Manual de Preparo de Soluções

UNIVERSIDADE DE PERNAMBUCO
CAMPUS GARANHUNS
CURSO: Ciências Biológicas
PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO CÓDIGO:
Manual de Preparo de Soluções Página 1 de 28
1 – Situação da Revisão:
Situação Data Alteração
2 – Objetivo:
Este POP tem como objetivo, estabelecer os procedimentos para o preparo de soluções.
2.1 – Observação: Toda solução preparada deve ser identificada com uma etiqueta
conforme modelo abaixo:
A validade das soluções é de um ano a partir da data do preparo. Caso o prazo de

validade dos reagentes seja menor que 1 ano, utilizar a menor data observada. Outras
especificidades estão descritas no decorrer deste manual.
3 – Cargos/Responsabilidades:
Luiza Rayanna Amorim de Lima (Professora); Maria Isabel Jéssica da Silva Dantas
(Estudante geral do 5º período), Laila Açucena Mendes Neves Cavalcanti, (Estudante
geral do 5º período).
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4 – Campo de Aplicação:
Saúde, Oncologia, Linhagem e Cultivo celular.
5 – Soluções:
5.1 Ágar Nutritivo
5.1.1 Equipamentos
• Agitador magnético com auxílio do magneto (peixinho)

• Autoclave
• Balança
5.1.2 Materiais e Reagentes Necessários:
• Béquer
• Frascos de vidro
• Ágar nutritivo
• Água tridestilada ou ultrapura
5.1.3 Procedimentos/Metodologia:
• A quantidade de solução de ágar nutritivo a ser pesada pode variar conforme o

fabricante do produto. Contudo, sempre realizar a pesagem para o preparo de 1 litro da
solução. Caso necessário outra quantidade de solução final, realizar o cálculo do valor
a ser pesado. Veja exemplo abaixo do preparo da solução:
• Pesar XX g de pó do ágar nutritivo em balança analítica.
• Diluir em 500 mL de água tridestilada ou ultrapura utilizando agitador magnético
com auxílio do magneto.
• Atentar para a total diluição do pó.
• Após a diluição, completar com mais 500 mL de água.
• Estocar em frascos de vidro e autoclavar por 20 minutos.
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• Após a autoclavação e posterior resfriamento do líquido, este solidifica.

5.1.4 Armazenamento
Temperatura Ambiente.
5.2 – Antibióticos
5.2.1 Ampicilina
Espectro Bactérias G+ e G-
Concentração de uso 0,1 mg/mL
Solução estoque (100x) 19 mg/mL em BSS, CMF
Estabilidade 3 dias a 37°C
5.2.2 Gentamicina
Espectro Bactérias G+ e G- e micoplasma

5.2.3 Kanamicina

Concentração de uso 0,1 mg/mL ou 0,2 mg/mL para
tratamento
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5.2.4 Tetraciclina

5.2.5 Tilosina

Concentração de uso 0,01 mg/mL ou 0,02 mg/mL para
tratamento
5.2.6 Nistatina
Espectro Fungos (especialmente leveduras)

Solução estoque (500x) 25 mg/mL em DMSO
5.2.7 Estreptomicina
Espectro Bactérias G+
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5.2.8 Penicilina G
Espectro Bactérias G-
Concentração de uso 100 U/mL
Solução estoque (1000x) 100.000 U/mL em BSS, CMF
5.2.9 Cloridrato de Ciprofloxacin (Cipro)
Espectro Micoplasma
Concentração de uso 10 µg/mL
Solução estoque (100x) 0,1 mg/mL em BSS, CMF
5.2.10 Anfotericina B
Concentração de uso 1 µg/mL

Solução estoque (1000x) 1 mg/mL
5.3 Azul de Trypan 0,4%
O azul de Trypan é um corante utilizado para determinar a viabilidade celular

em uma determinada amostra. No processo de morte celular, ocorrem diversos eventos,
inclusive a danificação da membrana plasmática. Com isso, a membrana perde o
controle de permeabilidade, possibilitando a entrada do corante.
Além de possuir alta afinidade por moléculas orgânicas, o corante azul de

