Sebenta Teorica AEst Parte III

Espectrometria de massa
297
Espectroscopia de massa
1. Introdução à técnica
2. Espectrómetro de massa
Introdução da amostra
Técnicas de ionização
Analisadores
Detetores
3. Fragmentação das moléculas
Princípios gerais da fragmentação
Fragmentação de diferentes grupos funcionais
4. Análise de misturas
GC-MS; LC-MS
MS-MS
298
299
MS DLI TPS PB MALDI/TOF Q/TOF

MS/MS
ESI/TOF
GC-MS
ICP/MS
1970’s 1978 1980’s 1990 1995 1998 2000’s
FAB API ESI μESI Z-Spray APPI

APCI nESI LINAC Turbo V
400 800 1000 2500 300.000 500.000 1.000.000

Peso molecular (Dalton)
300
Prémios Nobel
Joseph John Thomson Francis William Aston Wolfgang Paul John Bennet Fenn Koichi Tanaka
1906 - Prémio Nobel da 1922 – Prémio Nobel da 1989 - Prémio Nobel 2002-Prémio Nobel da Química
Física Química da Física
Investigações espectrometria de massa, desenvolvimento da Desenvolvimento de métodos científicos de

experimentais e teóricas dos isótopos , num grande técnica trap de iões identificação e de análise estrutural de
sobre a condução da número de elementos não- macromoléculas biológicas
eletricidade por gases radioativos
301
4. Espectrometria de massa
Aspetos gerais
 grande utilidade na identificação de substâncias
 não envolve a absorção ou emissão de luz diretamente pelo composto
 baseia-se no comportamento dos iões positivos em campos magnéticos e

eletrostáticos e na
 abundância isotópica dos elementos
método analítico para medir pesos atómicos ou moleculares

Aspetos gerais
Principais informações :
 Pesos atómicos e moleculares obtenção da massa molecular da substância (pico

ião molecular)
 Fórmula molecular: pode ser calculada a partir da abundância das fragmentações

de picos isotópicos (M+1) e (M+2) em relação ao pico do ião molecular (HRMS)
 Identificação de compostos a partir das fragmentações por comparação do espectro

com o de um padrão ou um espectro da biblioteca
 Permite obter informações estruturais de moléculas orgânicas e biológicas
 Permite determinar a composição elementar (baixa MM; MS alta resolução)
 Estudo de misturas
303
Química Inorgânica
Análise Ambiental
Química dos Alimentos
Estruturas e Reatividade
Toxicologia e Metabolismo
Polímeros
Técnicas Acopladas
Análises Clínicas
Proteínas e Peptideos
Carbohidratos
Genética
Síntese Orgânica
Produtos Naturais
304
Aspetos gerais
Aplicações:
 Monitorização de espécies orgânicas voláteis em materiais e aerossois
 Resíduos de pesticida e compostos orgânicos em geral
 Detetar e identificar o uso de esteróides em atletas
 Monitorizar a respiração de pacientes por anestesistas durante a cirurgia
 Determinar a composição de espécies moleculares encontradas no espaço
 Adulteração de alimentos
 Monitorizar os processos de fermentação de indústrias biotecnológicas
 Determinar dioxinas em peixes contaminados

305
Aspetos gerais
 Caraterizado por picos

estreitos e afilados
xx - indica a razão m/z do ião
 A altura do pico indica a abundância relativa de um determinado ião (não

confiável para a quantificação)
intensidade do pico indica a facilidade de formação/movimentação do ião no espetrómetro

306
Aspetos gerais
O espetro de massa obtido depende
 Arranjo dos átomos na estrutura da molécula
 Força das ligações entre os átomos
 Energia usada no processo de ionização
 Instrumento usado
307
Características do analisador de massa
Intervalo Resolução Velocidade de

Precisão de massa scan
É uma medida de quão perto O intervalo no Uma medida Os analisadores

estão os valores obtidos. qual o de quão bem o tem scanners
A precisão varia espectrómetro espectrómetro com um tempo
dramaticamente de analisador de massa pode de massa de ciclo regular
para analisador dependendo operar separa iões de de baixo a alto
do tipo de analisador e da sua diferentes m/z, ou vice
resolução massas versa
308
Deteção dos iões

Separação dos iões
Fonte de iões
+
_
amostra ionizador analisador detetor
 A amostra é ionizada e ocorre fragmentação de moléculas (iões)

 são separados de acordo com a sua razão m/z
 os iões com diferentes valores m/z saem do analisador e são "contados"
309
Alto vácuo
Entrada Análise
Ionizador Analisador Detector
amostra dados
Injeção directa
Métodos de
separação
310
Introdução direta:
sólida, líquida ou gasosa
Métodos de separação:
LC- Cromatografia líquida
líquidas
CE- Eletroforese capilar
GC- Cromatografia gasosa gasosas
 A espectrometria de massa é uma técnica na fase de gás – as amostras líquidas ou

sólidas necessitam de ser vaporizadas
311
Introdução da amostra - LC
312
Introdução da amostra - LC
Garrafas de eluente
Desgasificador
Pós-coluna
bomba
Injetor
Bomba
Bomba
Compartimento
da coluna
Bomba
313
Introdução da amostra - GC
314
Introdução da amostra - GC
GC MS
Injetor
Entrada He Fonte ião Filtro massa
Detetor
Forno
315
Bombas difusoras
Bombas turbomoleculares
Sistema de alto vácuo Bomba rotativas
Entrada Análise
Ionizador Analisador Detetor
amostra dados
Injeção directa
Métodos de
separação
316
Sistema de vácuo
Pressão
1013 mbar 2x1019 moleculas/cm3

 É necessário para evitar as colisões (760 torr) Vácuo primário
Liofilização, transporte de
entre iões e moléculas material, embalagem,
iluminação, descargas,
substituição de gás, …
2x1014 moleculas/cm3
Consequências das colisões 10-2 mbar Alto vácuo
(7,6x10-3 torr) (10-2 mbar a 10-8 mbar)
 Alteração de trajetória dos iões Dispositivos electrónicos,
revestimentos ópticos e
 Transferência de energia outros, tratamentos
térmicos, …
2x108 moleculas/cm3
10-8 mbar
 Reações químicas Ultra-alto vácuo
(7,6x10-9 torr) (10-8 mbar a 10-11 mbar)
Microelectrónica,
simulação espacial,
investigação científica, …
10-11 mbar 2x105 moleculas/cm3

317
(7,6x10-12 torr)
Sistema de vácuo
A distância percorrida por um ião antes de colidir com uma molécula é dada por λ:
1
𝜆= N é a densidade do gás
𝑁𝜎 σ é a secção transversal
Pressão (Torr) Número da densidade do gás Percurso livre médio

(moléculas/cm3)
760 (Patm) 2,7 x 1019 1 μm
1 3,5 x 1016 0,05 mm
0,1 3,5 x 1015 0,5 mm
0,01 3,5 x 1014 0,5 cm
0,001 3,5 x 1013 5 cm
1 x 10-4 3,5 x 1012 50 cm
1 x 10-6 3,5 x 1010 50 m
1 x 10-8 3,5 x 108 5 km 318
Sistema de vácuo Pistão

Anel de água, jacto, etc.
Rotação
Adsorção
Roots
Bomba rotativas Ejetor
Bombas difusoras Difusão

Molecular
Bombas turbomoleculares Iónica
Criogénica
102 1 10-2 10-4 10-6 10-8 10-10 10-12 10-14 P (torr)
Bomba rotativas
Bomba difusora Bombas turbomoleculares 319
(vácuo primário)
(ultra-alto-vácuo)
Deteção dos iões

Separação dos iões
Fonte de iões
+
_
amostra ionizador analisador detetor
As diferenças nos tipos de MS estão em diferentes meios para realizar

estas três funções
320
Alto vácuo
Entrada Análise
amostra dados
EI
CI
FAB
MALDI
ESI
321
Agentes ionizantes
os que provocam dessorção do

os que requerem o
analito em amostras sólidas ou
analito em fase gasosa
liquidas
+ são aplicáveis a compostos pesados, não

voláteis e termicamente instáveis
322
Sensibilidade da técnica eficiência ionização
Métodos em fase gasosa

