Manipulação de DNA

Enzimas de modificação e restrição

Vectores de clonagem
Vectores e expressão
Isolamento de genes

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Algumas das bases podem ser quimicamente
modificadas após a sua incorporação no DNA …

Metilação - permite “marcar” moléculas de DNA, mas …

• Procariotas - permite distinguir diferentes moléculas

de DNA e também distinguir a cadeia de DNA
replicada e a não replicada

• Eucariotas - está relacionado com o controlo da

transcrição de genes

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O DNA de E. coli pode apresentar algumas bases metiladas …

6-metiladenina 5-metilcitosina

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Estas metilações são produzidas pela acção de três metilases,
que identificam três sistemas diferentes:

Responsável por um padrão

• Sistema hsd de metilação que identifica o
• Sistema dam DNA de uma bactéria
• Sistema dcm
Responsável pela distinção das
cadeias recém-sintetizadas
Metilação de citosinas, (importante no controlo da
mas com função replicação) e na marcação de DNA
desconhecida a ser reparado

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 O estado de metilação dos locais de origem de
replicação controlam a replicação

Ex: oriC tem cerca de 11

cópias da sequência
GATC

Local de
reconhecimento
da metilase
(Dam)

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Um local de origem de replicação activo tem de se
encontrar na forma metilada
(As origens de replicação hemimetiladas não podem ser utilizadas)

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O padrão de metilação do DNA identifica moléculas de
DNA “estranho” …

… tornando-o susceptível ao ataque por ER

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia
 O sistema de modificação e restrição é constituído pela
actividade de uma metilase com a mesma especificidade
de sequência que a actividade da enzima de restrição

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia
O sistema de modificação e restrição protege o
DNA da bactéria e destrói o DNA estranho

• a metilase adiciona grupos metilo (a adenina ou a

citosina) no local de restrição
• a metilação torna o DNA resistente à restrição, tornando-
o imune ao ataque da actividade de restrição
• qualquer DNA que não tenha o mesmo padrão de
modificação é degradado pelas enzimas de restrição

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 Enzimas de restrição
• Endonucleases bacterianas que reconhecem sequências
específicas de DNA (locais de restrição)

• Os locais de restrição geralmente são curtas sequências

palindrómicas

• Podem clivar a molécula de DNA no interior da sequência de

reconhecimento ou não

• Podem produzir extremidades coesivas ou cegas

• Podem ser subdivididas em duas classes principais:

• tipo II - duas enzimas diferentes (endonuclease e metilase)
• tipo I e III - uma única enzima com as duas actividades

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 Enzimas de restrição do tipo II
são compostas por dois tipos de subunidades: uma para a
restrição e outra para a modificação

Reconhecimento de
uma sequência
palindrómica (4-6 pb)
por uma endonuclease
de restrição e ligação ao
DNA

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 Enzimas de restrição do tipo I
são compostas por três tipos de subunidades para a
restrição, modificação e reconhecimento

Restrição

Modificação

Reconhecimento

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 Enzimas de restrição do tipo I
os locais de reconhecimento são EcoB
bipartidos e assimétricos (mas cada *
TGANNNNNNNNTGCT
parte contém uma adenina sujeita a ACTNNNNNNNNACGA
metilação) *

os locais de clivagem localizam-

se a mais de 1000 pb do local de
reconhecimento

Pouca utilidade em Eng.

Genética

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 Enzimas de restrição do tipo I
Os locais de reconhecimento são metilados apenas numa
cadeia do DNA

A enzima ou metila, ou promove a restrição, dependendo

do grau de metilação do DNA
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 Enzimas de restrição do tipo III
são compostas por dois tipos de subunidades: uma para a
restrição e outra para a modificação e reconhecimento

os locais de clivagem
localizam-se a jusante
(24-26 pb) do local de
reconhecimento

A metilação ocorre no
mesmo local que é
reconhecido

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Enzimas de modificação
• Nucleases (quebram ligações fosfodiéster)
– Endonucleases
– Exonucleases
• Polimerases
– DNA polimerase
– Klenow
– Transcriptase reversa
• Enzimas que actuam nas extremidades
– Fosfatase alcalina
– Cinase de polinucleótidos
– Transferase terminal

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 Endonucleases
• DNase I

Degrada dsDNA e ssDNA

Aplicações:
- Remover gDNA de amostras de RNA
- Degradar DNA molde das reacções de transcrição