Trypan possui moléculas bem pequenas capazes de penetrar em qualquer ruptura na
membrana celular corando então as células mortas de azul.
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5.3.1 Equipamentos
• Agitador magnético
• Balança
• pHmetro
• Sistema de vácuo
5.3.2 Materiais e Reagentes
• Béquer
• Espátula
• Proveta
• Tubo de polipropileno 15 mL
• Filtro Milipore (membrana de 0,22 µM)
• Ímã
• Ácido clorídrico (HCl) 1N
• Corante Azul de Trypan em pó
• Hank´s Balanced Salt Solution Calcium and Magnesium Free (HBSS-CMF) ou
Hank´s Balanced Salt Solution (HBSS)
• Hidróxido de sódio (NaOH) 1 N.
5.3.4 Procedimentos/Metodologia
• Aliquotar em uma proveta o volume desejado de HBSS-CMF.

• Pesar a quantidade do corante Azul de Trypan correspondente ao volume final
da solução. Exemplo: Trypan 0,4 % - Para preparar 100 mL, deve-se pesar 0,40
g do corante.
• Transferir cerca da metade do volume de HBSS-CMF ou HBSS aliquotado para
o béquer.
• Ligar o agitador magnético.
• Adicionar o pó de Azul de Trypan.
• Cobrir o béquer com papel laminado.
• Quando o pó estiver totalmente dissolvido, acrescentar o resto do HBSS-CMF
e aguardar total homogeneização.
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• Ajustar o pH da solução para 7,2 no pHmetro previamente calibrado.
NOTA: utiliza-se ácido clorídrico 1N ou NaOH 1N para ajustar o pH.
Filtrar a vácuo.
Distribuir a solução obtida para tubos de propileno de 15 mL.
5,3,5 Armazenamento
Armazenar a temperatura ambiente.
5.4 Solução Crioprotetora
A solução crioprotetora é feita à base de soro fetal bovino e dimetil

sulfóxido (DMSO) e deve aumentar a viscosidade do meio e diminuir o estresse
osmótico durante os processos de congelamento e criopreservação. O DMSO é um
crioprotetor intracelular que possui a capacidade de penetrar na célula e reduzir a
formação de cristais de gelo que levariam ao rompimento da membrana citoplasmática.
A solução crioprotetora é liberada para uso após o resultado negativo do

teste de esterilidade, sendo esta etiquetada conforme abaixo.
Caso o resultado seja positivo, o mesmo deve ser repetido. Se

confirmado o resultado positivo, os frascos são descartados e o lote condenado para
uso devidamente identificado no banco de dados, sendo que a solução deve ser
descartada em pia.
SOLUÇÃO LIBERADA PARA USO

Responsável:
Data:
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5.4.1 Equipamentos
• Cabine de Segurança Biológica
5.4.2 Materiais e reagentes
• Frasco estéril
• Papel laminado
• Proveta estéril
• Dimetilsulfóxido (DMSO)
• Soro Fetal Bovino Inativado (SFB)
• O procedimento deve ser realizado em cabine de segurança biológica.

• Todo material a ser utilizado deve passar por uma assepsia com álcool a 70 %
antes de ser colocado dentro da cabine.
• Transferir para a proveta, um volume de DMSO de forma a alcançar 5% do
volume total.
Exemplo:
Para um volume total de 100 mL, seriam necessários 5 mL de DMSO, conforme
demonstrado abaixo:
Concentração final x Volume final = Concentração inicial x volume inicial 5 % x
100 mL=100 % x Vi // Vi = 500/100 = 5 mL
• Avolumar com soro fetal bovino inativado até se atingir o volume final desejado.
• A solução pronta deve ser transferida para um frasco estéril.
• O frasco deve ser envolto em papel laminado para evitar a degradação do
reagente que é fotossensível.
• Retirar uma alíquota para realização do teste microbiológico.
5.4.4 Armazenamento
• Armazenar entre 2 °C e 8 °C.
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5.5 Hank’s Balanced Solution Calcium and Magnseium Free (HBSS CMF)
Estabelecer procedimento para preparo da solução Hank´s Balanced Salt

