CAPITULO 2: MELHORAMENTO DE PLANTAS VISANDO A RESISTE PATOGENOS Liane Bat Caroline Marq Arione da Sil 'EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecudria, Centro de Pesquisa Agropecudria de Clima 1 Rio Grande do Sul, Brasil 2UFPel - Universidade Federal de Pelotas, Programa de Pés-Graduagao em Agronomia. INTRODUCAO A populacgéo mundial mais do que dobrou nos ultimos estima-se que passara de nove bilhdes em 2050 (FAO 2010). | aumento populacional exige um aumento constante da produ¢: a qual vem sendo dificultada pelas alteragdes climaticas e 0 su novas doengas, assim como alteragdes genéticas nos patogenos na perda de fontes de resisténcia anteriormente eficazes. Perdas substanciais decorrentes da incidéncia de fungos e como, por exemplo, a brusone (Magnaporthe oryzae) em atroz, do colmo (Puccinia graminis f. sp. tritici ) em trigo, 0 carva maydis) em milho, a requeima (Phytophthora infestans) em ferrugem asiatica (Phakospora pachyrhizi) em soja, representam | atual e crescente 4 seguranga alimentar. Estima-se que estas pe suficientes para alimentar, no minimo, 8,5% da populagao atu em mais de sete bilhdes de pessoas (FISHER et al., 2012). Problemas sérios podem ocorrer quando cultivares susceti cultura séo atacadas por patogenos agressivos e virulentos, en favoraveis para 0 desenvolvimento da doenga. Em circunstanciz podem ocorrer epidemias devastadoras como aconteceu na Irlan quando cerca de 80% dos campos de batata foram perdidos devidcEm 1999, uma nova raga altamente virulenta do fung graminis f. sp. tritici, denominada Ug99, foi encontrada em raga Ug99 é capaz de suplantar todos os genes de resisténcia dz comerciais de trigo atualmente cultivadas e tem se disseminado 1 no continente Africano e na Asia (AYLIFFE et al., 2008; STI 2015). Outra séria ameaga a seguranca alimentar, especialment em desenvolvimento, é o mal-do-Panama, causado por Fusarium f. sp. cubense, uma doenga endémica de todas as regides pr banana do mundo e o melhor meio para o controle consiste na u cultivares resistentes (BUTLER 2013). Recentemente, alguns estudos tém mostrado que, n¢ ferrugem asidtica da soja foi responsavel por 37-67% da produgao (KUMUDINI et al., 2008). Desde o seu surgimento en doenga causou perda de rendimento de mais de 10 bilhdes de « os produtores de soja no Brasil (LANGENBACH et al., 2016). perdas devido a ferrugem asiatica da soja chegaram a 80%. | quantidade de fungicidas, com efeitos econédmicos e ambientai: seria economizada, nos campos de soja, se cultivares resistentes disponiveis (BOREM; FRITSCHE-NETO 2012). Esses exemplos destacam a necessidade sempre preset melhor compreensao das interagdes planta-patogeno e a maneil este conhecimento pode ser aplicado em estratégias de me visando a uma resisténcia duravel e efetiva. Talvez a mais reconhecida contribuigado do melhoramento ¢ seja a criacao de cultivares resistentes a doengas. Em algumas cu o unico meio de controle disponivel, além de ser o mais econémi impacto ambiental e facil adogéo pelos produtores (LOPES; 2012). Algumas viroses de grande importancia, pelos elevados pi causam, somente so controladas pelo uso de cultivares resisten fitopatogénicos, de grande capacidade virulenta e alta variabilida enamente nideram cer cantraladne ande a deernherta de fantec dede cultivares resistentes é necessario estabelecer seus objetivo levantamento prévio das doengas que ocorrem na cultura e segundo os danos econémicos causados. Para se obter sucesso, é f ter variabilidade genética e fontes de resisténcia disponiveis, complexidade da heranga da resisténcia, além de dispor de u eficiente de melhoramento onde ensaios para a resisténcia a do integrados com outros caracteres agrondmicos importantes (BRC Este capitulo nao pretende esgotar 0 tema proposto, ma para um maior conhecimento sobre as etapas basicas de um p melhoramento, visando a obtengao e utilizagéo de cultivares compreendendo a identificagdéo de fontes de resisténcia disy germoplasma da espécie, a selegaéo do método de melhora incorporagao da resisténcia em cultivares comerciais, assin melhores estratégias de incorporacao destes genes de resisténc a partir do conhecimento da estrutura genética e do potencial ev das populacées patogénicas. Este capitulo aborda também progressos em relagao a utilizagdo de selegao assistida por mz desenvolvimento de cultivares transgénicas, cisgénicas e 0 ini promissora nova era para o desenvolvimento de resisténcia a fit através do uso de tecnologias de edigao gendmica. 1 FONTES DE RESISTENCIA A disponibilidade de fontes adequadas de genes de r um pré-requisito basico para programas de melhoramento que objetivo desenvolver cultivares mais resistentes a patogenos. A genotipos a serem utilizados como doadores esta diretamente com 0 sucesso do programa e, por isso, ¢ fundamental uma escoll dos genitores a serem recombinados (cruzados). Em plantas ct quatro importantes grupos de fontes de genes de resisténci: on denmann do peemantlngwra nan iting ailemeteas a euitapmoa1.1 Cultivares elite Genes de resisténcia a patogenos encontrados em lint cultivares de alto potencial produtivo sao os mais visados. I de resisténcia apresentam a vantagem de ja serem adaptadas. caracteristicas agronémicas favoraveis e baixa frequéncia indesejaveis. 