• Nuclease S1 Degrada ssDNA

Aplicações:
- Ensaios de protecção de nuclease
- Formação de extremidades cegas em dsDNA
- Análise de transcritos de RNA

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 Exonucleases
• Bal-31
Degrada dsDNA, ssDNA, RNA

Aplicações:
- encurtamento progressivo de dsDNA

• Exo III Aplicações:

- mutagénese dirigida
- preparação de ssDNA para
sequenciação (didesoxi)
- preparação de deleções
aninhadas em dsDNA

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 Polimerases
• Sintetizam cópias de moléculas de ácidos nucleicos,
sendo usadas em muitos procedimentos de
engenharia genética
• Podem ser dependentes de DNA ou de RNA
– DNA polimerase dependente de DNA
DNADNA
– DNA polimerase dependente de RNA
RNADNA
– RNA polimerase dependente de DNA
DNARNA

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 DNA polimerases

• DNA polimerases mesofílicas ou termofílicas são usadas

em diferentes reacções de polimerização, formação de
extremidades cegas, amplificação, marcação, etc.

– DNA polimerase I
– DNA polimerase, “Large fragment”, Klenow
– T4 DNA polimerase
– T7 DNA polimerase
– Transcriptase reversa

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Aplicações:
* marcação de DNA (DNA labeling, Nick translation)
* Síntese da 2ª cadeia do cDNA

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• T4 DNA polimerase (dependente de DNA)
– catalisa a síntese de DNA 5´ 3’ (requer um
oligonucleótido e DNA molde)
– actividade de exonuclease 3’5’
– não possui actividade de exonuclease 5’3’

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• T7 DNA polimerase (dependente de DNA)
– catalisa a síntese de DNA 5´ 3’
– enzima processiva: síntese contínua de cadeias longas de
DNA

• Transcriptase reversa

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 Enzimas que actuam nas extremidades

• Fosfatase alcalina

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 Enzimas que actuam nas extremidades
• Cinase de polinucleótidos (PNK)
– Catalisa a transferência e troca do Pi -ATP para a
extremidade 5’-OH

• Transferase terminal (TDT

– adiciona desoxinucleótidos à extremidade 3’-OH de
moléculas de DNA

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O que é a clonagem?
• inserção de fragmentos de DNA “estranho”
no DNA natural de um organismo

• transporte desse DNA para as células

de bactérias ou leveduras por
moléculas designadas de vectores de
clonagem

• estes procedimentos dependem da

capacidade dos vectores
completarem os seus ciclos de vida,
apesar de conterem DNA estranho

• é um procedimento que gera um

grande número de cópias, de uma
sequência de DNA

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Propriedades dos vectores de clonagem

1. aceitar DNA estranho e ser capaz de completar o seu ciclo

de vida (ori- origem de replicação ou replicador)

2. conter local de clonagem (MCS – “polylinker”)

3. conter um marcador de selecção (permitir que as células

hospedeiras (bactéria ou levedura) que contêm o DNA
estranho se distingam daquelas que o não possuem)

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Tipos de vectores de clonagem

1. Plasmídios

2. Bacteriófagos

3. Cosmídios

4. Cromossomas artificiais

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Tamanho dos insertos nos vários vectores de clonagem
Vector Inserto (kb) Principal aplicação
Subclonagem, clonagem cDNA,
Plasmídio < 10 kb
ensaios de expressão
Clonagem: gDNA / cDNA,
Bacteriófago 9 – 20 kb
bibliotecas de expressão
Cosmídio 33 – 47 kb Bibliotecas genómicas
BAC (bacterial artificial 75 – 300 kb Análise de grandes genomas
chromosome)

YAC (yeast artificial Análise de grandes genomas

100 – 1000 kb
chromosome) Ratos transgénicos
MAC (mammalian 100 – 1 Mb Em desenvolvimento; biotecnologia
artificial chromosome)
animal, terapia génica
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Características dos plasmídios

• moléculas de DNA circular extracromossómico, auto-replicativo

• tamanho: 1 - 200 kb

• possuem funções vantajosas para o hospedeiro como:

- produção de: enzimas que degradam antibióticos ou metais pesados;
aa raros; sensibilidade ou resistência a fagos
- produzem enzimas de restrição e modificação

• replicação acoplada à replicação da célula de modo:

