ou igreja católica durante a semana santa) se posicionem contra a prática.

… era nesse tempo de ócio que ocorriam as brincadeiras, que

começavam já na quarta-feira. No Sábado de Aleluia, o boi era recolhido
e no Domingo de Páscoa era sacrificado e a sua carne consumida. O
carnear e o comer o boi, tal como um objeto sacrificial, sinalizava o fim
da festa como a “hóstia repartida aos consortes” (Lacerda, 2003).

De acordo com Ramos (2011) ainda que muito difundida no estado, a Farra do Boi não
é muito divulgada, está geralmente associada à clandestinidade em áreas de pasto, campo ou
praia e restrito a comunidades nativas. Monteiro Filho (1990) descreve que “a farra tem início
com a elaboração de uma lista de sócios, que se reúnem para levantar verba para a aquisição
do boi. O valor é pré estabelecido, mas não é incomum que duas ou mais pessoas se reúnam
para adquirir uma quota. Em alguns lugares somente homens podem ser sócios da farra. Após
o sacrifício, a carne do animal é repartida entre o grupo de farristas”.

De acordo com a Prefeitura Municipal de Florianópolis em Santa Catarina, a farra do

boi é um evento que consiste em soltar um bovino em um terreno ou rua, fazendo com que o
animal corra atrás das pessoas que participam deste evento e esse animal acaba correndo por
longas distâncias até ficar exausto. Rangel (2010) é enfático em descrever que “consiste em
soltar um boi e provocá-lo das mais diversas formas, que vão da moléstia física à psíquica, de
 16

maneira a persegui-lo até a completa exaustão, quando então é sacrificado e sua carne é
rateada entre os farristas”. O perigo dessa conduta se consolida nos seus impactos aos valores
da sociedade, pois geram uma vulgarização da violência contra os animais que passa a ser
considerada como ato tolerável.

1.2 FARRA DO BOI – ASPECTOS JURÍDICOS

Até meados dos anos 70, a farra do boi não era problematizada pelo público, pelo
contrário, essa prática era vista e enquadrada como um folguedo popular. Em poucos anos
também foi apontado como ato de selvageria, crueldade ou até tortura, tudo isso pelo modo
em que os animais eram e são tratados pelo público que venera esse tipo de prática. Tal evento
só termina quando o animal está exausto e machucado a ponto de não mais se levantar, com
ossos e chifres quebrados a pauladas, olhos perfurados, couro e musculatura dilacerada, entre
outras atrocidades. No final dos anos 1960 e início dos 1970, apesar de seus defensores,
deixa de ser considerada uma apenas brincadeira e começa a ser malvista pela vinculação à
crueldade com os animais (Martins, 2010).

Uma das dificuldades de aplicar a lei está no caráter de mensuração, pois não existe
medida para determinar a intensidade da crueldade, ou seja, ou é cruel ou não é cruel. Mas a
aplicação da pena que é variável depende desta classificação que deve ser feita no ato da
notificação. De acordo com Steinmetz (2009) "Casuísmo interpretativo" descreve um tipo de
raciocínio interpretativo que muitas vezes é considerado falho ou tendencioso. Em geral, a
casuística refere-se à prática de usar casos específicos para desenvolver princípios ou regras
gerais. Em contextos legais ou éticos, essa abordagem pode ser útil para resolver questões
complexas que não possuem soluções claras. No entanto, a casuística também pode ser
problemática se for usada para justificar decisões inconsistentes ou arbitrárias.

No contexto do raciocínio interpretativo, o casuísmo interpretativo refere-se à prática

de interpretar seletivamente evidências ou argumentos para apoiar uma conclusão ou agenda
predeterminada. Isso pode envolver ignorar ou minimizar as evidências que contradizem a
posição de alguém, citando seletivamente fontes que corroborem seus argumentos ou usando
linguagem ambígua para apresentar argumentos que não são logicamente válidos.
 17

O casuísmo interpretativo pode ser particularmente problemático em debates políticos

ou ideológicos, onde os defensores podem estar mais interessados em promover sua agenda
do que em chegar a uma conclusão racional e objetiva. No entanto, também pode ser um
problema em outros contextos, como debates jurídicos ou científicos, onde a interpretação
objetiva e consistente das evidências é essencial. Diversos juristas apontam o conflito que
existe entre os dois artigos da Constituição Federal (figura 2).