1.2 Colegdes de germoplasma Uma das principais fontes potenciais de genes de res: espécies cultivadas sao as colegdes de germoplasma. Quand novas doengas ou novas ragas de um patégeno ja consolida na diversidade do germoplasma, representada nas colegGes n plantas cultivadas, tem conseguido localizar fontes adequadas de (ALLARD 1999). Ha muito tempo que os programas de melhoramento fa bancos de germoplasma, especialmente na introgressio de ca qualitativas de interesse econémico. Dentre os exemplos mais | grande parte refere-se 4 introgressdo de genes de resisténcia « patdgenos, oriundos de cultivares tradicionais ou de parentes sil\ linhagens elite agronomicamente adaptadas (FERREIRA; RAN! Como exemplo, a resisténcia para 0 nematoide de cisto da soja ( glycines), atualmente incorporada em diversas cultivares é predominantemente derivada de dois gendtipos, ‘Peking’ « (MITCHUM 2016). Além disso, o acesso PI 88788 também foi com resisténcia ao virus do mosaico da soja (Soybean mosaic vi (GUNDUZ et al., 2004). A conservagao da variabilidade genética em bancos de ger muito importante para garantir que genes de resisténcia nao seja Além da conservacao, também é importante a caracterizacao danovas fontes de resisténcia e marcadores moleculares as resisténcia genética de plantas tém sido identificados e, conseq! melhor explorados. Estudos de associagaéo gendmica ampla (g association studies - GWAS) tém possibilitado avaliar 0 germopI: global a fim de explorar a variabilidade genética disponivel em p melhoramento. Alguns exemplos de genes e regides gendmicas com resisténcia identificados através de GWAS incluem: a ferrugem do colmo em trigo (YU et al., 2011; BAJGAIN et resisténcia 4 helmintosporiose (Exserohilum turcicum) (DING « e ferrugem comum em milho (Puccinia sorghi) (OQLUKOLU e resisténcia 4 brusone (RABOIN et al., 2016) e a Xanthomonas oryzae em arroz (DILLA-ERMITA etal., 2017), assim como a cai de locos de resisténcia a varias patégenos em soja (CHANG et a 1.3 Espécies silvestres As espécies silvestres afins as plantas cultivadas consti’ se denomina parentes silvestres de tais plantas. Estas espécies, distribuidas e se desenvolverem em uma ampla diversidade de I fontes importantes de genes de resisténcia a diferentes estresse abidticos. No entanto, a utilizagféo de fontes silvestres nao é principalmente em fungao de problemas relacionados coma incom de cruzamento, esterilidade do hibrido, além da ligagao de diverse indesejaveis com os desejaveis (linkage drag), 0 que dificulta o : Mesmocomesta potencial dificuldade de uso direto desse ge as espécies silvestres sAo protagonistas como fontes de re importantes patogenos. Um exemplo classico de caracteristica de espécie silvestre para uma cultivada foi a resisténcia a PI infestans em batata, obtida pela introgressao de genes de Solanun uma espécie silvestre encontrada no México. Desde a grande foespecifica dos genes R/ a R// (PEREIRA et al., 2012). Além de S uma ampla gama de espécies silvestres de batata tem sido identi! fontes potenciais de genes de resisténcia. Cientistas do CIMMYT (/nternational Maize and Wheat lr Center) tém feito cruzamentos envolvendo Triticum durum silvestres desde 0 inicio da década de 1990. Tais cruzamentos té em materiais sintéticos, que podem ser facilmente cruzados cor melhoradas para que novos genes tteis sejam incorporados, gar exemplo, resisténcia 4 septoriose (Parastagonospora nodorum) ou fusariose da espiga do trigo (Fusarium graminearum specic (CIMMYT 2004). Outros exemplos de alelos de resisténcia ident germoplasma silvestre e utilizados com sucesso no melhorament como 0 trigo, a cevada e 0 centeio, so encontrados em Feuillet e 1.4 Mutagdes Quando fontes de resisténcia nao estao disponiveis no ge uma alternativa consiste na inducaéo de resisténcia media mutagénicos em plantas. A baixa taxa de ocorréncia da mutacdo natural pode s através da exposigdo de material vegetal (sementes, estacas, | provenientes da cultura de tecidos) a agentes mutagénicos (XI 2015). Varios agentes mutagénicos sdo utilizados para este podem ser divididos em dois grupos principais: mutagénicos fisic radiagdes gama, radiagao ultravioleta) e mutagénicos quimicos EMS (etilmetanossulfonato), MMS (metilmetanossulfonato)) 2015). Um exemplo classico de mutacao identificando uma v: de resisténcia ¢ o gene MLO, que confere resisténcia de ampl« Blumeria graminis f.sp hordei em cevada. O primeiro mutant identificado com resisténcia a oidio foi induzido artificialmente pO gene MLO é amplamente conservado em vegetai negativamente as respostas de defesa da planta. Mutantes rece o gene MLO conferem resisténcia duravel e de amplo espectro isolados do fungo Blumeria graminis f.sp hordei (ACEVEDO-' al., 2014). O alelo MLO-1// introgredido no pool génico de cevad confere resisténcia raga nao especifica 4 B. graminis f.sp hordei. mantido robusta e duravel ha mais de 30 anos (JORGENSEN 19 2 EVOLUGAO DO PATOGENO EM RESPOSTA 1 DE RESISTENCIA DE PLANTAS A DOENCAS A supressao da resisténcia genética por populagées de | um dos maiores desafios no controle genético de doengas (PALI 2009). Para compreender os processos que levam a suplantaga de resisténcia, é necessario um melhor entendimento dos pri governam a evolugao do patogeno. Populagdes de patdgenos c potencial evolucionario sao mais propensas a suplantar genes de em relacdo a populagées de patdgenos com um baixo potencial ev: Além disso, oferecem os maiores riscos de evoluir e neutra medidas de controle, tais como aplicagées de fungicidas. O potencial evolutivo de uma populagao do patégeno se sua estrutura genética populacional, ou seja, na quantidade e da variagado genética entre e dentro de populagdes (McDONAI 2002a). A estrutura genética de uma populagao é determinada pela evolutiva, consequéncia das interagGes entre as cinco forcgas evi que afetam as populagées do patégeno: mutagao, tamanho de e deriva genética, fluxo génico, reprodugao e sistema de acas selegdo. Assim, para o desenvolvimento de estratégias de uso «exemplificagdo, cada forga sera considerada individualmente. natureza, todas interagem para determinar o curso da evolugao e estrutura genética de populagées de patogenos. 