- restrito: 1 a 2 plasmídios em cada ciclo de replicação
- relaxado: 10-200 cópias do plasmídio

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

A clonagem envolve três passos básicos:

1. o vector de DNA é clivado com uma ou duas enzimas

de restrição

2. o DNA a ser clonado, DNA dador ou inserto, é ligado

ao vector, formando uma molécula recombinante

3. a molécula recombinante é introduzida na célula

bacteriana hospedeira, denominando-se então de
transformada por conter a molécula de vector

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Vectores plasmídicos:
uso na manipulação do DNA

 Vectores multi-funções (“multi-purpose”)

 Sub-clonagem de DNA num plasmídio vector

 Clonagem directa de produtos de PCR

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Plasmídios: modificações
Os modernos vectores de plasmídio, evoluíram de simples plasmídios que continham
pouco mais do que o local de replicação e um marcador de selecção ...

... para características que resultaram

da adição de sequências que
aumentaram a sua utilidade

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Vector multi-funções: características
marcador de selecção
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA
local de clonagem múltiplo (MCS,‘polylinker’):
pequena sequência de DNA contendo
vários locais para o reconhecimento de
enzimas de restrição
LCM localiza-se na extremidade 5’ do operão
lac de E. coli. Esta região contém o
promotor do lacZ, o gene de E.coli que
codifica para a –galactosidase (-gal) e
uma pequena parte da região codificante
de -gal, que codifica uma sequência
conhecida como –péptido
promotores de RNA polimerase derivados dos
bacteriófagos T3 e T7, a ladear o LCM
origem de replicação do bacteriófago M13
Biotecnologia
Vector multi-funções: características
marcador de selecção
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA
local de clonagem múltiplo (MCS,‘polylinker’):
pequena sequência de DNA contendo
vários locais para o reconhecimento de
enzimas de restrição
LCM localiza-se na extremidade 5’ do operão
lac de E. coli. Esta região contém o
promotor do lacZ, [o gene de E.coli que
codifica para a –galactosidase (-gal)] e
uma pequena parte da região codificante
de -gal, que codifica uma sequência
conhecida como –péptido
-gal
X-Gal Galactose + 4-Cl-Br-Indigo
(incolor) (incolor) (azul)
X-Gal: 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-β-D-galactopiranosídeo
Biotecnologia
• Locais de ligação ao ribossoma (iniciação da tradução)
• Nos procariotas a eficiência de tradução é afectada pela estrutura
1ª e 2ª dos mRNAs na região da subunidade 30S do ribossoma

A sequência de Shine-Dalgarno é complementar a uma sequência da

extremidade 3’ do rRNA 16S da subunidade 30S do ribossoma

Mutações nestas
sequências suprimem a
A
tradução do respectivo
mRNA

Mutações nestas
sequências alteram o
padrão da síntese proteica
Os mRNAs policistrónicos possuem várias em toda a célula
sequências Shine-Dalgarno

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Sub-clonagem num plasmídio vector

 o alvo de clonagem é clivado da molécula de DNA fonte

 a molécula do vector é clivada no seu local de clonagem

múltiplo (linearização)

 ligação das moléculas alvo e vector

 transformação de células de E.coli (CaCl2, RbCl2 ou

electroporação) usando o vector recombinante

 avaliar se células transformadas contêm o inserto

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Sub-clonagem
Com uma enzima de restrição pode haver circularização do
vector e também do inserto

Vector Inserto
5’AATTC G 3’
5’ GAATTC GAATTC 3’ 3’ G CTTAA 5’
3’ CTTAAG CTTAAG 5’

ligase ligase

GAATTC GAATTC
G CTTAAG CTTAAG
CTTAA

DNA recombinante
há circularização (2 orientações – sense e antisense)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Sub-clonagem – Desfosforilação do vector
Evita a circularização do vector e também do inserto

Vector
Inserto
5’ pAATTC G 3’
3’ G CTTAAp 5’ 5’ pAATTC G 3’
3’ G CTTAAp 5’
fosfatase (ex. CIP, BAP)
ligase
AATTC G
G CTTAA

ligase GAATTC GAATTC

CTTAAG CTTAAG

DNA recombinante
não há circularização (2 orientações)

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 Sub-clonagem - Clonagem dirigida

Evita a circularização do vector e também do inserto

Vector Inserto
5’ AATTC G 3’
5’ GAATTC GGATCC 3’ 3’ G CCTAG 5’
3’ CTTAAG CCTAGG 5’