Solution – Calcium and Magnesium Free (HBSS CMF).
O HBSS CMF é uma solução isotônica livre de cálcio e magnésio

enriquecida com glicose. É utilizada para lavar células aderentes antes da troca de meio
de cultura para remover eventuais debris de células mortas ou, antes da tripsinização
das células para uma melhor ação da tripsina.
O HBSS CMF é liberado para uso após o resultado negativo do teste de

esterilidade e identificação de micoplasmas, sendo este etiquetado conforme abaixo.
Caso o resultado seja positivo, o mesmo deve ser repetido. Se

confirmado o resultado positivo, os frascos são descartados e o lote condenado para
uso devidamente identificado no banco de dados, sendo que a solução deve ser
descartada em pia.
Responsável:
Data:
5.5.1 Equipamentos
• Agitador
• Balança analítica
• Cabine de segurança biológica
• Cilindro de nitrogênio gás
• Filtro com diâmetro de 142 mm
• Tanque de filtração com capacidade de 10 litros
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• Béquer
• Frascos para armazenamento
• Proveta
• Ácido clorídrico (HCL) 1N
• Água ultrapura
• Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) em pó
• Hidróxido de sódio (NaOH) 1 N
• Meio de cultura fúngica Tioglicolato
• Meio de cultura microbiológica TSB (caldo triptona de soja)
• Reagente em pó para preparo de HBSS CMF
• Aliquotar água ultrapura e transferi-la para um béquer.

• Adicionar o pó para preparo de HBSS CMF.
NOTA: O frasco de pó base para preparo de HBSS CMF vem com quantidade
suficiente para fazer determinado volume de solução. O técnico deve estar atento à
bula do HBSS CMF antes do preparo.
• Cobrir o béquer com papel laminado e aguardar total homogeneização.

• Pesar e adicionar o bicarbonato de sódio segundo a recomendação do fabricante
do pó base a ser utilizado.
• Ajustar o pH da solução para 7.4 no pHmetro previamente calibrado.
• Transferir a solução para a proveta e avolumar com água ultrapura.
• Proceder à filtração positiva.
NOTA: Durante a distribuição da solução nos frascos, deve-se retirar uma alíquota
de 10 mL no início, no meio e no fim da filtração. Essas alíquotas são utilizadas para
teste de micoplasma e testes microbiológicos.
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• Os frascos devem estar rotulados conforme modelo acima.
5.5.4 Armazenamento
Armazenar entre 2°C e 8°C.
5.6 Interleucina 3
Procedimentos para obtenção de Interleucina3 (IL3) visando sua utilização como co-
fator no cultivo de células IL3 dependentes.
5.6.1 Equipamentos
• Cabine de Segurança Biológica
• Câmara de Neubauer
• Incubadora de CO2
• Microscópio invertido
• Pipeta automática de 1000 µL
• Pipeta automática de 200 µL

• Bulbo para pipetas Pasteur
• Cálice para descarte
• Caneta para retro projetor de ponta fina com tinta permanente
• Contador manual de células
• Criotubo
• Estante para tubos
• Filtro
• Garrafas de cultivo celular de 25 cm2
• Gaze estéril e não estéril
• Lamínula
• Membrana 2 µm
• Pipetas graduadas
• Pipetas Pasteur
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• Tubos de micro centrífuga

• Tubos de polipropileno de 50 mL
• Álcool a 70 %.
• Azul de Trypan.
• Linhagens celulares: WEHI-3B e FDCP1.
• Meio de cultivo: Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) acrescido de 10
% de soro fetal bovino.
5.6.3.1 Obtenção
• Ligar a cabine de segurança biológica, limpar com álcool 70 %, ligar a luz

ultravioleta e aguardar sua ação e estabilização do equipamento por 30 minutos.
• Retirar da estufa de esterilização, a caixa de pipetas Pasteur, o pote de gaze e
deixá-los esfriando na cabine de segurança biológica.
• Separar o material a ser utilizado fazendo uma assepsia com álcool 70 % e
colocá-lo dentro da capela de fluxo laminar, após os 30 minutos iniciais.
• Realizar o descongelamento da linhagem WEHI-3B.
• Observar a cultura recém-descongelada após 24 e 48 horas.
• Proceder a contagem celular.
• Plaquear 105 células/mL atingindo o volume final de 30 mL na garrafa de 75
cm2 e 10 mL na garrafa de 25 cm2. Não exceder esses valores!
• Manter a garrafa na estufa de CO2 a 37 °C durante 7 dias sem nenhuma
manipulação.
• Terminado este tempo, centrifugar o sobrenadante a 1500rpm durante 10
minutos.
• O sobrenadante obtido após a centrifugação é filtrado em uma membrana de
0,2 m.
• Identificar os criotubos ou tubos de microcentrífuga (eppendorfs) estéreis.
• O sobrenadante é transferido para os tubos identificados (1 mL em cada
criotubo) que ficarão estocados no freezer a 10 °C negativos.
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5.6.3.2 Teste de eficiência da interleucina3 (IL-3)
• Para testar a eficiência da solução de IL-3 obtida preparam-se meios com