2.1 Mutagao Dentre as forgas evolutivas, a mutagdo é a unica cap variabilidade genética. Mutagdes sao alteragdes na sequéncia « DNA por meio de substituigao de uma base por outra, ou por me: ou delecgéo de um ou muitos pares de bases. Mutagdes adicio ocorrer por amplificagdéo de um segmento particular de DNA e cépias, por insergao ou excisado de elementos transponiveis e por um segmento de DNA (AGRIOS 2005). As mutag6es ocorrem devido a erros na replicag¢éo do DN podem ocorrer tanto na meiose (individuos de reprodugao sexuc na mitose (individuos de reprodugao assexuada). Desta forma. é a fonte de introdugdo de novos alelos em populagées patog processo que origina novas estirpes virulentas do patogeno qu« a resisténcia de genes maiores, assim como origina estirpes agressividade que podem erodir a resisténcia quantitativa (Mc LINDE 2002b). Taxas de mutagao sao geralmente baixas, embora pos entre regides gendmicas e patogenos (STUKENBROCK; M 2008). Uma mutacado que ocorre isoladamente de outras forgas provavelmente nao ocorreria a uma taxa suficientemente alta ps alteragdes detectaveis nas frequéncias alélicas, ou seja, nao de causar suplantagdo da resisténcia. No entanto, quando é acompanhada de selegao direcional, mutantes virulentos rapidamente em frequéncia e provocam a perda da eficacia | resisténcia. Tamanhos populacionaigs maiores tornam mais ptcom altas taxas de mutagdo apresentam maior risco de supl de resisténcia do que patogenos com baixas taxas de mutaca maior probabilidade da presenga de mutagao de aviruléncia par (McDONALD; LINDE 2002a). 2.2 Tamanho de popula¢ao e deriva genética O tamanho da populagao afeta a frequéncia de sobrev individuos mutantes e, consequentemente, a diversidade d« populagao. Populagées de patégenos em uma determinada rez muitas vezes nao sao suficientemente grandes para garanti individuo possua progénie na proxima geracao. Desta form eventos aleatérios que influenciam a frequéncia alélica, pr conhecido como deriva genética (AGRIOS 2005). Quanto menor o tamanho da popula¢ao, maior o efeite Eventos de deriva séo numerosos em fitopatogenos, especialme infectam culturas anuais, uma vez que ocorrem redugées severas da populagao do patégeno quando a sua fonte de alimento processo denominado efeito de gargalo (bottlenecks). Além dis podem ocorrer eventos fundadores, onde uma nova populacao 1 partir de um pequeno numero de individuos (LINDE 2010). A deriva genética leva a fixagao de alelos ou gendtipos nas e, portanto, tende a diminuir os niveis de variagdo genética total Populacgdes de patoégenos com grande tamanho efetivo tendem : menor deriva genética e, como consequéncia, maior variabilida (mais alelos) e maior estabilidade ao longo do tempo (ZHAN 20 Com relagao ao efeito de fundador, este ocorre frequentem um patogeno é introduzido em uma nova area acidentalment resultado de uma violagao de quarentena (McDONALD; LINDE 9NQ2LKhiwn nAaAnirnvizinhas, além de, indiretamente, reduzir as chances de acase individuos relacionados e, consequentemente, aumentar o tama de populagdes patogénicas e a capacidade evolucionaria de (ZHAN et al., 2015). O fluxo génico é um processo no qual alelos particula ou individuos (gendtipos), sAo trocados entre populacgdes geog separadas. Para patogenos estritamente assexuados, ou seja, aque recombinam genes, genotipos inteiros podem ser trocados entre as (McDONALD; LINDE 2002b; AGRIOS 2005). O fluxo génic barreiras que poderiam isolar populagées, sendo de grande rele introdugdo de novas variagdes genéticas em campos agricolas « local da mutagao inicial. Fluxo génico e/ou fluxo de gendtipos é 0 processo que 1 mutantes virulentos e gendétipos entre diferentes populagdes Patogenos com elevado fluxo génico representam maior ris patogenos com baixo fluxo de genes, devido ao aumento do tamz da populagio pelo fluxo de genes entre populag6es vizinhas (AGE O fluxo de genes envolvendo propagulos assexuados genotipos) representa maior risco do que o movimento de sexuais (fluxo de genes). Propagulos assexuais representam um genes coadaptados que apresentam elevado nivel de aptidao ao « origem da cultura. Por outro lado, propagulos sexuais represe combinagées de alelos que ainda nao foram testados no aml serao introduzidas por fluxo génico (McDONALD; LINDE 2 exemplo drastico de fluxo génico foi o movimento de um ou al do patégeno Phytophthora infestans do México para os Estados 1843, em seguida, para a Europa em 1845 e, posteriormente, mundo na década de 1850 (GOODWIN et al., 1994). 2.4 Reproducao e sistema de acasalamentoO potencial evolucionario de uma populagaio esta correlacionado com a extensao da recombinagao. Patogenos com sexuada obtém rapidamente novas combinagées de alelos, levan genotipos diferentes nas populagées e, assim, apresentam maior de suplantar os mecanismos de resisténcia do hospedeiro. Em cc patégenos que possuem reproducao assexuada tendem a manter c existentes de genes, levando a uma menor diversidade gen populagdes (BARRET et al., 2008). A reprodugao assexuada, : a endogamia regular, também apresenta vantagens para o pat tendem a produzir linhagens clonais, com blocos de alelos ligadc um complexo de genes coadaptados, que permanecem unidos « amplamente disseminados (McDONALD; LINDE 2002b). Patégenos com sistema de reproducgdo misto apresentam elevados, pois potencialmente se beneficiam das vantagens inerer tipos de reprodugao (sexuada e assexuada). Durante o ciclo se novas combinagées de alelos (gendtipos) s4o originadas por rec A recombinagao permite que novas combinagées de alelos sejan e testadas em novos ambientes. Combinagées de alelos mais ad mantidas através de reprodugao assexuada e podem aumentar su em clones selecionados. A distribuigéo espacial e temporal da clonais dentro e entre populagdes dependera principalmente d de dispersao dos propagulos assexuados, desta forma, se 0 espc ou propagulo é capaz de dispersdo de longa distancia, os clones aptidio podem ser distribuidos por uma ampla area através « genotipos, causando epidemias (McDONALD; LINDE 2002a). 