Eco RI Bam HI ligase

GAATTC GGATCC
CTTAAG CCTACC
G
CTTAA

DNA recombinante
não há circularização (1 orientação)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Sub-clonagem - Clonagem dirigida

Com duas enzimas de restrição:

Vantagens:
- gera extremidades heterólogas, incompatíveis entre si
- força a integração do DNA estranho numa dada direcção
- integração de um só fragmento, se o inserto não for muito grande

Desvantagens:
- elevada recircularização do vector, quando se recorre à
digestão parcial (digestão incompleta do vector)
- dificuldade de digestão, se as duas enzimas se encontrarem
muito próximo no “polylinker”
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia
Sub-clonagem - Clonagem dirigida

Com duas enzimas de restrição:

- é o processo de clonagem mais eficaz

- deve ser usado sempre que possível
- o elevado número de enzimas de restrição facilita este processo
- existem múltiplas possibilidades de modificar as extremidades geradas
pelas enzimas de restrição, quer por:
- preenchimento (com polimerases)
- hidrólise (exonucleases – “blunt-end”)
- moléculas adaptadoras (extr. compatíveis com enzima restrição)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Incorporação artificial de locais de restrição

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Sub-clonagem - controlos

Todas as experiências de clonagem devem ser acompanhadas

de controlos, em simultâneo com a reacção de ligação que se
pretende:

omitir a desfosforilação ou
uma das moléculas de DNA

Uma ‘construção’ bem sucedida deve originar colónias em

número superior ao de qualquer controlo.

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Clonagem directa de produtos de PCR
0,5 a 1,5 µL de produto PCR
+
T-vector

Ligação: T4 DNA polimerase

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Transformação para amplificação de genes

Surge após a construção de moléculas de DNA recombinante

consiste em transferir essas moléculas para o interior de uma célula

viva onde terá lugar a amplificação

a entrada e expressão de DNA exógeno numa célula bacteriana -

transformação - é essencial para o processo de amplificação

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 A entrada espontânea de DNA estranho numa célula é pouco provável

 A competência de uma célula pode ser adquirida se tratada com:

cloreto de cálcio, ou outros iões (Mn2+, Mg2+ , Ba2+, Rb+)
choque eléctrico
de preferência na fase de crescimento exponencial

 A eficiência de transformação é afectada pelo tamanho e conformação

da molécula de DNA (105 – 107 transformantes/µg vector)

 cc baixas de plasmídio (0,1-0,5 µg/mL) são suficientes para saturar uma

suspensão de células competentes ( 108 células)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 mistura de ligação

+
transformação

gelo
42ºC
célula de E.coli com
célula competente de E.coli
plasmídio recombinante

não sobrevive
sobrevive
inocular colónia em
agar contendo meio líquido
antibiótico(s)

µg ou mg DNA
recombinante

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Embora não haja limitações na reacção de ligação, a eficiência
de transformação depende do tamanho do plasmídio

Efeito do tamanho do plasmídio na eficiência de transformação

Molécula (kb) % probabilidade máxima

2,0 57
3,2 100
4,3 86
12,5 43
20,0 36
39,0 14
54,0 6

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Tipos de hospedeiros usados em engenharia genética

Grupo Procarióta / Tipo Exemplos

Eucarióta
Gram - Escherichia coli
Bactérias * Procariota Gram + Bacillus subtilis
Streptomyces spp.
Microbial Saccharomyces cerevisae
Fungos * Eucariota
Filamentoso Aspergillus nidulans
Protoplastos Vários tipos
Plantas Eucariota Células intactas Vários tipos
Organismos Vários tipos
Células de insectos Drosophila melanogaster
Células de mamíferos Vários tipos
Animais Eucariota
Oócitos Vários tipos
Organismos Vários tipos
* cultivados em meio de cultura líquido e/ou placas com agar

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Organismo usados em biologia celular vs tipos de estudos

Lodish et al. (2000)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Lodish et al. (2000)
Outros organismos: rãs, ouriços-do-mar, galinhas e fungos.