concentrações diferentes de IL-3: 5 %, 10 % e 15 %.
• Fazer plaqueamentos em três garrafas com o mesmo número de células da
linhagem FDCP1 (célula dependente de IL-3). Cada garrafa deve ser colocada com um
dos meios preparados anteriormente (suplementados com IL-3).
• Observar se as células FDCP1 estão em boa taxa de proliferação e em qual
concentração houve maior adaptação.
• Se as células morrerem, conclui-se que a obtenção de IL-3 não foi eficiente e
descarta-se todo o sobrenadante obtido.
• Esta informação deve ser lançada no campo de observação do lote gerado na
base de dados para que haja registro do ocorrido.
5.6.4 Armazenamento
Congelada a -10 °C.
REFERÊNCIAS
FRESHNEY, R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique.6 th edition.

USA, 2010.Editora Wiley-Liss.
6 – Meios de Cultura
Podem-se preparar meios para serem usados em células incubadas na estufa
de CO2 ou estufa seca. A diferença entre eles é a quantidade de bicarbonato de sódio
sendo dez vezes menor no meio a ser utilizado em estufa seca.
Os procedimentos descritos neste Manual destinam-se ao preparo de meios de
cultura adquiridos em pó. Antes de iniciar o preparo, o colaborador deve atentar-se à
bula e à adição de suplementos necessários ao crescimento das linhagens celulares.
Como exemplos de meios de cultura, podem ser citados: Dulbecco´s Modified Eagle´s
Medium (DMEM), RPMI 1640, Ham, 199 e Iscove´s.
Os meios de cultura são liberados para uso após o resultado negativo do teste
de esterilidade e identificação de micoplasmas, sendo este etiquetado conforme abaixo.
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Caso o resultado seja positivo, o mesmo deve ser repetido. Se confirmado o

resultado positivo, os frascos são descartados e o lote condenado para uso devidamente
identificado no banco de dados, sendo que a solução deve ser descartada em pia.
Responsável:
Data:
6.1 Equipamentos
• Cilindro de nitrogênio gás
• pHmetro
• Tanque de filtração com capacidade de 10 litros
• Filtro com diâmetro de 142 mm
6.2 Materiais e Reagentes
• Proveta
• Béquer
• Erlenmeyer
• Membranas de 0,1 µm; 0,22 µm, 0,45 µm e 0,8 µm de poro
• Água ultrapura
• Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) em pó
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• Reagente em pó para preparo do meio de cultivo
• Soro fetal bovino
• Tampão HEPES
6.3 Procedimentos/Metodologia
• Aliquotar água ultrapura e transferi-la para um béquer.

• Adicionar o pó para preparo de DMEM.
NOTA 1: O frasco de pó base para preparo de DMEM vem com quantidade suficiente
para fazer determinado volume de solução. Antes do preparo, o técnico deve estar
atento à bula para verificar as quantidades de HEPES e bicarbonato a serem
adicionadas ao meio.
NOTA 2: Para meio de estufa seca (sem CO2), o bicarbonato de sódio é acrescentado
em quantidade 10x menor do que o exigido pelo fabricante.
• Cobrir o béquer com papel laminado e aguardar total homogeneização.

• Adicionar o tampão HEPES e o bicarbonato de sódio segundo a recomendação
do fabricante do meio base.
• Ajustar o pH da solução para 7,4 no pHmetro previamente calibrado com HCl 1N
e/ou NaOH.
• Transferir a solução para a proveta e avolumar com água ultrapura.
• Adicionar a quantidade de soro que possibilite alcançar a porcentagem desejada
em relação ao volume final da solução.
NOTA 3: O soro fetal bovino deve ser inativado e bem homogeneizado antes do preparo.
Exemplo: Preparação de 10L de meio com 10% de soro
Utiliza-se a fórmula abaixo:
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• Caso a célula necessite de suplementos, fazer a adição antes da filtração sempre

mantendo a proporção dos suplementos em relação à quantidade de meio preparado.
• Proceder à filtração positiva.
NOTA: Durante a distribuição da solução nos frascos, deve-se retirar uma alíquota
de 10 mL no início, no meio e no fim da filtração. Essas alíquotas são utilizadas para
teste de micoplasma e testes microbiológicos.
• Para testes microbiológicos deve-se seguir procedimento específico.