Impacto Eletrónico (EI) Electron Ionization
Ionização Química (CI) Chemical Ionization
Métodos por dessorção
Ionização por Bombardeamento de Fast Atom Bombardment

Átomos rápidos (FAB)
Ionização por Dessorção Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

da Matriz por Laser (MALDI)
Métodos por evaporação

Ionização por Electrospray ElectroSpray Ionization
(ESI) 323
Espectro eletromagnético
Energia (eV)
1010 108 106 104 102 100 10-2
Frequência crescente
Radiação ionizante Radiação não ionizante
E = 70 eV = 7x103 kJmol-1
Energia típica da ligação covalente= 2-6x102 kJmol-1
Ultravioleta: 3,1 a 100 eV

Ionização analíto em fase gasosa
 alguns dos iões moleculares são instáveis e fragmentam-se em iões menores
e-
ionização fragmentação
M̈ Ṁ + m1+ + ṁ 2
catião catião radical
2 e- radicalar
molécula ião ião fragmento

molecular
este processo requer tipicamente < 15 eV e o restante

da energia gera fragmentação dos analitos
Impacto Eletrónico
EI
+
e–
feixe e– + •
325
Impacto Eletrónico
326
Impacto Eletrónico ultravioleta 3,1 – 100 eV
70 volts
 A técnica mais usada (mais antiga) Trap
 O analito gasoso é bombardeado Iões

positivos
por eletrões com alta energia (70 Inlet
analisador
eV) provenientes de um
filamento (rénio ou tungsténio)
aquecido eletricamente Filamento Prato
Eletrões extração
Formação de iões positivos

 A energia do eletrão deve ser superior à energia de
M + eˉ M⁺ + 2eˉ 327
ionização da molécula (15 eV)
Impacto Eletrónico
 O espectro é um registo das fragmentações da molecula
H H
H C C H
H H
H H H H
e- + H C C H H C C+ H
H H H H
M+
H H
(M-R2)+ H C+ C H
(M-R1)+ H H (M-R1)+
(M-R3)+ M+
328
Impacto Eletrónico
Vantagens
 Método reprodutível e bem conhecido (bibliotecas de identificação)
 Fragmentação extensiva (dedução da estrutura molecular)
 Ionização altamente eficiente (método sensível)
 Ionização não selectiva (elevada produção de iões - todas as moléculas ionizadas)
 Amostras insolúveis (sem necessidade de matriz para solubilização)
 Interface com GC
 Amostras hidrofóbicas
329
Impacto Eletrónico
Desvantagens
 Formação apenas de iões positivos (não ideal para alguns grupos)
 Formação de catiões radicalares (complicam a interpretação)
 Limitada a amostras voláteis e termoestáveis
 Analitos de baixo peso molecular (<600 Da)
 Método relativamente energético (fragmentação extensiva-pico molecular)
 Ausência de interface com LC
330
Ionização Química
CI
 mistura do analito com um gás reagente em alta concentração (1 Torr)

 técnica relativamente mais suave que EI
repelente
filamento
íman
 Gás reagente: gás metano, iso-butano ou amónia
Gás metano
 Ionização do gás por impacto eletrónico CH4 + e-

.
CH4+ + 2e-
(iões primários) CH4+ CH3+ CH2+
 Pressão elevada: o catião radicalar CH4+. + CH4 CH5+ + .CH3

colide com outra molécula de metano CH3 CH4 C2H5 H2
ou C3H5+
 Ionização da amostra (M) pelo catião CH5+ + M CH4 + (MH)+

(iões secundários)
ácido muito forte em fase gasosa 333

 Outros reagentes: iso-butano e NH3

C4H10 + e- C4H9+ + H• + 2e-
NH3+• + NH3 NH4+ + NH2
 Transferência do protão depende da afinidade relativa entre o analíto neutro e o

gás reagente:
M + RH+ MH+ AR(CH4) = 543,5 kJ mol-1
AR(iC4H10) = 802,1 kJ mol-1
AR(NH3) = 853,6 kJ mol-1
334
Vantagens
 presença do ião molecular (MH)+ frequentemente visível

 menor fragmentação que em EI
 interface com GC
 amostras insolúveis (sem necessidade de matriz para solubilização)
Desvantagens
 menor fragmentação (menos informação estrutural) que em EI

 requer analitos volátil e termoestáveis
 analitos de baixa peso molecular (<800 Da)
 ausência de interface com LC
EI
CI - metano
CI – iso-butano
H2 >> CH4> C4H10> NH3> CH3-ONO> NF3>N2O

335
Ionização por bombardeamento de
átomos rápidos
FAB
337
FAB
 Usada em analitos não susceptíveis de analise pelos métodos de EI e CI
 não voláteis
 termicamente instáveis
 com alto peso molecular
 Indicada para a análise de biomoléculas
 O analito tem de ser solúvel ou criar uma suspensão homogénea numa matriz
líquida não-volátil
Matrizes mais comuns:

OH OH
HO OH HO SH
glicerol 1-tioglicerol álcool m-nitrobenzil 338

feixe átomos
FAB Analito/matriz Iões
analito Iões
matriz
 Um feixe de átomos neutros (Ar ou Xe) (6-

analisador
10 keV) ou por iões Ce⁺ de elevada energia Feixe de iões do analito
(iões secundários)
(10-30 keV) bombardeia a matriz com o
analito
Prato de extração Lentes de focalização
 Ocorre ionização e os iões e as moléculas

Iões ejetados
Feixe de átomos
dissolvidas são ejetados no estado gasoso
para análise
 As moléculas resultante são [MH]⁺ ou

[M-1]ˉ e alguns fragmentos iónicos
339
FAB
Vantagens
 Não é necessário o analito em fase gasosa, introdução de amostra líquida
 Ionização de intensidade intermédia
 São obtidos iões moleculares e fragmentos positivos e negativos
 Aplicável a uma grande variedades de moléculas
 Especialmente aplicável a biomoléculas de elevado peso molecular > 6000 Da
 Rápido e de elevada resolução
Desvantagens
 A amostra tem que ser solúvel na matriz
 Difícil quantificação
 Linha de base
 Requer um técnico altamente especializado 340
Ionização por Dessorção da Matriz por Laser
MALDI
341
MALDI
 Técnica desenvolvida recentemente para a ionização de moleculas de elevado

peso molecular (peptídos, proteínas, oligossacarídeos, etc)
 Ionização suave (a energia dada às moléculas do analito cerca de 4eV)
 Técnica muito semelhante à técnica de FAB: o analito é colocado numa matriz -sólida
 Efetua-se uma mistura da matriz com solventes normalmente água, acetonitrilo (ou
etanol) e ácido trifluoracético (agente de ionização)
ACN/água/TFA
(50/50/0,1)
342
MALDI
 A mistura analito/matriz/solvente é colocada

num placa de metal (suporte condutor)
O solvente é evaporado de forma a se formar

um deposito sólido o mais regular possível
343
MALDI
Matriz deve ser:
 Capaz de se misturar com o analíto para que ocorra co-cristalização
 Estável em condições de vácuo

 Promover co-dessorção do analito aquando da irradiação do laser
 Causar a ionização do analito
 Existe uma grande variedade de matrizes

A escolha tem por base
as características do analito (hidrofóbico/hidrofílico) ou
com base na absorvância da matriz (cromóforo) à radiação laser (UV)
344
MALDI
O
O O
H3CO
HO OH
OH OH
CN HO
HO OH
OCH3
Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico Ácido 2,5-dihidroxibenzóico Ácido 3,5-dimetóxi-4-hidroxicinâmico

(CHC) (DHB) (Ácido sinapínico)
337 , 355 nm 337, 355, 266 nm 337, 355, 266 nm
Péptidos, lípidos, nucleotidos Pequenas moléculas, Grandes péptidos,