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Características dos bacteriófagos ou fagos

 São vírus que infectam as bactérias

 ssDNA, dsDNA, RNA

 Ácidos nucleicos envoltos em proteínas (cápside)

 Necessitam de células hospedeiras para se multiplicarem

 Capacidade de inserir até 20 kb, DNA estranho

 Eficiência de transformação superior à dos plasmídios

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Vectores fágicos
Filamentosos Cabeça e cauda

Bacteriófago M13 Bacteriófago 

Vectores de substituição
Vectores de inserção
ZAP
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia
Infecção da célula bacteriana por bacteriófagos

1. Adsorção da partícula fágica à célula

e injecção do DNA

2. Replicação do DNA – enzimas fágicas

específicas presentes no DNA fágico

3. Síntese dos componentes proteicos da

cápside , constituição das partículas
fágicas e sua libertação

CICLO LÍTICO
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia
Partícula do fago  adsorve à
célula de E. coli e injecta o DNA

circularização do DNA 

Integração do DNA  no cr.

do hospedeiro
PROFAGO

Indução
A. excisão do DNA 
B. novas partículas fágicas
CICLO LISOGÉNICO
FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia
Bacteriófago M13

promotores
terminadore
sori

(6407 bp)

• Infecta E.coli
• Fago lisogénico: genoma codifica 10
- sem integração genes (I-X)
- sem lise

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Bacteriófago M13

1. Injecção do ssDNA na célula

hospedeira; síntese de dsDNA

2. Replicação dsDNA

3. Produção contínua de
partículas por um mecanismo
de ciclo evolutivo

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Modificação M13 - vector de clonagem
Gene lac para a proteína repressora (lac I)
permite a regulação do promotor lac

Região Plac e Olac permite a -

complementação no hospedeiro com a
região lac removida

Promotor lac “upstream” do gene lac Z

Local de clonagem múltiplo, inserido no gene lac Z

Os vectores são construídos aos pares, com as regiões LCM

em orientação oposta (ex. mp18, mp19)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 M13: uso na manipulação do DNA
Quando se pretende ssDNA pode-se usar o bacteriófago M13, em substituição
do pBluescript

O fago na forma de cadeia dupla pode ser isolado e tratado como qualquer
plasmídio

Enzimas de restrição a linearizar o genoma da região do “polylinker”

Ligação com o fragmento de interesse

A transformação com este vector é extremamente baixa e insertos grandes

podem sofrer rearranjos durante a propagação do fago

É frequentemente usado na mutagénese in vitro

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Bacteriófago 

 infecta E. coli
 dsDNA, caracterização genética e bioquímica
 48502 bp
 empacota centenas de milhar de segmentos de DNA
 isolamento de genes específicos
 bibliotecas genómicas
 dois tipos de vectores que diferem no tamanho dos
insertos que aceitam

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Bacteriófago 
Forma linear do genoma (fago intacto)

12 pb 12 pb

Forma circular (forma que adquire

após entrada na célula da bactéria)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

. Vectores de substituição
▼
DNA genómico GGATCC

s = Sau3A
BamHI BamHI contêm locais de
▼GATC
cos L R cos
restrição nas
s s s
s s genes não
regiões que
s essenciais flanqueiam genes
s s não essenciais para
a sua propagação
Digestão parcial Sau3A, nas células
purificar DNA  20kb Ligar locais cos,
Digerir completa/ com BamHI, hospedeiras
Purificar braços ligados
ss s s
s

s s s BamHI BamHI
s
s s s R L
a clonagem é feita
s s
de modo similar à
clonagem dos
plasmídios
s s s s s s
R L R L R L

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

. Vectores de inserção
EcoRI
gt10 o DNA é cortado com apenas uma enzima de
Gene cl restrição

permite a inserção de fragmentos até 52 kb,

Digerir com EcoRI entre os locais cos
Ligar fragmento no alvo EcoRI

usado na clonagem de cDNA, em especial de

EcoRI EcoRI cópias de mRNA de eucariotas (1,5 –2 kb, no
máximo 5 kb)

Empacotamento do DNA in vitro na bactéria hospedeira

Selecção contra crescimento de fagos não-recombinantes
(possuem gene cI intacto)

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Vector ZAP

 Combina o melhor dos vectores plasmídicos e fágicos

 É um fago  contendo uma cópia do pBluescript

 O DNA alvo é inserido no LCM do pBluescript

 A mistura de ligação é submetida ao empacotamento in vitro

 A elevada eficiência de empacotamento produz muitas placas após

infecção de E. coli

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Clonagem em ZAP
Local de iniciação (Li) Local de terminação (Lt)

cos  Bluescript  cos

Co-infecção de E.coli com o ZAP recom-

f1 binante (cDNA clonado) e o fago “helper” f1

Proteínas do fago f1 cortam o DNA no local de

iniciação e replicam a cadeia (+) até o Lt

a cadeia simples (+) é recircularizada pelo

produto do gene II do fago f1, servindo de
molde para a síntese da cadeia (-)

a molécula de Bluescript contendo o inserto

é produzida e purificada de células de E. coli

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Como é que pode
ser feito o rastreio
de um gene numa
biblioteca de cDNA?