2.5 Selecdo Selegdo é a principal forga que impulsiona mudangas nas de alelos mutantes. A forte selegdo direcional, que ocorre quan de resisténcia principal (receptor) torna-se amplamente distribuiPopulagées de patogenos que sao expostas a forte selecao d longo de varias geragdes representam um risco maior do que as que, devido a resisténcia parcial, sio expostas 4 selegdo mai agroecossistemas compostos por genes de resisténcia individua monoculturas geneticamente uniformes, exercem forte selegac na populagao do patégeno. Por outro lado, os agroecossisteme por misturas de genes de resisténcia, ou rotagdo de genes atravé e espago, irao reduzir a eficiéncia de selegdo e diminuir a fre mutantes virulentos (McDONALD; LINDE 2002b; ZHAN et al. 3 METODOS DE MELHORAMENTO DE PLANT/ RESISTENCIA A DOENCAS O melhoramento para resisténcia a doengas nao difere talmente do melhoramento para outros caracteres. Consequenter quer dos diversos métodos de melhoramento apropriados para a questo podem ser utilizados para desenvolver cultivares com 1 doengas (ALLARD 1999). A escolha do melhor método de sele consideragao, principalmente, a natureza genética da resisténcia tiva ou quantitativa, e o tipo de reprodugao do hospedeiro, se a alogama (AGRIOS 2005; CAMARGO 2011). 3.1 Melhoramento visando 4 resisténcia qualitativa A resisténcia qualitativa esta associada com a _ hat genes maiores controlarem a infeccéo causada por ragas est patogeno. Para transferéncia de resisténcia qualitativa, o retro é 0 método de melhoramento mais utilizado. Consiste na i de um carater alvo (resisténcia a doenga) controlado por um genes, geralmente provenientes de uma espécie silvestre (doad wanhtinnan alitea altamanta adarntadan feacrantar) danaminadan «aniterecorrente, exceto para uma ou poucas caracteristicas c insatisfatorias, as quais o melhorista procura transferir a parti doador. O esquema classico deste método inicia-se com 0 cruza 0 genitor recorrente e o doador, resultando no hibrido F1. Indivic possuem a resisténcia do genitor doador sao selecionados e re com o genitor recorrente em sucessivas geragdes (BOREM; 2013). A cada ciclo de selecao, a proporgéo do genoma do genite progénie vai diminuindo, até que apés varios ciclos, em geral cit genotipo resultante possua as caracteristicas desejaveis do genito e aresisténcia do genitor doador. A transferéncia de alelos dominantes é realizada mais dirs que a de alelos recessivos. Se o alelo em transferéncia for domina classes fenotipicas: resistente e suscetivel, neste caso, somente \ a autofecundagao da progénie do ultimo retrocruzamento par: os gendtipos nao segregantes. Se o alelo a ser transferido for re apenas fendtipos suscetiveis, sendo necessarias autofecundagées aos retrocruzamentos, para identificar as plantas que serao de quais serao retrocruzadas ao genitor recorrente (CAIXETA; Z. 2014). Mais recentemente, marcadores moleculares associad de resisténcia tém sido utilizados na selegao. Assumindo que de DNA podem prever com seguranca o fendtipo, a selecao a marcadores (MAS — marker-assisted selection) pode substituir 0 screening de germoplasma para resisténcia a doengas. Ao detern do marcador de DNA, plantas que possuem determinados gene: identificadas baseadas no gendtipo em vez do fendtipo (RAGIN al., 2013). O uso de marcadores moleculares para selecionar ur minimiza o arraste de ligacao (linkage drag) e acelera a rect ge a SACITno melhoramento por retrocruzamento. A cada ciclo de retroc marcadores moleculares podem ser utilizados para identificar o ge 0 carater desejado (foreground selection), ou para acelerar a r do gendtipo do genitor recorrente (background selection), e selecionar a progénie de retrocruzamento com 0 gene alvo com flanqueadores fortemente ligados a fim de minimizar o arraste (recombinant selection) (RAGIMEKULA et al., 2013). Exemplos de retrocruzamento assistido por marcador a resisténcia a doengas em cereais, como cevada, arroz e trigo. encontrados em Collard & Mackil (2008). O retrocruzamento ta ser utilizado para a transferéncia de mais de um gene simultane< exemplo é 0 piramidamento de genes (ver item 4.3). Para a piramidagao de genes, varios cruzamentos sao feitos « Fl resultantes séo cruzados entre si. A descendéncia deste é novamente cruzada entre si e este processo ¢ assim continu: os genes de interesse estejam combinados em um tinico gen¢ forma, genes de resisténcia de varias fontes séo combinados er individuais (HUSSAIN 2015). Piramidar miultiplos genes de resisténcia através do me convencional é possivel, mas extremamente dificil. Quando d genes sao introgredidos, com avaliagaéo fenotipica convencic possivel distinguir com preciso o efeito individual de gene, u cada gene pode conferir resisténcia para multiplas ragas do patd disso, na presenga de um alelo dominante e um recessivo, o efe recessivo é mascarado (COLLARD; MACKILL 2008). Com 0 uso de marcadores de DNA estreitamente associ: um dos genes de resisténcia ¢ possivel facilmente identificar as | miultiplos genes, resultando em economia de tempo e recurso: et al., 2010). Em teoria, MAS pode também ser utilizada para } de genes de miltiplos genitores (ex: populagées derivadas d ornizamentne) Ontra ectratécia nramicenra nara non decenyvnl:Fatores como o numero de genes a ser transferido, a distar genes alvo e marcadores flanqueadores, o numero de genotipos s em cada geracao de melhoramento e a natureza do germoplasma para obter sucesso na piramidagado de genes de resisténcia (A! al., 2015). Alguns exemplos de piramidagao baseada em MAS podem ser encontrados em Collard & Mackil (2008). Quando, através do retrocruzamento, os genes sao independentemente para uma mesma cultivar recorrente, obtém-s quase isogénicas, cada uma contendo um gene diferente de resist genes podem ser combinados em uma unica cultivar (piramidar também podem ser mantidos em linhagens separadas, que sera em misturas, dando origem as multilinhas (ver item 4.4). 