Figura 02 - A Farra do Boi causa conflito entre dois artigos da Constituição Federal de 1998. Enquanto o Artigo
215 preza pelo direito a manifestações culturais, o Artigo 225 zela pelo ambiente ecológico equilibrado. (Fonte
elaborada por Andrea Marrero, 2023).

Com a interferência jurídica do Supremo Tribunal Federal (STF) em 1997 a prática

passou a ser considerada ilícita. Os ministros da época consideraram tal prática
“intrinsecamente cruel" (Torres, 2018). No final do ano de 1999, ou seja, dois anos após o
julgamento pelo STF, a Assembleia Legislativa do Estado de Santa Catarina aprovou uma lei
que visava regulamentar a Farra do Boi no território estadual, permitindo sua prática desde
que não houvessem tratamentos cruéis com os animais e não perturbasse a ordem pública
(Martins, 2017). Como essa lei era inconstitucional nos termos da decisão do STF, o veto foi
 18

derrubado com a argumentação de que a iniciativa parlamentar era acabar com a crueldade
aos animais.

Atos de agressividade, violência ou desprezo a outros animais não recebem nenhum

tipo de proteção da Constituição Brasileira (1988) que tem o dever de proteger o meio
ambiente, ainda que seja necessário se sobrepor a valores culturais.

A Lei Nº 9.605, DE 12 DE FEVEREIRO DE 1998 dispõe sobre as sanções penais e

administrativas derivadas de condutas e atividades lesivas ao meio ambiente, e dá outras
providências. Considera que o ato de abuso, maus tratos, mutilação ou outros danos são
passíveis de detenção de três meses a um ano além de multa (Artigo 32) e tipifica que o crime
contra a fauna decorre de “experiência dolorosa em um animal vivo, ainda que para fins
didáticos ou científicos, quando existirem recursos alternativos”. Na mesma direção a LEI No
9643/2014 de 18 DE SETEMBRO DE 2014 que dispõe sobre a proibição de prática de
maus-tratos e crueldade contra animais no município de Florianópolis. Cabe ressaltar que há
mais de 80 anos os animais já eram protegidos pelo Decreto Nº 26.645 DE 10 DE JULHO DE
1934. Tal decreto visa estabelecer medidas de proteção aos animais que são tratados de forma
em que sua dignidade e/ou vida esteja em risco e prevê pena para todos aqueles que não
cumpram o que se diz no texto da lei.

A legislação não incide sobre a farra do Boi, mas sobre os excessos. Não é proibido
abater animais para consumo, mas a crueldade é infração e/ou crime1. Steinmetz (2009)
aponta que o tratamento cruel não é característica inerente ou essencial à Farra do Boi. Em
contrapartida, Oliveira (2019) acusa que os maus-tratos não são apenas de ordem física mas
também psicológicos por estar acuado, preso e sob constantes agressões. A decisão analisada
confirma o entendimento de que as práticas que causam sofrimento e crueldade aos animais
devem ser abolidas por violar diretamente as normas constitucionais que impõem a obrigação
de não praticar crueldade contra os animais.

Com o passar dos anos os farristas que estão envolvidos nessas práticas estão, cada
vez mais, sendo detidos pelas autoridades de Santa Catarina com indícios de que estavam

1
.
https//giovannaghersel.jusbrasil.com.br/artigos/787269593/qual-a-diferenca-entre-crime-infracao-penal-contrave
ncao-penal-e-delito
 19

participando do evento, com manchas de sangue em roupas e outros materiais dos animais
que acabam se fixando em suas roupas, em pedaços de madeira, no chão, entre outros. Porém,
as autoridades não têm estrutura suficiente para elaborar acusação uma vez que, mesmo com
evidências biológicas como sangue nas vestes, não há no Estado um protocolo padronizado de
identificação forense para evidências morfologicamente descaracterizadas de DNA não
humano.