Pequenos péptidos, Grandes proteínas, lípidos
Nucleotidos, Lipidos,
oligossacarideos
345
MALDI
Matrizes selectivas
 superfície modificada com uma funcionalidade química
Superfícies químicas
(Hidrofóbica) (Hidrofílica OH)
(Aniónica C=O) (ião metálico) 346

(Catiónica NH3)
MALDI
Matrizes selectivas
Superfícies biológicas
(Anticorpo-Antígeno) (Recetor - Ligante) (DNA - Proteína)
347
MALDI
 Feixe de laser pulsado de radiação UV

 Absorção da radiação UV pelo cromóforo da matriz com posterior ionização (XH+)
 Dissociação da matriz (gás carregado e em supercompressão) com ionização da
molécula do analíto por transferência de protão (XH+ + M → MH+ + X)
 Explosão da matriz a elevada velocidade levando o analíto por arraste
337 nm UV laser
Analito/matriz
Laser
MH+ analisador Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico
348
MALDI
Vantagens
 Processo independente do tamanho dos analítos e das suas propriedades de adsorção

 Aplicável a moléculas de elevado peso molecular: biomoléculas, (peptídos, proteinas,
DNA, etc) >500 kDa
 Sensibilidade elevada para proteínas
 Método de ionização suave

 Origina iões moleculares carregados com carga simples: (MH)+ (MH)-
 Requer pequenas quantidades de analíto (10 mL de solução 1 pmol/mL)
Desvantagens
 Dificuldades de quantificação
349
 Interferência da matriz
Ionização por Electrospray
ESI
350
 Método de produção de iões moleculares não voláteis de elevado peso molecular
 Técnica de ionização suave que permite estudos de associações não covalentes entre
macromoléculas (ex. proteínas)
 O analíto tem que ser solúvel em solventes polares de baixo ponto de ebulição como o
metanol, acetonitrilo ou a água
 O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização da solução num campo
elétrico intenso
formação de gotículas altamente carregadas

351
352
Placa carregada
(Contralectrodo)
agulha de Múltiplas
 O analito dissolvido é nebulização
Cone de
Taylor gotas carregadas
colocado num capilar de aço Amostra

Evaporação Explosão MH+
em
solvente coulômbica MH2+
inoxidável (70 - 150 mm) solução
limite “Rayleigh” MH3+
é atingido Iões
polarizado Gás Molécula Múltiplas
analito
nebulizador- N2 Analíto
gotas carregadas
 A solução é nebulizada como gotas Fonte

de Energia
carregadas (cargas na superfície) e flui 2-5kV
num elevado campo eléctrico (2-5 kV)
 Ocorrem várias evaporações consecutivas do solvente até que a repulsão se torna elevada
e origina a explosão em pequenas gotículas e moléculas de analito carregadas 353
MH+
MH2+
MH3+
 Iões formados podem apresentar cargas múltiplas:

grandes moléculas: uma carga / 1000 Da
pequenas moléculas: normalmente carregadas unitariamente
 Podem obter-se iões (-) ou (+) dependendo do campo eléctrico aplicado
354
Modo de ião positivo ou negativo?
Modo de ião positivo

 Se o analito tem grupos funcionais que facilmente aceitam H+, como as amidas e os
grupos amino dos aminoácidos dos péptidos e proteínas
Modo de ião negativo

 Se o analito tem grupos funcionais que facilmente perdem um H+ , tais como ácidos
carboxílicos e grupos hidroxilo como os encontrado nos ácidos nucleicos e açúcares
 medidas no modo ião positivo (adição de ácido fórmico ao solvente)

 medidas no modo iões negativos (adição de amónia ao solvente)
355
Vantagens
 Obtenção do ião molecular
 Baixa fragmentação
 Possível análise de analitos de alta massa molecular (>100 kDa)
 Aplicável a compostos carregados, polares ou bases
 Interface mais eficaz e bem sucedida para LC
 Limite de deteção 10-18 mol
 Boa resolução
Desvantagens  Fraca fragmentação

 O analito necessita de ser solúvel em solventes polares 356
Analito Técnica Agente ionizante

Fase gasosa Impacto Eletrónico (EI) Feixe de eletrões energéticos (70 eV)
contra um analito gasoso
Ionização química (CI) Iões de um gás reagente contra um
analito gasoso
Dessorção Ionização por Bombardeamento Feixe de átomos (Ar, Xe) energéticos (6
de Átomos rápidos (FAB) KeV) sobre uma mistura líquida
Ionização por dessorção da matriz por Feixe de laser (UV) sobre uma mistura
laser (MALDI) sólida onde a matriz absorve radiação UV
Evaporação Ionização por Electrospray (ESI) Campo eléctrico intenso sobre uma
mistura na forma de spray líquido
357
Método de ionização Iões formados Sensibilidade Vantagem Desvantagem
EI M+ ng – pg Base de dados M+ ocasionalmente

Informações estruturais ausente
CI M+1, M+18,… ng – pg M+ usualmente presente Pouca informação
estrutural
FAB M+1, µg – ng Compostos não-voláteis Interferência da matriz
M+catião, Informações de Difícil de interpretar
M+matriz sequenciamento
MALDI M+1, µg – ng Compostos não-voláteis Interferência da matriz
M+matriz Informações de
sequenciamento
ESI M+, M++, ng – pg Compostos não-voláteis Classes limitadas de
M+++,.. Faz interface com LC compostos
Produz iões com mais de uma Pouca informação
carga estrutural
358
Escolha do método
EI e CI: compostos pequenos, voláteis e termicamente estáveis

EI é útil para informações estruturais
CI é útil para a determinação da massa molecular
FAB, MALDI e ESI: moléculas grandes, não voláteis, termicamente

instáveis e polares
359
Analisadores
Alto vácuo
Entrada Análise
amostra dados
EI MSA
CI Quadrupolo
FAB Ião Trap
MALDI TOF
ESI FT-ICR
360
Analisadores
 O analisador de massa é semelhante a um prisma – separa os iões
detetor
Analisador de massa
Fonte
separador de iões
de iões
Fonte
da luz Prisma
361
Analisadores
Analisador de massa
 separa os iões formados no compartimento de ionização

 é o coração do espetrómetro de massas
 Principais caraterísticas de um analisador:
limite de massa
transmissão iónica
poder de resolução em massa
1. Limite de massa
 valor mais alto de massa que pode ser medido (expresso em Da)
2. Transmissão iónica
 razão entre o número de iões que chegam ao detetor e os iões
produzidos na fonte 362
Analisadores
3. Poder de resolução
 capacidade de produzir dois sinais distintos para dois iões com uma diferença de
massa pequena
Alta resolução
Baixa resolução
6130 6140 6150 6160 6170

m/z
 A resolução necessária depende do objetivo
363
 baixa resolução a massa medida é uma massa média
Analisadores
 quantificado por
m
R=
∆m
∆m é a menor diferença de massa capaz
de ser resolvida
∆m é a largura de um pico à meia altura
R= 3000 R= 5000 R= 7000

100 100 100
80 80 80
Intensity (%)
Intensity (%)
Intensity (%)
60 60 60
40 40 40
20 20 20
364
0 0 0
111.95 112.00 112.05 112.10 111.95 112.00 112.05 112.10 111.95 112.00 112.05 112.10
M [ ] M [ ] M [ ]
Analisadores
 MS com resolução de 1000 consegue separar iões com m/z de 100,0 e 100,1
 baixa resolução: separam somente os iões que diferem na massa nominal (≥ 1 u.m.a.)
 Espectrómetro de massa de alta resolução: separam iões que diferem em 0,0001
u.m.a.
8000
15 ppm Resolução =18100
6000
24 ppm Resolução = 14200
4000
2000
0
2840 2845 2850 2855 m/z 365
Analisadores
15 ppm m/z 300 = 300*(15x10-6) = ±0,0045 Da

18100 m/z 300 =300 / 18100 = 0,017 Da
A exatidão depende da resolução ⇒ Altas resoluções significam melhores exatidões
8000
15 ppm Resolução =18100
6000
4000
2000
0
2840 2845 2850 2855 m/z 366
Analisadores
 C20H9 e C18H20N têm massas nominais de 249 e 250

podem ser distinguidos por MS baixa resolução
 Uma resolução de 5000 é suficiente para