• Os frascos devem ser etiquetados e o técnico deve indicar na etiqueta se o meio
foi acrescido de suplementos com a palavra “Suplementos” e o tipo de meio elaborado.
O meio para estufa seca deve vir seguido da palavra “SECA” e o meio a ser utilizado
para estufa de CO2 deve vir seguido de “CO2” ao lado do nome dos suplementos.
6.4 Armazenamento
Armazenar entre 2 ºC e 8 °C.
7 – Meios para teste de esterilidade
São utilizados dois tipos de meio com diferentes especificidades: tioglicolato e

TSB (Trypic Soy Broth – Triptona de soja).
O caldo de tioglicolato que é um meio de cultura rico para crescimento

primariamente para cultura de bactérias anaeróbicas, embora, também, possa detectar
o crescimento de bactérias aeróbicas e é utilizado no controle de qualidade de meios,
soluções e cultura de células.
O TSB é um meio de cultura microbiológico rico para crescimento de muitas

espécies de bactérias e fungos, incluindo as leveduras.
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7.1 Equipamentos
• Autoclave
• Balança
• Béquer
• Espátula
• Papel alumínio
• Pipeta graduada de 1000 mL
• Pipetador
• Proveta
• Tubos de vidro com tampa de rosca para microbiologia
• Água Ultrapura
• Caldo Tioglicolato. (Sigma)
7.3 Procedimentos e Metodologia
• Aliquotar água ultrapura e transferi-la para uma proveta que possibilite obter o
volume desejado.
• Pesar a quantidade de pó do meio desejado (tioglicolato ou TSB) conforme
instruções do fabricante.
Exemplo 1: Para preparar 1000 mL, deve-se pesar 29 g de pó de tioglicolato.
Exemplo 2: Para preparar 1000 mL, deve-se pesar 30 g de pó de TSB.
• Transferir cerca da metade do volume de água tridestila da aliquotada para o
béquer.
• Adicionar o pó.
• Cobrir o béquer com papel alumínio.
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• Quando o pó estiver totalmente dissolvido, acrescentar o resto da água

tridestilada e aguardar total homogeneização.
• Aliquotar em frasco de 1L ou 500 mL e prepará-los para esterilização em
autoclave.
• Após a esterilização do meio, aliquotá-los em tubos de ensaio de vidro estéril e
fazer a prova de esterilidade. Cada tubo deve conter 10 mL do meio para cultivo
microbiológico.
• Para o tioglicolato, deve-se colocar um tubo a 32,5 ºC ± 2,5 ºC por 14 dias para
prova de esterilidade.
• Para o TSB, deve-se incubar um dos tubos a 22,5 ºC + 2,5 ºC sob condições
aeróbicas por 14 dias para prova de esterilidade.
• O teste é considerado válido se não houver evidência de crescimento
microbiano. Crescimento este evidenciado pela turvação do meio. Se houver
crescimento microbiológico, o meio de cultura deve ser descartado e preparado outro
lote.
• Rotular os demais tubos com o nome da solução, lote e número do tubo.
7.4 Determinação da validade e armazenamento dos meios
Se os meios preparados forem estocados em frascos não hermeticamente

fechados, poderão ser utilizados por 1 mês, desde que sejam testados para promoção
de crescimento dentro de 15 dias a partir do tempo de uso e que cumpram o requisito
para o indicador de cor.
Caso os meios sejam estocados em frascos hermeticamente fechados, poderão

ser usados por 1 ano, desde que sejam testados para promoção de crescimento dentro
de 3 meses a partir do tempo de uso e que cumpram o requisito para o indicador de cor.
7.5 Armazenamento
Armazenas a temperatura ambiente.
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REFERÊNCIAS
Brasil. Farmacopeia Brasileira, 5° edição / Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