1.3 IDENTIFICAÇÃO FORENSE DE DNA NÃO HUMANO

Considerando que o conceito de “espécie” é uma das discussões mais acaloradas das
Ciências Biológicas, o uso de ferramentas moleculares fornece uma adicional gama de
oportunidades para estudar a sistemática filogenética. Em 2003, Herbert e colaboradores
propuseram o sistema global de identificação para plantas e animais com o uso do gene
mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI), cujas sequências são interpretadas
como um código de barras (barcode) com as espécies sendo delimitadas por uma sequência
particular. Além da aplicação direta na organização taxonômica das espécies, o barcode é uma
importante ferramenta na identificação de espécies comercializadas, comprovando as
informações prestadas pelos estabelecimentos comerciais (figura 3).

Figura 3 diagrama explicando as etapas do Barcode (Fonte adaptado de

https//www.biome-id.com/english-1/molecular-services-1/dna-barcoding/)

A eficácia da técnica DNA Barcoding para a identificação molecular de espécies já é

bem sustentada de acordo com a literatura, mas o custo e o tempo necessários para a aplicação
desta ainda são considerados altos para uso em larga escala. O número crescente de iniciativas
 20

de identificação molecular, tanto públicas quanto privadas, demonstra a imensa relevância de

pesquisas com o intuito de aprimorar, agilizar e diminuir os custos das técnicas utilizadas.

Com a ampliação do uso de DNA Barcoding para identificação de diversos táxons, foi
criado um banco de dados onde as sequências de todas as espécies publicadas são depositadas.
O BOLD (Barcode of Life Database2) permite associar diversas informações às sequências,
inclusive oligonucleotídeos utilizados na amplificação e no sequenciamento das amostras lá
depositadas (RATNASINGHAM; HEBERT, 2007). Também é possível encontrar informações
relacionadas ao fragmento COI das mais diversas espécies no banco de dados GenBank
(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

O código de barras genético tem muitas aplicações na pesquisa da biodiversidade,

incluindo a identificação de espécies desconhecidas, detecção de erros de identificação de
espécies e monitoramento de mudanças nas populações de espécies. É especialmente útil em
situações em que os métodos tradicionais de identificação, como morfologia ou
comportamento, são difíceis ou impossíveis de usar.

A utilização de marcadores moleculares no auxílio ao combate de crimes envolvendo

animais não humanos é uma das práticas da Genética Forense, relacionando uma amostra
biológica à espécie e possibilitando que órgãos de ações fiscalizatórias possam embasar o
processo de indicativos de animais traficados ou indevidamente comercializados. A
interpretação é baseada em análises estatísticas, comparação com bancos de dados biológicos
validados e literatura especializada. A fiscalização e o contexto jurídico são competências de
órgãos competentes, mas a combinação de instituições de ação fiscalizatória com a produção
científica das pesquisas desenvolvidas na universidade tem mostrado o aumento da eficiência
das atividades de identificação das espécies afetadas. O conhecimento desenvolvido por
instituições de pesquisa retorna de forma imediata para a população quando tais resultados são
integrados a fiscalização ou identificação de possíveis fraudes alimentares ou de outra
natureza.

2
https//www.boldsystems.org/index.php/IDS_OpenIdEngine
 21

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Estabelecer um protocolo de rotina molecular em laboratórios de Genética Forense que
permita associar amostras de DNA não humano proveniente de gado bovino (Bos taurus) em
vestígios de humanos detidos em eventos alusivos à “Farra do Boi” em Santa Catarina.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

✔ Realizar levantamento bibliográfico comparativo de atividades como “Farra do Boi”,

Vaquejadas, Rodeios sob aspectos sociais e jurídicos

✔ Propor metodologia de extração de DNA, primers e condições de extração,

amplificação e sequenciamento para identificação por barcode;

✔ Estabelecer um protocolo para rotina de laboratórios de Identificação por DNA não

humano.