3.2 Melhoramento visando 4 resisténcia quantitativa A resisténcia quantitativa é controlada por miltiplos gen menor na planta, promovendo resisténcia parcial ao patog diminuigao na severidade de sintomas e/ou no progresso das ey longo do tempo (St.CLAIR 2010). Os métodos de melhoramento para resisténcia quant diferem dos demais métodos para outros caracteres agrondmicos quantitativa. O melhoramento é obtido através do acimulo gradt favoraveis nos varios genes que controlam o carater. Por ser por muitos genes, qualquer método adotado prevé a selecao herdabilidade e com influéncia do ambiente, especialmente quz presenga de genes maiores (CAMARGO 2011). Para selegdo em espécies aldgamas, os métodos de seleg: de familias sao os mais utilizados visando a acumular genes de A selegao massal é 0 método de introducao mais simples, onde o: mais resistentes sao selecionados e suas sementes sao colhidas, dando origem a uma nova populacao (AGRIOS 2005). O processfrequéncia, jd que a selegao é feita apenas com base no fenotipo (C, et al., 2008). Na selegdo de familias (progénies), ao contrario, as selecionadas baseadas nas reacdes de suas progénies. As semente cujas progénies mostraram-se mais resistentes sao usadas no pr de selegao. Em espécies autogamas, os métodos de selecdo mais util resisténcia quantitativa sao o genealdgico (Pedigree) e o populaci No método genealégico, uma populagéo F, é estabel melhores individuos sao selecionados para os caracteres desejado resisténcia a doengas. Estas plantas séo autofecundadas, geran F,, que serao avaliadas no campo. A sclegao, a partir desta ger tanto dentro de familias, como entre familias. As sementes selec: compor a geraco F,. A selecao entre e dentro de familias é repe o nivel de homozigose desejado seja obtido. Quanto aos tipos nas geragdes iniciais a selecéo 6 com énfase em caracteres facilmente visualizados, enquanto nas geragdes mais avangada que aumenta a homozigose, a selecdo tem énfase em caracteres q (BOREM; MIRANDA 2013). O método populacional difere do genealdgico, pois nenht artificial é feita nas geracgdes segregantes iniciais e a colheita em bulk. Em geragdes avangadas, quando a maioria das plan homozigose, plantas individuais sao selecionadas para resis suas progénies avaliadas da mesma forma que no meétodo | (CARVALHO et al., 2008). Dada a extensdo e complexidade da selegao requerida, b numero eo tamanho de populacées a serem avaliadas, marcadores1 podem ser utilizados em qualquer fase do programa de me Consequentemente, MAS apresenta grande vantagem em gera¢: porque plantas com combinagées de genes indesejaveis, espec que nao apresentam genes de resisténcia, podem ser eliminadas. | cened an OTT « de recieténcia can ecelecinnadac e alelagc nadem cetMACKILL 2008; RAGIMEKULA et al., 2013). Ribaut & Betran (1999) propuseram 0 uso de MAS e iniciais, F, ou F,, originadas de genitores elite, através de um denominada “selecao unica em larga escala”. Esta aborda: marcadores que flanqueiam até trés QTLs. Estes QTLs devem exy proporcdo da variacao fenotipica, além de serem estaveis en ambientes (COLLARD; MACKILL 2008). Dentre as vantagens da selecdo precoce assistida por mar a que os alelos favoraveis dos QTLs de interesse sao fixados n iniciais (F,/F,). Como a seleg&o ocorre somente nas regides alvo, grande variagao alélica ainda estara presente no restante dos gendtipos selecionados, para ser explorada por selegao fenot disso, alelos dos QTLs de maior efeito podem também ser u piramidagao de genes (RIBAUT; BETRAN 1999). A ESTRATEGIAS DE UTILITAGAO DE GENES DE RES DE PLANTAS A DOENCAS Para retardar a evolugao do patdgeno, as estratégias de us de resisténcia de plantas visando a resisténcia duravel foca aumento da diversidade de genes, como de genotipos. A disponibilidade de mais de uma fonte de resisténcia uso de estratégias de implantag4o tanto em escala temporal quar Dentre estas estratégias, destacam-se 0 uso do gene de resist ruptura da resisténcia conferida e sua substituigéo por um no resisténcia (genes R individuais); a alternancia periddica de difer de resisténcia no mesmo local (rotagao de genes); a introgressi genes de resisténcia na mesma planta (piramidagao) e 0 uso d genes de resisténcia em diferentes gendtipos no mesmo local |4.1 Um gene de cada vez (Genes R individuais) Células de plantas mantém constante vigilancia contre através da expressio de uma ampla gama de genes R, os quai proteinas capazes de detectar a presenca de patogenos. Em muitc unico gene R pode conferir resisténcia completa a uma ou mais | patogeno, quando transferido para uma cultivar anteriormente Por esta razéo, genes R tém sido utilizados ha décadas em pr melhoramento visando a resisténcia de plantas a doengas (MC WOFFENDEN 2003). Embora em um programa de melhoramento seja mais faci genes R individuais, a desvantagem esta na vulnerabilidade a d novas racas do patogeno. Analises epidemioldgicas e de patoge patégenos para um grande numero de culturas onde genes R controlam doengas fiingicas, como para a ferrugem do colmo requeima em batata, o oidio em cevada e a canela-preta em cano uma tendéncia do uso desta estratégia em promover a prote: periodo limitado de tempo (BURDON et al., 2014). Porém, en em que a doenga ocorre em severidade baixa 4 moderada um tn resisténcia pode ser adequado por um longo periodo de tempo, ecx recursos para melhoramento de resisténcia duravel para do severas/ frequentes (MUNDT 2014). Quando genes R sao implantados individualmente em w onde uma populagao significativamente grande do patogeno é n presenga de cultivares suscetiveis, sejam cultivares que nao resisténcia, ou cultivares contendo genes de resisténcia que t previamente superados, e/ou hospedeiros alternativos, a prote¢a prazo fornecida sera determinada pelo produto do tamanho populagao, a taxa de mutagao do patogeno e a probabilidade de q mutante sobreviva e aumente em frequéncia na populacao (B/ al., 2008). Por outro lado, devido a forte selegao direcional que v4.2 Rota¢do de genes Rotacgao