Brasília: Anvisa, 2010.
Referência da Sigma (Fabricante): 70157 Thioglycollate Broth, USP Alternative (Altern

Ative Thioglycollate Medium; Fluid Thioglycollate Medium; NIH Thioglycollate Broth).
FLUKA Analytical.
8 – NaOH 1N
Estabelecer procedimento para preparo de hidróxido de sódio (NaOH) 1N que

será utilizada para ajuste de pH nos procedimentos de preparo de meios e soluções.
8.1 Equipamentos
• Balança
• Béquer
• Espátula
• Proveta
• Papel laminado
• Água ultrapura
• Hidróxido de sódio (NaOH) P.A.
• Aliquotar água ultrapura e transferi-la para uma proveta que possibilite obter o
volume desejado.
• Pesar a quantidade de NaOH P.A. correspondente ao volume final da solução.
NOTA: O NaOH P.A. tem como massa molar 40g.
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Exemplo: Para preparar 250 mL, deve-se pesar 10g de NaOH P.A.
• Transferir cerca da metade do volume de água tridestila da aliquotada para o

Béquer.
• Adicionar o NaOH pesado.
• Cobrir o béquer com papel laminado.
• Quando o NaOH estiver totalmente dissolvido, acrescentar o resto da água
tridestilada e aguardar total homogeneização.
• Transferir o volume para um frasco de plástico com tampa. Não armazenar em
frasco de vidro.
8.4 Armazenamento
9. PBS – Phosphate Buffered Salina
9.1 Equipamentos
• Balança
• pHmetro
• Proveta
• H2O q.s.p.
• HCl
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• KCl
• KH2PO4
• Na2HPO4
• NaCl
9.3 Procedimentos
Pesar os valores mencionados na tabela abaixo dependendo do fator a ser utilizado,

diluir em 1000 mL de água e ajustar o pH (NaOH ou HCl) conforme indicado.
9.4 Armazenamento
10 – Sulfonítrica
Uma mistura de ácido sulfúrico (H2SO4) e ácido nítrico (HNO3), utilizada na

limpeza de vidrarias.
Devido ao caráter higroscópico e exotérmico do ácido sulfúrico a preparação

da mistura sulfonítrica realiza-se pela adição do ácido sulfúrico à água e posteriormente
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a adição de ácido nítrico sob resfriamento. É uma mistura de perigoso manuseio, pois
une a corrosividade dos ácidos nítrico e sulfúrico com o caráter oxidante do ácido nítrico,
requerendo cuidados no seu manuseio em laboratório. O técnico deve fazer a solução
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utilizando luvas e jaleco de proteção.
• Frasco Âmbar
• Luvas
• Proveta
• Ácido nítrico
• Ácido sulfúrico
• Água destilada gelada
• Gelo
• O técnico deve refrigerar o frasco âmbar utilizando gelo em volta do mesmo,
transferir 50 % de água destilada gelada para o frasco âmbar.
• Posteriormente, adicionar com cuidado 40 % de ácido nítrico e 10 % de ácido
sulfúrico. Manter a solução ainda em banho de gelo por alguns minutos e,
posteriormente, homogeneizar, balançando a garrafa até que haja total solubilização.
10.3 Armazenamento
Temperatura ambiente em frasco âmbar, protegida da luz.
11 – Suplementos para meio
11.1 Soro Fetal Bovino
Utilidade entre 5% a 20% v/v.
11.1.1 Validade
Vide embalagem.
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11.1.2. Armazenamento
Embalagem fechada: freezer. Embalagem aberta: geladeira
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11.2 Piruvato 1M ou 110 g/L (100x)
11.2.1 Equipamentos
• Pipeta

• Filtro 0,22 µm
• BSS.CMF q.s.p.
• Piruvato de sódio
• Pesar 2,2 g de piruvato de sódio e diluir em 10 mL de BSS.CMF q.s.p.
• Filtrar.
• Aliquotar e congelar.
11.2.4 Armazenamento
11. 3 - L-glutamina 0,2M ou 29,22 g/L (100x)