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Como é que pode
ser feito o rastreio
de um gene numa
biblioteca de cDNA?

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Como é que pode
ser feito o rastreio
de um gene numa
biblioteca de cDNA?

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Como é que pode
ser feito o rastreio
de um gene numa
biblioteca de cDNA?

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Cosmídios

São vectores plasmídicos que contêm os locais cos do

bacteriófago

Os locais cos são o único requisito para o DNA ser empacotado

dentro de uma partícula fágica

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Características dos cosmídios

 maioria com genoma ca. 5 kb

 partículas fágicas com capacidade de aceitar 38 e 52 kb de

DNA

 capacidade de clonar entre 33 e 47 kb

 contêm ori e genes de resistência a antibióticos

 elevada eficiência de transformação

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Clonagem em cosmídios

 similar à de um vector de substituição

 empacotamento in vitro

 introdução em E. coli por transfecção

 clones recombinantes são seleccionados e propagados de

modo idêntico às bactérias transformadas com um plasmídio

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Esquema de clonagem num cosmídio

Local
COS polylinker

Amp r
Fragmentos DNA genómico,
ori parcialmente digerido, 35-45 kb
Cosmídio
(~ 5 kb) Cortar cosmídio, no “polylinker”, com enzima de
restrição.
Combinar fragmentos de DNA e vector cortado.

Empacotamento in vitro no fago .

DNA inserido entre locais COS adjacentes,
nas cabeças do fago.
Partículas virais
recombinantes

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Problemas associados com a clonagem em lambda
e cosmídios

Rearranjos. Sequências repetidas surgem no DNA de

eucariotas o que pode conduzir a recombinações daquelas
com o DNA inserido em lambda ou em cosmídios

Instabilidade. Por serem relativamente instáveis os cosmídios

são difíceis de manter nas células bacterianas

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Vectores PAC, BAC e YAC

Sobrepõem-se às capacidades limitativas de clonagem do

bacteriófago lambda (ca. 50 kb)

Aplicabilidade:
clonagem genómica / bibliotecas
projectos de sequenciação

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 HMW DNA embebido em LMP agarose

Vector de
clonagem

Digestão do DNA com Digestão parcial do DNA com enzima

enzima apropriada e apropriada.
desfosforilação Seleccionar fragmentos
150-400kb por PFGE

T4 DNA Ligase

Transformação em E. coli.
Plaquear em meio selectivo adequado
Recombinantes BAC - colónias brancas
Não recombinantes - colónias azuis
Seleccionar clones BAC, individualmente, e armazená-los
em placas
Biblioteca BAC ordenada

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Electroforese em campo pulsado de 42 clones BAC seleccionados
aleatoriamente e digeridos com NotI

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

Cromossoma artificial - YAC
É um cromossoma de levedura, em que a quantidade de DNA é
limitada, mas suficiente para uma replicação estável:

- sequências teloméricas
CEN4
- centrómero ARS SnaBI

TRP1 SUP4
- segmento de replicação
autónomo (ARS)
pYAC3
11.4 kb
Outras características:
URA3
- marcador de inserção do gene (SUP 4)
colónias (br: recomb.; verm: ñ recomb.)

- marcador de selecção (URA3 ou TRP1) TEL

TEL BBamHI B
BamHI

FAC. CIÊNCIAS DA VIDA Biotecnologia

 Bibliografia
• Brown (2010) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction,
Wiley-Blackwell, 6ª ed.; capítulo 2, 6 e 7

• Nicholl (2008) An Introduction to Genetic Engineering, Cambridge,

3ª ed.; capítulo 5

• Primrose & Twyman (2006) Principles of Gene Manipulation and

Genomics, Blackwell, 7ª ed.; capítulo 4 e 5

• Videira (2001) Engenharia Genética. Princípios e Aplicações, Lidel;

capítulo 4

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