de genes envolve a implantacgéo de um gene de efetiva, com a sua posterior substituigao por um gene difere aparecimento de uma raga virulenta do patogeno e, no futuro, a da resisténcia original apds o declinio da frequéncia da correspo virulenta (MUNDT 2014). Mesmo que as rotagdes de genes sejam simplesmente re diferentes cultivares da mesma espécie (diferentes genes R), « circunstancias, esta estratégia resulta em niveis inferiores aumentando a longevidade de genes R especificos e apresent: significativas na estrutura de populagao do patogeno (BURDON « O principio deste método é 0 mesmo da rotag4o de cult caso, as cultivares que serao utilizadas na rotagéo possuen resisténcia a diferentes ragas do patégeno. E possivel rotacior no tempo (cada ano ou dois anos realizar a troca do gene R) « (diferentes regides de cultivo). A rotagao de genes apresenta com dificuldades a logistica necesséria para monitorar a virulénci precisa, a concordancia entre todos os agricultores para substitui assim como a disponibilidade de sementes em quantidades ade tal (MUNDT 2014). 4.3 Piramida¢do de genes A piramidagao de genes consiste na introgressao de multip resisténcia em um tnico genotipo de modo a diversificar a pressa sobre o patégeno. A piramidacao pode ser estabelecida com a in genes maiores e menores, genes especificos e nao especificos, : outro tipo de gene que confira resisténcia ao patogeno (BOREM; 2013). Os mecanismos pelo qual a piramidacao aumenta a dureassexuado sofrer mutagéo para viruléncia contra todos os resisténcia piramidados seria 0 produto das probabilidades par: individualmente, assim a probabilidade de surgimento de ume virulenta seria baixa (MUNDT 2014). Teoricamente, multiplos genes R apresentariam maiores ol evolucao do patégeno. No entanto, a extensdo com que isto ocorre entre outros fatores, do tamanho efetivo da populagao do pat frequéncia de muta¢ao dos genes envolvidos (BURDON et al., 2 4.4 Multilinhas Multilinhas sao uma mistura, em proporgdes | estabelecidas, de isolinhas (linhagens quase isogénicas), as qu entre si por possuirem diferentes genes de resisténcia vertical determinado patogeno. As isolinhas sao obtidas através do método de retro sendo que cada isolinha recebe genes de resisténcia a uma ou als predominantes do patogeno. Estas isolinhas séo entaéo mistura a linha resultante é denominada multilinha (HUSSAIN 2015). assim em um mosaico que previne a cultura de adquirir um ur patogénico predominante (FAWKE et al., 2015). Para que a diversidade seja funcional, deve haver uma corre adequada entre os genes de resisténcia incorporados em mult genes de aviruléncia presentes na populagao do patégeno alvo. . matriz de gendtipos do hospedeiro e patdgeno é geralmente c numa tentativa de minimizar a porcentagem da populagao do para a qual uma determinada raga sera virulenta (MUNDT 2002 As multilinhas foram sugeridas como uma alterr minimizacao das perdas decorrentes de doengas causadas pot que apresentam ragas, cuja prevaléncia se modifica de ano pa: multilinhas as plantas resistentes 4 determinada raca se constituque os prejuizos com a doenga sejam diminuidos. Os melhoristas tém desenvolvido muitas cultivares at método, como, por exemplo, o desenvolvimento de multi resisténcia 4 brusone no arroz (ASHKANI et al., 2015). Al melhoramento de multilinhas tem sido relatado como promi desenvolvimento de resisténcia horizontal (MUNDT 2014). 4.5 Mistura de cultivares Mistura de cultivares refere-se a uma mistura espacial hor diferentes genotipos de uma cultura no campo, com um principi multilinhas, visando 4 diminuicdo potencial do inéculo e consti barreira para dispersao do patdgeno. A maior dificuldade no uso de misturas é encontrar um combinagao de cultivares, com ciclo, estadio de desenvolvim culturais e caracteres agronédmicos semelhantes, que permita conjunto (CAMARGO 2011). Em geral ha uma maior adesdo em favor de mistura de c que uso de multilinhas (MUNDT 2002). A mistura de cultivare vantagem de nao necessitar esforgo adicional de melhoramento, a incorporagao de cultivares agronomicamente superiores assit estejam disponiveis. 4.6 Diversificagdo espacial de genes de resisténcia A estratégia de diversificagao espacial de genes de resistén« a diversidade entre campos de cultivo e nado dentro de campos caso das misturas. Segundo esta estratégia, o plantio de cultivar diferentes genes de resisténcia segue um padrao planejado de geografica (CAMARGO 2011). A implantac4o regional de genes de resisténcia é recomet5 ENGENHARIA GENETICA VISANDO A RESISTE PLANTAS A DOENGAS Nas ultimas décadas, os avancgos obtidos na area da genética foram significativos. Desde o desenvolvimento da prim de plantas geneticamente modificadas (plantas transgénicas) recentemente, a automagao do sequenciamento, um novo horiz« com grande potencial para desenvolvimento de plantas resistente Genomas inteiros, tanto de plantas, quanto de patdgenos, sao sé a um baixo custo e em curto periodo de tempo. Estratégias como a identificagéo de efetores conservados no patdgeno, < dos genes R do hospedeiro ativados por estes efetores, tém sic (DANGL et al., 2013). Através do conhecimento do modo de h controle genético de caracteres desejaveis ou indesejaveis, mell conseguido manipular com precisdéo 0 gene que codifica o cara novos fendtipos através do uso de tecnologias de DNA recombit como o uso de ferramentas de edigao do genoma, pela alteragao e precisa do DNA, tem revolucionado o melhoramento genético 5.1 Transgenia A transgenia permite a insergao de genes de espécies nao r em um hospedeiro de interesse. Métodos de transgenia podet miultiplos genes simultaneamente, sem o problema do arraste (linkage drag). Além disso, a transgenia possibilita a transferér piramide de genes de uma cultivar elite para outra de forma dire et al., 2011). Através da transgenia, melhoristas podem manipular con gene que codifica um carater