3 MATERIAL E MÉTODOS

Este projeto faz parte de um projeto maior intitulado “Gato por Lebre identificação
molecular (barcode) de animais de fraudes em animais comercializados ou traficados”
cadastrado no Sistema Integrado de Gerenciamento de Projetos de Pesquisa e Extensão
(SIGPEX UFSC) sob o número 20180320200, com aprovação na Comissão de Ética no Uso
de Animais (CEUA) da mesma universidade. É importante destacar que amostras serão
provenientes de vestígios e evidências coletadas no local da ocorrência por peritos da Polícia
Científica, capacitados para tal. Outras amostras podem ser de supermercados ou açougues, e
não serão propostas coletas invasivas em animais que não estejam neste grupo. Também
podem ser consideradas possíveis amostras que venham a ser oferecidas por ações
fiscalizatórias de órgãos competentes, parcerias cujos Termos de Cooperação Institucional
estão sendo analisados pelo Departamento de Projetos, Contratos e Convênios (DPC UFSC).

Desde a coleta à identificação da amostra, as etapas são mostradas na figura 3 e são

descritas a seguir.
 22

PASSO 1. COLETA DAS AMOSTRAS

A coleta de amostras de DNA é uma etapa importante que merece atenção especial
pois dela serão derivadas todas as etapas. A seguir, são apresentados alguns passos gerais para
a coleta de amostras de DNA (Figura 04):

Identificação do indivíduo: É importante identificar o indivíduo que será coletada a amostra,

pois essa informação será necessária em todas as etapas seguintes do processo.

Escolha do método de coleta: Existem vários métodos de coleta de amostras de DNA,

incluindo swabs bucais, coleta de sangue, saliva, cabelo, entre outros. O método escolhido
dependerá da finalidade da coleta, bem como das preferências e condições do indivíduo.

Preparação do local de coleta: O local de coleta deve ser limpo e livre de contaminantes,
para evitar a contaminação da amostra.

Coleta da amostra: O método de coleta escolhido deve ser realizado com cuidado, seguindo
as instruções do fabricante ou protocolo específico. É importante evitar o contato da amostra
com outras substâncias que possam contaminar o DNA.

Armazenamento e transporte da amostra: A amostra deve ser armazenada adequadamente,

para garantir a integridade do DNA. O transporte deve ser feito de forma segura, para evitar a
deterioração da amostra. É importante seguir as instruções específicas para cada tipo de
amostra e método de armazenamento e transporte.
 23

Figura 04 – roteiro dos passos necessários para obtenção de identificação de amostra por Barcode DNA

PASSO 2. EXTRAÇÃO E AMPLIFICAÇÃO DO DNA

A partir de amostras coletadas, o DNA será extraído utilizando o protocolo mais adequado às
necessidades e estrutura do laboratório. São apresentadas três opções: Protocolo de Meeker et
al. 2007 (Anexo 1), Protocolo por salting out (Anexo 2) e um protocolo adaptado a partir do
método de Aljanabi e Martinez (1997) (Anexo 3).

PASSO 3. PROCESSAMENTO DA AMOSTRA

Os resultados da extração e amplificação serão confirmados por eletroforese em gel de

agarose 1% (Anexo 4). A seguir, as amostras devem ser purificadas com a enzima ExoSAP-IT
(Amersham Pharmacia Biotech Inc.) e submetidas à reação de sequenciamento com reagentes
 24

do kit comercial BigDye para utilização do sequenciador ABI31303, disponível no

Laboratório Multiusuário de Estudos em Biologia (LAMEB UFSC).