11.3.1 Equipamentos
• Pipeta
• Filtro 0,22 µm
• BSS.CMF q.s.p.
• L-glutamina
11.3.3 Procedimentos/ Metodologia
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• Diluir 0,584 g de L-glutamina em 20 mL de BSS.CMF.
• Filtrar.
• Aliquotar e congelar.
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11.4 Insulina 500 µg/mL (100x)
11.4.1 Equipamentos
• pHmetro
• Béquer
• Proveta
• Tubo de polipropileno 15 mL estéril
• Ácido acético
• Água ultrapura
• Insulina 100 mg
• Para preparar solução estoque de 10 mg/mL, deve primeiro acidificar 10 mL de
água com ácido acético para pH < 2.0. O que dar aproximadamente 0,1 mL de ácido.
Verificar o pH no phmetro, caso seja necessário, adicionar mais ácido acético até atingir
pH < 2.0.
• Diluir 100 mg de insulina na água preparada acima, sob agitação (no agitador
magnético).
• Após total dissolução do pó, acrescentar 190 mL de água ultra pura completando
volume de 200 mL e ficando a solução estoque 500 µg/mL
• Aliquotar 10 mL em tubos de 15 mL.
REFERÊNCIAS
24
Barnes, D. and Sato, G. (1980). Analytical Biochem. 102:255-270.
Barnes, D. and Sato, G. (1980). Cell 22:649.
Manual de preparo de soluções da Sigma Aldrich
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11.5 - Transferrina (haloproteína) 500 µg/mL (100x)
11.5.1 Equipamentos
• Pipeta

• BSS-CMF
• Transferrina
• Diluir 10 mg de transferrina em 20 mL de BSS-CMF.
12 – Tripsina 0,3 %
A tripsina é uma enzima inespecífica que age clivando as ligações peptídicas

dos aminoácidos lisina e arginina.
Estas ligações estão presentes nas proteínas de adesão responsáveis pela

aderência das células em superfícies de cultivo (garrafas, placas e tubos, por exemplo).
Com base nesta característica, in vitro, utiliza-se a tripsina para desprender as células
aderentes da superfície de cultivo quando necessário, como para expandir ou congelar
as células.
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A tripsina só é liberada para uso após o resultado negativo do teste de
esterilidade e identificação de micoplasmas, sendo este etiquetado conforme abaixo.
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Caso o resultado seja positivo, o mesmo deve ser repetido. Se confirmado o

resultado positivo, os frascos são descartados e o lote condenado para uso devidamente
identificado no banco de dados, sendo que a solução deve ser descartada em pia.
Responsável:
Data:
12.1 Equipamentos
• pHmetro
• Sistema de filtração por pressão positiva
• Béquer
• Magneto (peixinho)
• Proveta
• Tubos de polipropileno 50 mL
• EDTA (Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético)
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• Solução salina: Hank´s Balanced Salt Solution - Calcium and Magnesium Free
(HBSS CMF) ou PBS.
• Tripsina 1:250 em pó.
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• Pesar a quantidade de tripsina correspondente ao volume final, sempre
obedecendo a proporção de 3g de tripsina para cada litro de solução.
• Em seguida, pesar 0,2 g de EDTA para cada litro.
• Rinsar a barra magnética e o béquer com água ultrapura.
• Colocar a barra magnética no béquer.
• Levar o béquer até o agitador magnético e ligar a agitação.
• Adicionar 1/3 da quantidade total de HBSS-CMF ou PBS e dissolver o conteúdo
de tripsina. O HBSS-CMF ou PBS é o solvente nesta solução.
• Após a dissolução, adicionar o EDTA à solução.
• Aguardar a solubilização da solução.
• Ajustar o pH da solução para 7,8 utilizando o pHmetro previamente calibrado.
NOTA: utiliza-se ácido clorídrico 1N e NaOH 1N para ajustar o pH.
• Transferir a solução para a proveta, ajustar o volume com HBSS CMF ou PBS e
homogeneizar.
• Filtrar todo o conteúdo utilizando o sistema de filtração com pressão positiva.
• Distribuir alíquotas de 40 mL em tubos de polipropileno de 50 mL previamente
identificados.
• Colocar uma alíquota em tubos contendo TSB e tioglicolato para teste de
esterilidade.
• Retirar uma alíquota de 10 mL para teste de avaliação da presença de
micoplasma, os testes mais utilizados são PCR e a bioluminescência.
12.4 Armazenamento
27
CAMPUS GARANHUNS
12 – EPIs e EPCs Necessários:
1. 01 Jaleco
2. 01 par de luvas
3. 01 Máscara
Elaboração: Nome: Maria Isabel Jéssica da Aprovação e Nome: Luiza Rayanna Amorim de
Silva Dantas Lima
Liberação:
Rubrica Rubrica
Data Data
28

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UNIVERSIDADE DE PERNAMBUCO

Situação Data Alteração

A validade das soluções é de um ano a partir da data do preparo. Caso o prazo de

Saúde, Oncologia, Linhagem e Cultivo celular.