C20H9+ C19H7N+ C13H19O2N3+ os separar
 têm a mesma massa nominal
C19H7N+` C20H9+ C13H19O2N3+
249 367
249,058 249,070 249,1479
Analisadores
 a partir das tabelas de combinações das massas das fórmulas com os pesos isotópicos
naturais de cada elemento, é muitas vezes possível encontrar a fórmula molecular exata
ião molecular de 98,0372

a partir da massa 98 :
C3H6N4 98,0594
C4H4NO2 98,0242
C4H6N2O 98,0480
C4H8N3 98,0719
C5H6O2 98,0368 fórmula exata
C5H8NO 98,0606
C5H10N2 98,0845
C7H14 98,1096
368
 MS alta resolução pode substituir análise elementar para confirmação fórmula química
Analisadores
Massa monoisotópica
corresponde ao pico de menor massa Elemento Massa Abundância (%)
1981,84 H 1,0078 99,985%
sem 13C (todos 12C)
2,0141 0,015
C 12,0000 98,89
1982,84 13,0034 1,11
um 13C
N 14,0031 99,64
15,0001 0,36
O 15,9949 99,76
1983,84 16,9991 0,04
17,9992 0,20
dois 13C
peptídeo com 94 C
(19 resíduos de aminoácidos)
369
 Quando os isótopos estão resolvidos a massa monoisotópica é usada como a medida mais precisa
Analisadores
Analisadores
Separação dos iões de acordo com a razão m/z
função da energia  setor magnético a separação é

baseada no momento e energia dos
função do momento
iões
magnético
função da velocidade
 TOF os iões são separados de acordo
com a sua velocidade
 Existem diversos dispositivos

todos devem permitir a passagem de um nº de iões suficiente para fornecer
370
uma corrente de iões facilmente mensurável
Setor magnético
MSA
Iman
Iões da fonte
371
Detetor
Analisadores
Setor magnético
 Os iões vaporizados e ionizados ao passarem por um íman (campo magnético) são

submetido à ação de uma força magnética (B) e sofrem desvio em direção ao detetor
Detetor
Mais leve
filamento
Partículas carregadas
Eletrões ionizam a amostra
Injeção amostra Mais pesado
O campo magnética separa as

partículas baseado na razão
Fonte eletrões massa/carga
Partículas aceleradas no Iman

campo magnético
372
Analisadores
Setor magnético
 Somente os iões com determinada razão m/z que tenham iguais forças centrípetas
e centrífugas passam através do magnete
Energia cinética E = mv2/2 = zV
v: velocidade
Força magnética Bzv = mv2/r
V: tensão aplicada
r: raio de curvatura
Equação setor magnético m/z = B2r2/2V
 a razão m/z dos iões que atingem o detetor pode ser variada mudando tanto o campo
magnético (B) como a tensão aplicada (V – mais rapidamente) 373
Analisadores
Setor magnético
 De maneira a aumentar a resolução, passaram a ser construídos aparelhos de

espectrometria de massas de dupla focalização
 o analisador elétrico atua como um filtro de

Fonte de iões energia cinética, permitindo que apenas iões
+ Setor
com a mesma razão energia cinética/carga
V magnético
específica possam atravessá-lo
+E
-E
Detetor
 no setor magnético são dispersos de acordo
Setor
elétrico
com a sua razão momento/carga
0,5 – 2,0 m
 a adição do analisador de campo eléctrico aumenta a resolução de um fator de até 100.000
 é comumente utilizado com fontes de ionização EI, CI ou FAB 374

Analisadores
Setor magnético com dupla focalização
Vantagens Aplicações
 Alta resolução (R=60 000)  Para todos os compostos orgânicos
 Alta sensibilidade  Para determinação de massas exatas
 Alta exatidão (<5 ppm)  Medidas de distribuição isotópica
 Faixa de massa até 10 kDa
 Melhor desempenho quantitativo entre todos os analisadores
Desvantagens
 Aparelhos muito grandes e mais caros

 Scans relativamente lentos
 Inadequadas para técnicas de ionização pulsada (MALDI e ESI)
 Baixa resolução no modo MS/MS sem uso de múltiplos analisadores 375
Quadrupolo linear
Q
376
Analisadores
Quadrupolo linear
 Consiste em quatro tubos metálicos (elétrodos) paralelos

2 tubos positivos opostos
2 tubos negativos opostos
nos quais se aplica um campo eletromagnético
Ião ressonante
Ião não ressonante
 Os tubos alternam sinais de

radiofrequência entre pares,
permitindo a separação dos iões
377
Analisadores
Quadrupolo linear
 Para uma determinada corrente e voltagem, somente iões com dada razão m/z
seguem o trajeto entre os tubos - todos os outros são desviados para fora do
quadrupolo
Quadrupolo
Fonte
de iões
Detetor
20 – 50 cm
 Detetam-se todos os iões variando gradualmente a corrente e voltagem aplicadas

378
Analisadores
Quadrupolo linear
Vantagens
 Espetros de massa “tradicionais”

 Aparelhos relativamente pequenos (20 cm), mais barato e robusto que o setor
magnético
 iões acelerados com baixas energias cinéticas (15 eV)
 Método rápido, varreduras rápidas – análise em real-time
 Fácil estabelecer interface com a maioria das fontes de iões

ideal para acoplar à cromatografia líquida
379
Analisadores
Quadrupolo linear
Desvantagens
 Baixa resolução
 Baixa exatidão (>100 ppm)
 Inadequada para técnicas de ionização pulsadas (MALDI)
 Limite máximo m/z de 5 kDa
 Para aplicação em MS/MS requer múltiplos analisadores de massa
Aplicações
 Na maioria dos equipamentos de LC/MS e GC/MS

 Sistemas de quadrupolo triplo MS/MS e em sistemas magnético/quadrupolo MS/MS
380
Quadrupolo com armadilha de iões
QIT
381
Analisadores
 Pode ser considerado uma variação do quadrupolo linear
Q age como QIT pode segurar os iões formados no campo

filtro de massas magnético (possibilidade de aplicação ao MS/MS)
Elétrodo
anel
Espaçador
Filtro massa quadrupolo
Fonte de iões
Detetor
capsula anel capsula

Elétrodo
Elétrodo
capsula
capsula
 Os iões aprisionados são sequencialmente libertados

para o detetor produzindo o espetro de massas 382
Analisadores
 Consiste em 3 elétrodos
um elétrodo em anel
dois elétrodos em forma de tampa
 Diferentes voltagens de radiofrequências são

aplicadas ao elétrodo em forma de anel
 Variando-se a voltagem ocorrem rápidas inversões na

direção do campo, acelerando e desacelerando os iões na
direção axial e radial, aprisionando-os
 Aumentando-se a voltagem, os iões assumem trajetórias instáveis e saem da trap por

ordem de m/z crescente 383
Analisadores
Vantagens
 Alta sensibilidade: iões são pré-concentrados e sucessivamente analisados