PASSO 4. SEQUENCIAMENTO DO FRAGMENTO COI

Os eletroferogramas resultantes do sequenciamento dos primers direto e reverso serão

reunidos e analisados no programa SecScape® (Life Technologies) e somente aquelas cuja
qualidade for superior a 90% serão consideradas. As sequências consenso serão alinhadas e
editadas com o auxílio do programa BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999). Após o alinhamento, as
sequências serão exportadas para o Programa MEGA6 (Tamura et al, 2013), comparando com
sequências disponíveis nos bancos de dados adequados, tais como BOLD
(http//www.barcodinglife.org/), GenBank (http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), e FishBOL
(http//fishbol.org/).

PASSO 5. IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES E ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Com os resultados obtidos no passo anterior devem ser construídas relações

filogenéticas entre as linhagens, utilizando-se o método Neighbor-Joining a partir das
estimativas de distâncias evolutivas baseadas nos modelos de substituição nucleotídica
(Kimura-Dois-Parâmetros). Frequências haplotípicas, índices de diversidade molecular e
parâmetros populacionais (FST) recomendados na literatura para sequências barcode podem
ser obtidos com o auxílio do programa Arlequin ver 3.5.1.3 (Excoffier e Lischer, 2010).

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A utilização de barcode genético pode ter várias aplicações, incluindo a identificação

de espécies em amostras ambientais, a detecção de espécies invasoras, o monitoramento de
espécies ameaçadas, a identificação de espécies em produtos comercializados, entre outras.

3
O protocolo está de acordo com as instruções disponíveis no Laboratório Multiusuário de Estudos
em Biologia (LAMEB UFSC)
 25

Uma das principais vantagens dos barcodes genéticos é a sua alta eficiência e precisão
na identificação de espécies, mesmo em amostras complexas ou em estágios de
desenvolvimento diferentes. Além disso, a utilização de barcodes genéticos pode ser menos
invasiva e mais rápida do que outros métodos de identificação, como a análise morfológica.

No entanto, existem alguns desafios na utilização de barcodes genéticos. A primeira

delas é a escolha da sequência adequada para o barcode, que deve ser altamente conservada
dentro da espécie, mas altamente divergente entre as espécies. Além disso, a variabilidade
genética pode ser limitada em alguns grupos taxonômicos, o que pode dificultar a
identificação precisa.

Outro desafio é a interpretação dos dados gerados a partir dos barcodes genéticos. É
importante que as sequências sejam comparadas com bancos de dados acurados e anotados,
para evitar erros na identificação. Também é necessário considerar as limitações da tecnologia
de sequenciamento, que pode levar a erros de leitura ou a mistura de sequências de diferentes
espécies em amostras complexas.

Estudos com barcode representam uma abordagem promissora e eficiente para a

identificação de espécies, mas sua utilização deve ser cuidadosamente planejada e
interpretada, para evitar erros e maximizar sua precisão e utilidade.

Busca-se, otimizar os protocolos que possam ser utilizados para identificação de

animais que são forçados a participar de eventos alusivos à farra do boi pelos órgãos
fiscalizatórios e auxiliá-los neste processo. Espera-se que, a partir das amostras coletadas, seja
possível utilizar os marcadores genéticos de bovinos, da espécie Bos taurus, para identificar o
animal, os farristas e outros participantes, buscando auxiliar no desenvolvimento de uma nova
metodologia de extração de DNA para identificação pelo método barcode. Por fim, busca-se
fornecer às autoridades policiais e periciais protocolos a fim de identificar eventos em que há
a participação dos animais submetidos às situações desgastantes e cruéis, sendo uma das
poucas bibliografias que se tem na área atualmente.
 26

REFERÊNCIAS

EXCOFFIER, Laurent; LISCHER, Heidi EL. Arlequin suite ver 3.5 a new series of
programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows. Molecular
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 28

ANEXOS

ANEXO 1. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO MEEKER ET AL (2007)