5.1 Ágar Nutritivo

• Agitador magnético com auxílio do magneto (peixinho)

5.1.2 Materiais e Reagentes Necessários:

• A quantidade de solução de ágar nutritivo a ser pesada pode variar conforme o

• Após a autoclavação e posterior resfriamento do líquido, este solidifica.

Espectro Bactérias G+ e G- e micoplasma

Espectro Bactérias G+ e G- e micoplasma

Espectro Bactérias G+ e G- e micoplasma

Espectro Bactérias G+ e G- e micoplasma

Espectro Fungos (especialmente leveduras)

5.2.9 Cloridrato de Ciprofloxacin (Cipro)

Concentração de uso 1 µg/mL

5.3 Azul de Trypan 0,4%

O azul de Trypan é um corante utilizado para determinar a viabilidade celular

Além de possuir alta afinidade por moléculas orgânicas, o corante azul de

5.3.2 Materiais e Reagentes

• Aliquotar em uma proveta o volume desejado de HBSS-CMF.

• Ajustar o pH da solução para 7,2 no pHmetro previamente calibrado.

NOTA: utiliza-se ácido clorídrico 1N ou NaOH 1N para ajustar o pH.

Distribuir a solução obtida para tubos de propileno de 15 mL.

Armazenar a temperatura ambiente.

5.4 Solução Crioprotetora

A solução crioprotetora é feita à base de soro fetal bovino e dimetil

A solução crioprotetora é liberada para uso após o resultado negativo do

Caso o resultado seja positivo, o mesmo deve ser repetido. Se

SOLUÇÃO LIBERADA PARA USO

• Cabine de Segurança Biológica

5.4.2 Materiais e reagentes

• O procedimento deve ser realizado em cabine de segurança biológica.

Estabelecer procedimento para preparo da solução Hank´s Balanced Salt

O HBSS CMF é uma solução isotônica livre de cálcio e magnésio

O HBSS CMF é liberado para uso após o resultado negativo do teste de

Caso o resultado seja positivo, o mesmo deve ser repetido. Se

SOLUÇÃO LIBERADA PARA USO

5.5.2 Materiais e Reagentes

• Aliquotar água ultrapura e transferi-la para um béquer.

• Cobrir o béquer com papel laminado e aguardar total homogeneização.

• Os frascos devem estar rotulados conforme modelo acima.

Armazenar entre 2°C e 8°C.

5.6.2 Materiais e Reagentes

• Tubos de micro centrífuga

• Ligar a cabine de segurança biológica, limpar com álcool 70 %, ligar a luz

5.6.3.2 Teste de eficiência da interleucina3 (IL-3)

• Para testar a eficiência da solução de IL-3 obtida preparam-se meios com

Congelada a -10 °C.

FRESHNEY, R.I. Culture of animal cells: a manual of basic technique.6 th edition.

Caso o resultado seja positivo, o mesmo deve ser repetido. Se confirmado o

SOLUÇÃO LIBERADA PARA USO

6.2 Materiais e Reagentes

• Meio de cultura fúngica Tioglicolato

• Aliquotar água ultrapura e transferi-la para um béquer.

• Cobrir o béquer com papel laminado e aguardar total homogeneização.

Exemplo: Preparação de 10L de meio com 10% de soro

Utiliza-se a fórmula abaixo:

• Caso a célula necessite de suplementos, fazer a adição antes da filtração sempre

• Para testes microbiológicos deve-se seguir procedimento específico.

Armazenar entre 2 ºC e 8 °C.

7 – Meios para teste de esterilidade

São utilizados dois tipos de meio com diferentes especificidades: tioglicolato e

O caldo de tioglicolato que é um meio de cultura rico para crescimento