de interesse através da tecnolog recombinante. Os principais métodos utilizados para transfc plantas sao: transformacao via Agrohacterium. bombardedo patogeno, inibindo sua patogenicidade; b) transferéncia « envolvidos no reconhecimento do patogeno; c) transferéncia ¢ proprio patégeno que, uma vez expressos, ativam o sistema d planta (CAMARGO 2011). A clonagem de genes R tem permitido a transferéncia funcionais entre espécies sexualmente incompativeis. Em gera tende a funcionar em espécies pertencentes 4 mesma familia como € 0 caso do gene Bs2 em pimenta (Capsicum annuum), resisténcia efetiva a Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, as da mancha bacteriana em tomate. A maioria dos exemplos fu transferéncia de genes, disponiveis na literatura, sao da familia (WULFF et al., 2011). A transferéncia de genes R entre plantas sexualmente in por meio de transgenia tem sido proposta como uma alternati resisténcia duravel a patogenos. Esta abordagem permite qui alelos do gene R sejam combinados em pirémide (stacks). N¢ transferéncia de genes R entre espécies sexualmente incompe apresentar alguns problemas. A maioria dos genes R efetivament na espécie doadora é perdida no receptor devido 4 supressao (BOYD et al., 2013). Estudos utilizando transgenia para trans genes R revelaram reagées de defesa desencadeadas por genes R do patégeno ou aumento especifico de suscetibilidade a outro: (WULFF et al., 2011). Genes R provavelmente necessitan adicionais para desencadear a sua fungdo, como os que atuam guarda, os quais nao sao encontrados na espécie receptora (Bi 2013). Outro exemplo do uso de transgenia visando 4 resisténci geneticamente modificado desenvolvido pela Embrapa, que é r virus do mosaico dourado (Bean golden mosaic virus), um gran¢ da cultura no Brasil e na América do Sul. Em linhas gerais, ; coenetiramente moadificada nara nme nradinwicee nennuennc fraos fragmentos de RNA podem causar resisténcia a varias estirpe virus (BONFIM et al., 2007; ARAGAO et al., 2013). 5.2 Cisgenia e Intragenia Uma das principais preocupagdes em relagdo ao uso d transgénicas se refere a transferéncia de genes entre espécies nao re ou até mesmo microorganismos. Visando a atender a esta pret desenvolvimento da cisgenia e da intragenia surgem como al transgenia. A cisgenia e a intragenia se baseiam no uso exclusivo de se DNA da mesma espécie ou de espécies sexualmente compative: et al., 2013). No caso da cisgenia, o gene inserido é uma copia ¢ DNA de um gene natural, contendo seus introns e regides regula © promotor e terminador nativos, na orientagao sense (SCHOU 2006; SCHOUTEN; JACOBSEN 2008). Jana intragenia, novas c sio feitas isolando sequéncias codificadoras e regulatorias est quais sao rearranjadas in vitro e esta nova combinagao inserida n orientacgdo sense ou antisense, nesta Ultima se o objetivo for o sil génico através de RNAi (ROMMENS et al., 2007; CARDI 2016 O pool génico explorado tanto pela cisgenia quanto pel: é o mesmo disponivel para o melhoramento genético tradicioné et al., 2013). No entanto, alguns autores defendem que a cisger considerada mais proxima do melhoramento tradicional em « com a intragenia, uma vez que cultivares cisgénicas nao pos: ou caracteres diferentes dos ja disponiveis no germoplasma { melhoramento genético tradicional. Ja “‘intragenes” so novas c de partes funcionais de genes deste pool génico, as quais n naturalmente ou como resultado de hibridagéo (SCHOUTEN; J 2008). Culturas comercialmente difundidas através da propagacatabordagens cisgénicas/intragénicas com 0 objetivo de desenvo com maior resisténcia a patogenos (HOLME et al. 2013). Plantas de batata cisgénicas (Solanum tuberosum) expt genes de resisténcia introduzidos a partir de S. venturii e S. s apresentaram resisténcia de amplo espectro a Phytophthora infe. al. 2014). Em macieira, foram desenvolvidas plantas cisgénicas resisténcia a Venturia inaequalis, agente causal da sarna da 1 cultivar Gala foi geneticamente modificada através da insercao resisténcia Rvi6 derivado da cultivar Florina e originalmente en acesso silvestre (clone 821) de Malus floribunda, conferindo r sarna da macieira (VANBLAERE et al., 2011; VANBLAERE e Em outro estudo, foram desenvolvidas linhagens intragénicas | resistentes 4 sarna, utilizando o gene HcrVf2, combinado com regulatorias do gene da Rubisco, ao invés de utilizar 0 promotor ¢ nativos do gene HcrVf2 e sao, portanto, referidos como intrage et al., 2011). Ainda em macieira, foram desenvolvidas planta: com resisténcia para a queima bacteriana das rosaceas, causada | amylovora (KOST et al., 2015). Emarroz, melhoristas e fitopatologistas tém iniciado o deser de linhagens resistentes 4 brusone (Magnaporthe oryzae) através (DELWAIDE et al., 2015). Mesmo com as intimeras vantagens do uso de cisgeni para o desenvolvimento de plantas com maior resisténcia a p desenvolvimento e comercializagdéo de cultivares cisgénicas/i assim como das transgénicas, ainda dependem em grande parte « do consumidor. 5.3 Edic¢Go Genémica Tecnologias de edicao gen6mica ou edicao de genes podcomponentes importantes, envolvidos no sistema de defesa (ANDOLFO et al., 2016). A edicg&o genémica é baseada na quebra da dupla fita de D} strand breaks - DSBs) em um loco predeterminado, utilizand artificiais que reconhecem sequéncias gendémicas especificas ( al., 2016). A quebra da dupla fita de DNA, consequentemente, | mecanismos celulares de reparo, incluindo reparo por unido de er nao homdlogas (non-homologous end joining — NHEJ) e re homdloga (homologous recombination — HR), os quais poder diferentes modificagdes no genoma (XIONG et al., 2015). Ap da dupla fita de DNA e na auséncia de sequéncias de DNA exog as extremidades tendem a se ligar novamente através do rey Porém, como este processo é propenso a erros, frequentemente pequenas insergdes e delegdes (indels) que podem resultar et na sequéncia de leitura