1. Ligar a estufa a 95o C ou programa no termociclador (ajustar volume para máximo de

200μL).
2. Secar as amostras.
3. Nomear tubos novos de 1,5 mL.
4. Colocar um fragmento (pequeno) da amostra em cada tubo
5. Adicionar aos tubos 300 μL a 200 μL de NaOH [50 Mm]
6. Incubar por 30 minutos a 95o C
7. Colocar os tubos em uma grade gelada, sobre placa de gelo na geladeira a 4 oC por 5
minutos.
8. Adicionar 20 μL de TRIS HCl [1M] ph 7,5.
9. Agitar as amostras cuidadosamente
10. Centrifugar a 1300 rpm por 3 minutos.
11. Retirar o sobrenadante.
12. Quantificar o DNA
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ANEXO 2. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA DE SANGUE POR PROTOCOLO “SALTING OUT”

Material Necessário Amostras de Buffy Coat; Solução Lise I; Solução Lise II; SDS 10%;
Perclorato de sódio (5 M); Solução saturada de NaCl (6M); Álcool Isopropílico; Etanol 70%;
Microtubos estéreis (1,5 ml); Micropipetas; Ponteiras com barreiras; Caneta para microtubo.

1. Escrever as especificações de cada amostra em um novo microtubo estéril pois ao

longo da extração haverá a transferência de microtubos
2. Transferir 100 μL de buffy coat para um microtubo de 1,5mL
3. Adicionar 1 mL da Solução de Lise I e homogenize invertendo
4. Centrifugar a 12000 rpm durante 5 minutos
5. Descartar gentilmente o sobrenadante no vidro de descarte
6. Repetir os passos 2 a 4 até que o precipitado fique claro (no máximo 3x)
7. Adicionar 300 μL de Solução de Lise II, 10 μL de SDS 10% e 75 μL de Perclorato de
Sódio 5M
8. Agitar no vórtex por 10 segundos (atenção para quebrar bem o pellet), caso não
dissolva o pellet pode-se bater levemente o fundo do microtubo na bancada
9. Adicionar 130 μL de NaCl 6M saturado
10. Agitar no vórtex por 10 segundos
11. Centrifugar por 10 minutos a 12000 rpm
12. Identificar novos microtubos para transferir as amostras (realizado no início do
protocolo)
13. Transferir o sobrenadante para os microtubos novos com auxílio de uma micropipeta
de 100 μl (cuidar para retirar somente a fase superior e não entrar em contato com a
outra fase)
14. Adicione 300 μl de Álcool Isopropílico (retirar do congelador no momento do uso)
15. Homogeneizar manualmente através de inversão
16. Centrifugar por 5 minutos a 12000 rpm
17. Descartar o sobrenadante na pia através da inversão do microtubo
18. Adicionar 300 μl Etanol 70%
 30

19. Centrifugar por 5 minutos a 12000 rpm

20. Descartar o sobrenadante na pia através da inversão do microtubo
21. Deixar os microtubos das amostras secando (abertos) dentro da estufa apenas
cobertos por um papel toalha overnight
22. No dia seguinte, adicionar 200 μl de TE e homogeneizar com o auxílio da ponteira
(retirar o TE antes para descongelar completamente)
23. Incubar a 56o C no “banho maria” por 30 minutos
24. Manter as amostras em geladeira overnight
25. Armazenar as amostras a -20o C;
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ANEXO 3. PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA MODIFICADO DE ALJANABI E MARTINEZ (1997)