 Permite a realização de MS em multi-etapas
 Baixo custo, simples, robusto e pequeno (5 x 5 x 5cm)
 Fácil interface com vários modos de ionização
 Pode ser usada como único analisador quando aplicado ao MS/MS
Desvantagens Aplicações
 Baixa resolução
 Sistemas GC/MS, LC/MS e MS/MS
 Análise de iões específicos
 Baixa faixa de massas (<5 000 Da)
 Varrimento lento 384
Tempo de Voo
TOF
385
Analisadores
TOF
Fonte de iões
Tubo de voo Detetor
±V 0,5 – 2,0 m
 é baseado no facto de iões com diferentes valores m/z terem diferentes

velocidades e portanto alcançarem o detetor em diferentes tempos
 Medida do tempo que um ião leva para ir da fonte de iões até ao detetor
386
Analisadores
TOF
 Todos os iões são acelerados por um campo eletrico após o ionizador

recebem o mesmo acréscimo de energia cinética durante uma aceleração
rápida (0,1 a 1 ms)
Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3
Iões Detetor
Região I Região II
Tubo de voo
Válvula de
pulso
Tubo voo
Detetor
Volts
e- 387
Tempo
Analisadores
TOF
 Movem-se em direção do detetor pelo tubo de voo, sem influência de qualquer campo
elétrico ou magnético
 A energia cinética de um ião é E= 1/2mv2 v = (2E/m)1/2
≠ valores de m/z ≠ velocidade à medida que atravessam o tubo
 iões mais leves têm velocidade maior que os pesados e atingem o detetor em
menos tempo
388
Analisadores
TOF
Equação espectro massa (TOF)
m = massa do ião
m 2Vt 2
z = carga do ião
= 2
z L t = tempo de viagem
V = voltagem
L = comprimento do tubo
O poder de resolução do TOF é função:

 comprimento do tubo de voo
 da voltagem de aceleração inicial
 das distribuições iniciais de velocidades dos iões 389
Analisadores
TOF
Vantagens
 Não há limite superior de deteção de m/z

 Analisador rápido
 Adequado para acoplar ao MALDI Aplicações
Desvantagens
 Todos os sistemas MALDI
 Sistemas de GC/MS muito rápidos
 Baixa resolução para o modo MS/MS
 Requer o método de ionização pulsado (MALDI)
 Seletividade ião-precursor limitada para a maioria das experiências MS/MS
390
Analisadores
TOF
Tempo linear do tubo de voo
Fonte de iões
detetor
Tempo de voo
Tempo com refletor no tubo de voo
Fonte de iões
detetor refletor
Tempo de voo
391
Analisadores
Tempo de Voo Refletido (re-TOF) Detetor linear
Refletor de
iões
 O refletor localizado na extremidade do tubo TOF é

usado para compensar a diferença em tempos de
voo de iões com o mesmo m/z, mas diferentes
energias cinéticas
 O refletor usa um campo eletrostático constante

para refletir o ião em direção ao detetor
massa = massa
energia > energia
 Os iões mais enérgicos penetram mais

profundamente tendo um caminho mais longo  Alta resolução (>20 000)
até ao detetor  Alta exatidão (< 5 ppm) 392
Analisadores
Tempo de Voo Refletido
Baixa resolução devido à variação da

velocidade dos iões com = m/z
A reflexão melhora significativamente

a resolução para massas < 6 000 Da
393
Analisadores
FT-ICR
 aprisionamento de iões num campo magnético e elétrico, seguido da medição das

suas frequências de ressonância ciclotrónicas
 composto por seis placas (pratos) arranjadas em forma de cubo (célula cúbica) colocadas
no centro de um íman supercondutor com campo magnético muito forte (6-7 T)
2 excitação dos iões

Pratos de
2 detetoras de iões deteção Pratos de Corrente
excitação alternada
induzida
2 traps traps
Espectro de
massa
Campo
magnético
394
Analisadores
FT-ICR
 Uma voltagem sinusoidal é aplicada às placas de excitação
 O ião sujeito ao campo magnético adquire um movimento em espiral com frequência

ν = zB/2pm é inversamente proporcional à massa
 Os iões que estão em ressonância com a frequência

de excitação ganham energia cinética e afastam-se
em espiral do centro da célula para uma maior
orbita
 a oscilação ciclotrónica é sentida pelas placas detetoras, produzindo uma corrente

que pela FT é convertida em υ ⇒ nas massas dos iões presentes
395
Analisadores
FT-ICR
Vantagens
 Muito alta resolução

 Excelente exatidão (<1 ppm)
 Adequado para uso com métodos de ionização pulsada como MALDI
 MS/MS em um único analisador
FT-ICR
(Campo magnético íman supercondutor) 
Desvantagens
Fonte Amplificador
de iões diferencial
 Caro
 Requere um íman supercondutor
 MS/MS lento
2 – 5 cm
396
Analisadores
Analisador Princípio Aspetos importantes

Setor magnético (MSA) Trajetória alterada pelo campo magnético. Alta resolução
Raio da trajetória de acordo com m/z massas exatas
1-15000 m/z
Quadrupolo linear (Q) Trajetória sobre influencia de um campo Baixa resolução (1 u.m.a.)
elétrico (radiofrequência). Filtra iões de scan rápido
acordo com m/z baixo custo
Faixa de massas baixa (1-5000 m/z)
Quadrupolo Ion trap Trajetória sobre influencia de um campo Baixa resolução (1 u.m.a.)
(QIT) elétrico (radiofrequência). Aprisiona e Faixa de massas baixa (1-5000 m/z)
liberta os ião de acordo com m/z Baixo custo
Alta sensibilidade
analisador de massa tudo-em-um (MSn)
Tempo de voo (TOF) Aceleração de iões. Sem limite superior m/z
Velocidade é função do m/z alto rendimento
Resolução muito alta
Ressonância ciclotrónica Campo magnético constante e campo Muito alta resolução
com Transformada de elétrico (radiofrequência). massas exatas
Fourier (FT-ICR) Aprisiona os iões em movimento de Alto custo
ciclotrão. Até 70 kDa
Frequência orbital convertida no sinal m/z
397
Detetores
Alto vácuo
Entrada Análise
amostra dados
EI Setor Mag. Sem multiplicador

CI Quadrupolo Com multiplicador
FAB Ion Trap
MALDI TOF
ESI FT-ICR
398
Detetores
ião
-1000V
 os detetores recebem os iões que foram +

e-
e-
separados pelo analisador, transformando a e- e
-
corrente de iões em sinais elétricos

-100V
 integram estes sinais para permitir que o instrumento indique qual o m/z que atingiu
o detetor
 classificados como detetores sem multiplicação de eletrões e com multiplicação de

eletrões
Copo de Faraday Multiplicador de Eletrões
Detetor de carga (ou indutivo) Dínodo de conversão fotomultiplicador
Detetor de Array 399

Detetores
Copo de Faraday
 São dispositivos metálicos (BeO, GaP ou CsSb) que

geram uma corrente elétrica quando os iões batem na
superfície - os eletrões fluem para neutralizar a carga
 a corrente de eletrões passa por um reóstato R de valor conhecido
 se medirmos a tensão ela vai ser diretamente proporcional à concentração dos iões que
chegam ao detetor
 Tempo de resposta rápido

 Sinal/ruído baixo
 Alta eficiência de recolha dos iões
 Resposta idêntica para todas as massas
400
Detetores
Multiplicadores de eletrões
 Constituído por uma série (12 a 14) de dínodos polarizados com alta tensão (1-3 kV)
 Quando um ião colide com alta velocidade sobre o primeiro dínodo causa uma emissão
de certa quantidade X de eletrões
 Os X eletrões são atraídos para o segundo dínodo, aumentam em X2 e estes X2 eletrões ….
 A quantidade final de eletrões amplificados aparece como uma progressão geométrica

com ganho de Xn onde n é o número total de dínodos
Entrada iões
401
Detetores
Dínodo de conversão fotomultiplicador
Dínodo de
conversão
Entrada
de iões
Eletrões Dínodo de  os eletrões secundários batem num ecrã

secundários conversão
fosforoso em vez do dínodo
Ecrã fosforoso
fotões  o ecrã liberta os fotões que são detetados
pelo fotomultiplicador
Tubo
multiplicador
402
Detetores
Detetor Array
Eletrões Capilares de vidro ocos com

secundários revestimento emissor de eletrões
Ião incidente
Eletrões
secundários
 tem sido tipicamente usado em analisadores de massa de setor magnético (MSD)
 A principal vantagem é a alta sensibilidade para intervalo de massas pequeno
403
2. Espectrómetro de massa
Analisadores
Detetores
Fragmentação de diferentes grupos funcionais
GC-MS; HPLC
MS-MS
404
Diferentes configurações com MS
GC-MS - Gas Chromatography MS
Separa os compostos voláteis em colunas de GC e identifica os compostos por m/z
LC-MS - Liquid Chromatography MS
Separa compostos em solução em colunas de LC e identifica os compostos por m/z
MS-MS - Tandem Mass Spectrometry
Separa fragmentos de compostos e identifica-os por m/z
LC/LC-MS/MS-Tandem LC e Tandem MS
Separa por HPLC, identifica por m/z
405
Espetroscopia cromatografia-massa
43
Cromatografia: Separação
57
29 71
15 85
GC-MS 99 113 142
m/z
LC-MS
Massa: Deteção
406
GC/MS
407
GC/MS
Mass
HEWLETT 5972A Selective
PACKARD Detector
1.0
DEG/MIN
MS
HEWLETT
PACKARD
5890
Amostra Cromatografo de gás Espetrometro de massa
B
D A
AD B A C B
BD C
A
C D
Amostra Separação Identificação