quando ocorrem na regiao codificante consequentemente, em perda de fungao ou silenciamento génico Quando fragmentos de DNA homdlogos a sequéncia alvo sé dentro da célula, o mecanismo de reparo por recombinagao hon substituir alguns nucleotideos na sequéncia do gene a ser moi inserir novos genes ou elementos regulatérios em posigao prec do genoma (BORTESI; FISCHER 2015; CARDI 2016). Nucleases artificiais como ZFNs (zinc finger nucleases) (transcription activator-like effector nucleases) podem ser ¢ reconhecer e clivar a dupla fita de DNA em locais especificos (LLOYD et al., 2005; CHRISTIAN et al., 2010). Mais recente nova tecnologia de edic¢éo genémica, denominada CRISPR/Cas: regularly interspaced short palindromic repeat - associated p desenvolvida utilizando como base o sistema imune adaptat descoberto em bactérias. CRISPR/Cas9 utiliza uma pequena si RNA (oRNA) nara oniara nicleace (acd até a eeqnéncia eenercifCRISPR/Cas9 apresenta inimeras vantagens em simplicidade, eficiéncia, versatilidade e custo (BELHAJ et al., 2 al., 2016; NEJAT et al., 2016). Diferentemente de ZFNs e TA] a especificidade ¢ determinada pela interagéo proteina-DNA CRISPR/Cas9 identifica sequéncias de DNA-alvo através do pat bases com 0 gRNA (BORTESI; FISCHER 2015). Além disso, CE permite a introdugao simulténea de DSBs em multiplos sitios, po a edigdo de varios genes ao mesmo tempo (LI et al., 2013; X 2014). A edigado multiplex com CRISPR/Cas9 requer apenas a 1 da sequéncia de nucleotideos do gRNA, sequéncias estas sint complementaridade aos genes de interesse e, desta forma, multi podem ser testados para cada gene alvo de uma forma simpl Ja ZFNs e TALENs requerem proteinas “engenheiradas” sep para cada sitio alvo especifico, tornando o processo oneroso e n inviavel (BORTESI; FISCHER 2015). Tecnologias de edigao gendmica vém sendo utilizadas c em diversas espécies vegetais. Genes que conferem susceti hospedeiro tém sido manipulados a fim de promover resisténcia (ANDOLFO et al., 2016). As tecnologias de edigdo gendmicz CRISPR/Cas9 foram ambas utilizadas em trigo hexaploide par mutagdes simultaneas nos trés alelos homélogos que codificai MLO, as quais sao responsaveis por reprimir as defesas da p! oidio. A modificagao (knockout) das trés copias MLO na me conferiu resisténcia herdavel de amplo espectro a Blumeria gre tritici (WANG et al., 2014). Em arroz, plantas que superexpressam o gene OsERF9. transcrigéo envolvido na rota do etileno, apresentam redugao n de genes relacionados a defesa e aumento da suscetibilidade a M oryzae (LIU et al., 2012). Uma mutagao especifica no gene Os, CRISPR/Cas9 causou a supressao de fatores de resposta ao etile fri efetiva nara an almentn da recietancia a Anienne em arraz (Watravés da edicdo do gene efetor Avr4/6 secretado por Phytophthe interrupgao do gene, ou substituigdo do gene efetor através dos 1 de reparo de DSBs induzidos por Cas9, contribuiu para o reconh Avr4/6 pelos genes R da soja, ativando os mecanismos de defe: (FANG; TYLER 2016). Um sitio de reconhecimento do patégeno nao funcion: modificado através de tecnologias de edigéo gendmica, obtenc R sintético funcional. Além disso, outro potencial uso da edici consiste em explorar a combinacao de varios sitios de reconhe patdgeno de diferentes genes R em um unico novo gene R, cap resisténcia a efetores conservados do patédgeno e/ou padrées 1 associados a patogenos (PAMPs) (ANDOLFO et al., 2016). D tecnologias de edicéo genémica marcam o inicio de uma nova « a fortalecer 0 sistema de defesa da planta e aumentar a 1 fitopatogenos diversos. 6 CONSIDERACOES FINAIS Os rapidos avangos na area da gendmica estaio revoluc formas como a resisténcia de plantas a doengas pode ser man programas de melhoramento genético. Estas possibilidades ainda mais a necessidade de ampliar 0 conhecimento sobre o: evolucionarios do patégeno as estratégias de implantagao, cc aumento da diversidade de genes ou no aumento da diversidade d em diferentes contextos espaciais e temporais, visando retardar do patégeno. Progresso no melhoramento de plantas para resisténcia pode ser relativamente rapido quando o melhoramento para for o principal objetivo. No entanto, resisténcia de plantas a um dos varios objetivos do melhoramento, que de outro lado 1 ta doe needutieedade adantanxn analideade « antedisponiveis para 0 desenvolvimento de cultivares resistentes beneficios e limitagdes, e a escolha do método mais adequado it entre outros fatores, do tipo de planta, do patogeno, assim como ¢ disponiveis. Métodos tradicionais fornecerao a base de genotipos importantes combinagdes de caracteres enquanto a engenhat auxiliara na transferéncia ou manipulacdo dos genes de interess mais precisa. Como perspectivas futuras, o melhoramento de pl resisténcia a doengas deve considerar duas abordagens princip igualmente validas e complementares. A primeira centra-se na i de PAMPs e¢ efetores que sao conservados no patdgeno e ess a sua sobrevivéncia. Os genes de plantas que reconhecem esta: conservadas, teoricamente tém uma maior possibilidade de eficazes ao longo do tempo, devido as limitagdes evolutivas sobre A segunda abordagem esta relacionada a planta. Estudos té1 que muitos QTLs que conferem resisténcia parcial e muitas ve codificam genes diretamente envolvidos na resisténcia. Através ¢ destes QTLs ¢ possivel determinar os mecanismos de resisténc acumular genes de resisténcia com mecanismos diferentes e c que podem ser utilizados em conjunto visando 4 resisténcia dura Por fim, a diminuigéo dos custos do sequenciamento < e a variabilidade genética presente no germoplasma, exte manipulado por melhoristas de plantas por mais de um século. agora novos meios para o desenvolvimento de resisténcia dur da identificagao e edigao de genes, visando reduzir a infecgao po e o desenvolvimento de sintomas. Embora os desafios sejam perspectivas de sucesso sao ainda maiores. REFERENCIAS