1. Pegar um fragmento de amostra em álcool e adicionar aproximadamente 50 mg de

fragmento em microtubos de 1,5 ml, individuais e identificados
2. Adicionar 400 μL de solução salina, tampão de lise pH= 8,0 (NaCl 0,4 mol/L; Tris HCL 10
mmol/L e EDTA 2 mmol/L)
3. Adicionar 60 μl de SDS 10% e 8 μL de Proteinase K 20 mg/mL
4. Agitar levemente a amostra e incubar por no mínimo 3 horas (máximo 12 horas) a 55° C;
5. Adicionar 300 μL de NaCl 6 mol/L ou 5 mol/L e agitar em vortex por 30 s em velocidade
máxima;
6. Centrifugar por 30 minutos a 13.000 rpm em microcentrífuga;
7. Identificar novos microtubos de 1,5 mL;
8. Transferir o sobrenadante de cada amostra para outro microtubos devidamente
identificado;
9. Adicionar ao sobrenadante o mesmo volume de isopropanol gelado;
10. Agitar cuidadosamente o microtubo contendo as amostras;
11. Armazenar em freezer a -20°C por 12 horas (ou no mínimo 3 horas);
12. Centrifugar o microtubo contendo as amostras por 10 minutos a 11.000 rpm;
13. Adicionar 300 μL de etanol 70% gelado;
14. Centrifugar novamente por 10 minutos a 11.000 rpm e verter o sobrenadante;
15. Adicionar ao pellet 300 μl de etanol 100% e em seguida centrifugar;
16. Verter o sobrenadante e deixar o pellet secar em temperatura ambiente;
17. Depois de seco adicionar 40 μl de água Mili-Q e 10 μl de RNAse (geladeira). Se o pellet for
grande, colocar 90 μl de água Mili-Q e 10 μl de RNAse;
18. Deixar o DNA em estufa por 37° C por 2 horas;
19. Deixar o DNA aproximadamente 4 horas na bancada para eluir e após guardar no freezer;
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ANEXO 4. QUANTIFICAÇÃO DE DNA COM NANOVUE

Uma vez que o LAPOGE não tem o equipamento é preciso utilizar de outros laboratórios, por
isso depois de agendado horário para utilização do equipamento, deve-se
1. Separar as amostras em uma caixinha de isopor com gelo em gel, levar luvas, jaleco,
caneta, folha e água MiliQ, pipeta de 10 uL e ponteiras;
2. No laboratório com o aparelho ligar o Nanovue, tirar o papel do leitor e colocar 2 μL
de água para calibragem.
3. Pipetar 2 μL de amostra no leitor e anotar o valor. A concentração aparecerá na tela.
4. Repetir 3 vezes para ter certeza.
5. Logo após a leitura, limpar com papel e adicionar a água MiliQ. Quando finalizar,
desligar o equipamento e tapar o leitor com papel.
 33

ANEXO 5. REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE – PCR

 primer F 1,5 μL
 Primer R 1,5 μL
 Mix Taq polimerase 25 μL com 1U Taq
 DNA template 2 μL
 Água MiliQ 20 μL

Depois de adicionar os reagentes para formar o Mix, adicionar as amostras de DNA em cada
microtubo correspondente. Misturar soluções com a amostra e levar ao termociclador com a
seguinte programação

Desnaturação 94o C por 4 min

Anelamento
94o C por 30 s
57o C por 45 s
72o C por 45 s (7 ciclos baixando 1o C por ciclo)
Extensão
94o C por 30 s
50o C por 45 s (30 ciclos)
72o C por 45 s
Final 72o C por 5 min
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ANEXO 6. GEL DE AGAROSE E ELETROFORESE

Para um gel com “cama” de 20 mL e preciso Agarose; TBE; becker vidro; Micro-ondas para
reagentes

Diluição do TBE Diluir o TBE que está na concentração 10% para 0,5% acrescentando água
destilada. São necessários 50 mL de TBE 10% para misturar com 950 mL de água destilada
para diluí-lo para a concentração de 0,5% que é a necessária para o estudo.

Produção do gel (agarose 1%)

● 20 mL de solução TBE (diluída a 0,5%) e 0,2 g de agarose 20 ml
● Misturar TBE e agarose em um becker e aquecer no micro-ondas de 10 em 10
segundos até dissolver e ficar transparente. Montar a forma com o pente para o
número de amostras; Despejar a mistura na forma de uma só vez para não criar
bolhas; Esperar gelificar (em torno de 30 min)
● Corrida eletroforética usar solução carreadora de 0,5 ul para cada amostra mais 0,5
μL de Gel Red, com volume final de 3 μL (1 μLl do mix + 2 μL de cada amostra por
poço)
● Correr durante 40 minutos em 90 V em solução tampão TAE

Visualização leitura do gel feita em fotodocumentador