408
LC
409
MS/MS
410
MS/MS
 o objetivo é fragmentar iões dos iões precursor para fornecer informação estrutural
acerca da molécula Espetro MS1
Amostra Espetro MS2
MS1 MS2
Fragmentação
 a fragmentação é induzida através de um processo denominado decomposição

induzida por colisão (CID) - célula de colisão- colide com um o gás (Ar ou Xe) o que
resulta em fragmentação
 os fragmentos gerados são separados em um analisador, gerando um espetro de

fragmento
411
MS/MS
MS1 MS2
CID
Ião produto
Ionização
Ião precursor
412
MS/MS
Fonte Detetor
MS1 Célula MS2

colisão
 Usa dois ou mais analisadores separados por uma célula de colisão
EI Célula de
ESI
MALDI
colisão
+
+
amostra ionização + Separação m/z + Separação m/z Separação m/z Deteção
+
+
- +
MS1 MS2 413

Ião precursor Ião produto
MS/MS
Diferentes configurações de MS
Diferentes estratégias e configurações podem ser de acordo com a aplicação específica:
 Quadrupolo-quadrupolo
 Quadrupolo-tempo de voo
 Tempo de voo – tempo de voo
 Sector magnético-quadrupolo
ESI-Q-TOF MS
ESI-QIT MS
Intensidade
ESI-FTICR MS
Massa (m/z) MALDI-TOF MS
MALDI-TOF-TOF MS
MALDI-Q-TOF MS
TOF 1 TOF 2
Célula MALDI-QIT MS
fonte colisão 414
MALDI-FTICR MS
MS/MS
para determinar proteínas :

 massa total da proteína
 sequência de aminoácidos
 quantificação de uma proteína numa mistura
ESI-QTOF
 Fonte ionização eletrospray + quadrupolo +
MW e seq. AA analisador massa tempo de voo
MALDI-QTOF
 Ionização por desorção laser matriz assistida +

quadrupolo + analisador massa tempo de voo
 MALDI-TOF MW
 Quadrupolo Triplo seq. AA
415
MS/MS
E G S F F G E E N P N V A R
175,10
246,14
345,21
459,25
556,30
670,35
799,39
928,43
985,45
1132,52
1279,59
1366,62
1423,64
1552,69
416
2. Espetrómetro de massa
Analisadores
Detetores
GC-MS; HPLC; MS-MS

Fragmentação de diferentes grupos de compostos
5. Exemplos de aplicação
417
Fragmentação
Espetro de massas
 gráfico representa a abundância relativa de iões vs. razão massa /carga (m/z)
 o ião mais abundante formado durante o processo de ionização dá origem ao
pico mais intenso- pico base do espetro
Pico base
Abundância relativa (m/z 43)
418
Fragmentação
Espetro de massas
 as intensidades de todos os outros picos do espetro são indicadas como uma

percentagem do pico base
 se o analito perde somente um eletrão durante o processo de ionização é observado

no espetro o pico do ião molecular - M+
Pico base
(m/z 43)
[M+H]+
Abundância relativa
[M+C2H5]+ M+ (m/z 114)

[M+C3H5]+
[M+NH4]+
419
Fragmentação
Espetro de massas
 quando o M+ adquire energia muito alta dá-se a formação de moléculas menores

carregadas - iões fragmento
iões fragmento
Pico base
(m/z 43)
M+ (m/z 114)
 fragmentos neutros e radicais não são registados - é inferida pela massa dos iões fragmento420
421
Fragmentação
Fragmentação
 a colisão/pertubação de um eletrão com alta energia com as moléculas da

amostra provoca não somente a perda de um eletrão, mas também transfere
energia cinética para o ião que se forma
 a energia transferida aumenta significativamente a energia vibracional das

ligações, levando à quebra e à formação de fragmentos
 devido à baixíssima concentração de moléculas da amostra na câmara de

ionização, todos os processos de fragmentação são unimoleculares
422
Fragmentação
Fragmentação
 a fragmentação de moléculas que têm deficiência de 1 electrão (M+.) resulta na

quebra de ligações A+ + F•
Detetado Não observado por

M•• + e- → 2e + M+• por MS MS
Detetado C+• + F
por MS
CH2 + H2C
CH3
ou simplesmente 423
57
Fragmentação
Fragmentação
 os processos de fragmentação seguem reações que originam espécies o mais
estáveis possíveis do ponto de vista termodinâmico
 estruturas cíclicas e ligações duplas estabilizam o ião molecular
 a ordem de estabilidade dos carbocatiões é sempre
arilo > alílo > metilo > H catião 3º > catião 2º > catião 1º > metilo > H
424
Fragmentação
Fragmentação
 os pontos de ramificação são os primeiros a ser fragmentados
 a estabilidade do catião será predominante sobre a estabilidade do radical
regra de Stevenson
o fragmento mais estável (de menor energia) ficará carregado positivamente (catião)
o fragmento remanescente ficará na forma de radical
exemplo: iso-butano + CH3
+ CH3
425
Fragmentação
Fragmentação
A. clivagem de uma ligação σ
1. clivagem C-C
2. clivagem C-heteroátomo
3. clivagem α de C-heteroátomo
B. rearranjos e clivagens σ de duas ligações
1. eliminação do H(α) e do heteroátomo

2. Retro-Diels-Alder (RDA)
3. rearranjo de McLafferty (McL)
426
Fragmentação
Fragmentação
A. clivagem de uma ligação σ
1. clivagem C-C
C C C C
+
2. clivagem C-heteroátomo
C Z C Z
+
427
Fragmentação
Fragmentação
3. clivagem α de C-heteroátomo
C C Z C + C Z
C C Z C + C Z
C C Z C C + Z
1. eliminação de H (α) e do heteroátomo
C C Z C C + H Z
H
428
Fragmentação
Fragmentação
2. Retro-Diels-Alder
Mecanismo
completo +
abreviado
+
(C2H4) - perda de 28
CH3 CH3
429
Fragmentação
Fragmentação
3. rearranjo de McLafferty – McL (eliminação 1,4)
mecanismo
completo
abreviado
430
Fragmentação de diferentes
grupos de compostos
431
Fragmentação - Alcanos
 M+ é geralmente observado para alcanos lineares
 sinais observados:
agregados de picos CnH2n+1
fragmentos com perdas de -CH3, -C2H5, -C3H7 …
série de nº ímpares de m/z (14Cn + 1): 15, 29, 43, 57, 71, 85 ...
perdas de massa de 14
 frequentemente os picos em m/z 43 e 57 são os mais intensos

iões propílico e butílico (n=3 e n=4)
432
433
n-heptano
Intensidade relativa
43
57
M+
434
Alcanos-ramificados
 fragmentação preferencial junto à ramificação: formação de carbocatiões 2ª e 3ª
 o sinal M+ tende a diminuir ou a desaparecer em alcanos ramificados grandes
 alcanos muito ramificados não originam M+
↑ ramificação ↓ intensidade de M +
 m/z 43 e 57 continuam a ser os sinais mais intensos
iões iso-propílico (2º) e terc-butílico(3º)

435
Alcanos - ramificados
2,2-dimetilhexano
M+ (114)
57
436
Cicloalcanos
 observam-se picos M+ intensos
 cadeias ligadas ao sistema cíclico sofrem facilmente fragmentação
 a clivagem de duas ligações σ levam à formação do fragmento neutro - o eteno

H2C CH2
HC C R
+ H2C CH2
H H
C
H2
n m=28
437
Cicloalcanos
+
Ciclohexano
M – 28 (56) C4H8+
M+ (84)
C3H5+ (41)
438
Cicloalcanos
4-metil isopropilciclohexano
97
M+ (140)
439
Fragmentação - Alcenos
 M+ frequentemente observado e mais intenso que no alcano correspondente
 sinais observados
agregados de picos CnH2n-1 e CnH2n (mais fracos)
fragmentos com perdas de -C3H5, -C3H4,-C4H7, -C5H9 …
série de nº ímpares de m/z (14Cn -1): 27, 41, 55, 69, 83, 97 …
série de nº pares de m/z (14Cn): 28, 42, 56, 70, 84, 98 …
 perdas de massa de 14
 clivagem favorecida é a alílica
 alcenos terminais fragmentam sempre dando origem ao catião alilo
+
H H
R C C CH2 R + H 2C C CH2
H H
m/z 41
440
cis-2-penteno
55
M+ (70)
441
alcanos vs. alcenos
octano (75 eV)

M+ 114
m/z 85, 71, 57, 43 (base), 29
alcanos vs. alcenos

octeno (75 eV)

M+ 112
m/z 83, 69, 55, 41, 29
m/z = 41
442
Cicloalcenos
 M+ são intensos e frequentemente observados
 fragmentação via Retro-Diels-Alder
observado perda de 28
443
Cicloalcenos
1-metil-1-ciclohexeno
81
68
M+ (96)
444
Fragmentação - Alcinos
 M+ frequentemente observado
 para alcinos terminais, a perda do hidrogénio terminal é frequentemente

observada (M-1)
é tão intenso que muitas vezes constitui o pico base do espectro
pode até suprimir a presença do M+
 alcinos terminais formam o catião propagilo, m/z 39
[R-CH2-C≡CH]+• → R • + H2C+-C ≡CH

m/z 39
445
1-pentino
H 67
39
M+ (68)
446
2-pentino
M+ (68)
53
447
Fragmentação - Aromáticos
 M+ intenso
 muito pouca fragmentação do sistema aromático
75 eV e-
 anéis aromáticos com grupos alquilo sofrem fragmentação com formação do

catião tropílio C7H7+ (m/z 91), formado a partir do rearranjo do catião benzílo
CH3 CH2
C7H7+ (m/z 91) 448

I. CH2
m/z = 162 m/z=91
HC CH HC CH
m/z=39 m/z=65 m/z=91
Cadeia lateral alquilo com 3 ou + C rearranjo de McLafferty

H2
C CH2
CH2
II. H
CH
H H
m/z = 162 m/z=92
C 6H 9 HC CH
III.
m/z = 162 m/z=77 m/z=51 449

CH3 CH3
p-xileno H3C
Intensidade relativa 91
M+ (106)
450
H H
n-butilbenzeno +
(rearranjo de McLafferty)
Intensidade relativa 92
91
M+ (134)
451
Iso-propil benzeno
105
M (120)
452
Fragmentação - Álcoois
 M+ de álcoois são, em geral, menos intensos do que os de alcanos
álcoois 1os e 2os apresentam M+ pequenos
álcoois 3os M+ ausente
 a perda de hidrogénio não é favorecida (M -1)

 fragmentações típicas com m/z de 31, 45, 59, 73, 87, ...
 o grupo alquilo de maior tamanho é o primeiro fragmento formado
quebra da ligação C-C vizinha ao oxigénio (clivagem α)

453
m/z
primários
OH + H2C
O H 31
secundários O H
OH + 45
terciários
OH O H
+ 59
454
 eliminação 1,2 é a mais comum em cadeias curtas (M-18)
+
(CH2)n +
(CH2)n
RCH CHR' + H2O
RCH CHR'
H H O
455
 para álcoois de cadeia longa observa-se fragmentação via rearranjo de

McLafferty (eliminação 1,4) originando água e etileno (M-18, M-28)
H H
R H H R M-18
O
O
+
M-28
456
H H
OH OH
+
n-pentanol
42
-H2O
(70)
OH
31
M+ (88)
457
2-pentanol
OH
45
M+ (88)
458
2-metil-2-pentanol
OH
59
OH
87
M+ 102
459
Álcoois cíclicos
 álcoois cíclicos apresentam fragmentação similar
clivagem-α
H OH H OH H OH H OH
H H +
m/z 57
desidratação
H OH
, + H2O M - 18
460
OH
Cíclicos H OH H
+
ciclopentanol
57
M+ (86)
461
Aromáticos
 M+ intenso
 há perda de H (M-1) ficando a carga deslocalizada no anel
principalmente se o anel tiver substituintes dadores de eletrões
 perda de CO (M -28)
H
O O O
H
H
 pode também perder
o radical formilo (HCO·, M -29)

O
C -CO -H
462
Aromáticos
M+ (94)
Fenol Intensidade relativa
-CO 66
-HCO 65
463
Aromáticos
 álcoois benzílicos transformam-se em análogos do ião tropílio
H H M+ (108)
OH tropiliol - CO
79 +
M -1 (107)
tropiliol
HO
+ H2
77
464
Fragmentação - Éteres
 fragmentações típicas com m/z de 31, 45, 59, 73, 87, ... (análoga à dos álcoois)
 o grupo alquilo de maior tamanho ligado ao oxigénio é perdido via clivagem-α
[R-CH2-C-R]+• → R • + H2C=O+-R
 clivagem da ligação C-O também é observada
+
R CH O R R CH + O R
R R
465
butilmetil éter
45
M+ 88
466
 podem ocorrem rearranjos em éteres ramificados
R H
H
R C O C CH2 R C O + R
H H H
 éteres aromáticos fragmentam-se como os fenóis, dando origem ao ião C6H5O+

(m/z 93) pela perda do grupo alquilo ligado ao oxigénio
o catião formado pode perder CO
R
O O
R + C O + C5H5+
m/z 93 m/Z 28 467

anisol (metilfenil éter)
M+ (108)
O
77
M-28
(-CH3, -CO) 65 O
93
468
 fragmentações típicas com m/z de 31, 45, 59, 73, 87, ... (análoga à dos álcoois)
 o grupo alquilo de maior tamanho ligado ao oxigénio é perdido via clivagem β
[R’-CH2-O-R]+• → R’• + H2C=O-R+
 clivagem da ligação C-O também é observada – clivagem α
+
R CH O R R CH + O R
R R
469
butilmetil éter
45
M+ 88
470
Fragmentação
Compostos carbonílicos
 apresentam 3 modos principais de fragmentação:

 clivagens α
O
R G O C G2 + R
O
R C O + G
R G
 clivagem β
O O
R R +
G G
 rearranjo de McLafferty
471
Fragmentação - Aldeídos
 M+ pouco intenso para aldeídos alifáticos (menor em cadeias longas e ramificadas)

intenso para aldeídos aromáticos
 clivagem-α
O
R C O + H M-1
R H
O
R + H C O m/z 29
R H
472
 clivagem-β
O
R R +
O m=43
H
H
 o rearranjo de McLafferty é observado em aldeídos de cadeia longa
R H R H
O O
+ m/z 44
H
473
Fragmentação
Aldeídos H H
O O
+
pentanal H
m/z 44
O
C
H
29
M-29
M-1
85
M+ 86
 aldeídos aromáticos apresentam clivagem-α com perda de H· (M-1) e HCO· (M-29)
H C O + H
M-1
O
O
H +
H
m/z 77 m=29
475
m-metil benzaldeído
H M-1
(119) M (120)
+
91
476
Fragmentação - Cetonas
 cetonas alifáticas e aromáticas apresentam M+ intensos
 fragmentações típicas com m/z de 29, 43, 57, 71, 85…
 a clivagem-α pode ocorrer dos dois lados da cetona
O
R C O + R1
R R1
477
Cetonas
 a clivagem-β (ocorre menos frequentemente do que nos aldeídos)
O
R O
R +
R1
R1
 observa-se rearranjo de McLafferty (≥ C4)
R H R H
O O
+
R1 R1
478
H H
O O +
2-pentanona 58
43
M+ (86)
M-15
+
:O. :O + +
neutra
: O: + CH3C=O+ 479
m/z=43
 cetonas cíclicas fragmentam-se como os cicloalcanos e álcoois cíclicos

O O O O
H H +
m/z 55
O O O
- CO m/z 70
m/z 42
480
 a clivagem-α é favorecida em cetonas aromáticas
R C O + R
m/z 105
+ C O
m/z 77
481
propilfenona
O
C O
m/z 105
m/z 77
M+ (134)
482
Fragmentação - Ésteres
 M+ é pouco intenso
nos ésteres aromáticos o M+ é mais intenso
 fragmentações típicas com m/z de 45, 59, 73, 87, 101, …
 clivagem-α mais importante envolve a perda do radical alcoxilo
O
R1 R C O + OR1
R O
outra clivagem-α observada envolve a perda do grupo alquilo ligado ao carbono

carbonílico (a mais comum observada em ésteres metílicos, m/z 59)
O O
R1 R + C O R1
R O
483
 O rearranjo de McLafferty ocorre em ésteres de cadeias longas
H H
O O
+ R1
R1
O O
H H
O O
+
R O R O
m=28
484
O
butirato de etilo 71
O O
O 43
M-28
29
m/z 88
M+ (116)
485
Ésteres - aromáticos
 a fragmentação mais comum é a perda do grupo alcoxilo por clivagem-α,

dando origem ao ião C6H5CO+ (m/z 105)
O O
R C
O + .OR
R
perde CO (m/z=70)
(m/z 77)
486
 em ésteres do tipo benzilóxilo e ésteres aromáticos que apresentam um grupo

metilo em posição orto ocorre o rearranjo:
O
éster benzilóxilo O OH O
+ C
H CH2
ketene
fragmentation
O
O
R C
éster benzílico com grupo O
+ H-O-R
R
HO
CH3 em posição orto C
H
CH2
H2
m/z 118 487

o-toluato de metilo
119
O O
C
91 O
O CH2
O m/z 118
M+ (150)
488
Fragmentação - Ácidos
Ácidos carboxílicos
 M+ pouco intensos (aromáticos são mais intensos)

 fragmentações típicas (C-C) com m/z de 45, 59, 73, 87, 101, …
 clivagem-α mais importante leva à perda do radical hidroxilo
O
H R C O + OH
R O
m=17
 outra clivagem-α envolve a perda do radical ligado ao grupo carbonilo, levando
à formação do ião HCO2
O O
H R + C O H
R O
m/z 45 489
CH3(CH2)4CO+ 99
CH3(CH2)4+ 71
CH3(CH2)3+ 57
CH3(CH2)2+ 43
CH3CH2+ 29
O
CH3 CH2 CH2 CH2 CH2 C OH
45 CO2H+
59 CH2CO2H+
73 (CH2)2CO2H+
87 (CH2)3CO2H+
490
 rearranjo de McLafferty ocorre em ácidos com cadeias longas
H H
O O
+
H H
O O
m/z 60
491
H
O OH
ácido pentanóico OH OH
m/z 60
M-29
M+ (102)
492
Ácidos carboxílicos aromáticos
 perdem o radical hidroxilo facilmente e depois perdem o CO
O O
H C
O + •H
OH
+ perda de CO (m/z 77; M- 45)
493
Fragmentação
 tais como os ésteres, os ácidos benzóicos com grupos metilo em posição orto
sofrem rearranjo McL dando origem ao ião C6H5CO+
O
O
H C
O
+ H-O-H
HO
H
H
C CH2
H2
m/z 118
ácido p-tolúico
O
O
OH
OH
M+ (136)
91
119
495
Fragmentação - Amidas
Amidas
 N é ímpar ⇒ M + será ímpar e presente
 a clivagem-α em amidas primárias origina m/z 44 (pico base)

O
C R +
R NH2 O C NH2
m/z 44
 ocorre Rearranjo de McLafferty para cadeias suficientemente longas
H H
O O
+
NH2 NH2
m=28
m/z 59
496
Amidas
butiramida
O H
O
C
NH2
NH2
44 59
M+ (87)
497
Amidas
benzamida
O NH2
C
77
M+ (121)
O NH2
105
498
Fragmentação
 apresentam 3 modos principais de fragmentação:

 clivagens α
O
R G O C G2 + R
O
R C O + G
R G
 clivagem β
O O
R R +
G G
 rearranjo de McLafferty
499
Fragmentação
aldeído cetona éster ácido amida
fragmentação perda G=H G=CH3 G=OCH3 G=OH G=NH2
clivagens α -R 29 43 59 45 44
clivagem β -R’(CH3) 43 57 73 59 58
McLafferty 44 58 74 60 59
500
Fragmentação - aminas
 N é ímpar ⇒ M + será ímpar
aminas alifáticas apresentam M+ pouco intenso
aminas aromáticas apresentam M+ intenso
 a clivagem-α é o modo de fragmentação mais importante
para aminas 1as alifáticas m/z 30
 rearranjo de McLafferty não é observado em aminas
 perda de amónia (M-17) não é observada

501
 o espectro de aminas cíclicas é complexo, apresentando variações de acordo com o

tamanho da estrutura cíclica
 a perda de H, seguindo da perda de HCN, é típico de anilinas:
NH2 NH H H H
+ H + HCN + H
 Piridinas apresentam alta estabilidade, com M+ intensos e espectros simples, com

perda de HCN
502
pentilamina
NH2
30
M+ (87)
503
dipropilamina
H N
H
N
72
H
M+ (101)
504
tripropilamina
N
114
M+ (143)
505
Fragmentação - nitrilos
Nitrilos
 M+ pouco intenso em alifáticos e intenso em aromáticos
 perda de H de carbono-α é frequentemente observada (M-1)

+
H H
R C C N H + R C C N
H
 perda de HCN (M-27) é sempre observada
 ocorre rearranjo de McLafferty para cadeias longas
H H
N N
C +
C
H2C
m/z 41
 nitrilos aromáticas apresentam perda de HCN (M-27) e perda de CN (M-26)
506
Nitrilos
propionitrilo
- HC≡N
M-1 (54)
m/z 27
M+ (55)
507
Nitrilos
pentanonitrilo
N
C
H
N 43
C
H2C
m/z 41 N
54 C
M+ (83)
508
Fragmentação - nitrocompostos
 M+ quase nunca observado em alifáticos e intenso em aromáticos
 fragmentação característica: perda de NO+ (m/z 30) e NO2+ (m/z 46)
m/z 30
m/z 46
509
Nitro compostos
nitropropano
NO2
43
NO+ (30)
NO2+ (46) M+ (89)
510
Nitro compostos
 os compostos aromáticos apresentam fragmentação no grupo nitro (NO; NO2):
NO2 O
+ NO + CO
m=28
m/z 93 m=30 m/z 65
NO2
+ NO2 C4H3 + HC CH
m/z 77 m=46 m/z 51 m=26
511
Nitro compostos
p-nitrotolueno
NO2
91
M+ (137)
O
C5H5+
m/z 107
512
 quando o pico M+ é observado → indica a massa molecular
desde que todos os átomos da molécula apresentem
as suas formas isotópicas mais abundantes
 o átomo C é uma mistura de isótopos 98,9% 12C 1,1% 13C <0,1% 14C
 o espetro irá indicar o pico M+ (constituído somente por átomos de 12C) e um

pico M+1 de intensidade nC x 1,1% (1,1*nc=IM+1/IM)
513
Isotopos na Espectroscopia de Massa
514
Fragmentação – haletos de alquilo
Compostos halogenados
 apresentam pico molecular em função da distribuição isotópica (%)
M+ M+1 M+2
1H 100,0
12C 98,9 13C 1,1
14N 99,6 15N 0,4
16O 99,8 18O 0,2
32S 95,0 33S 0,8 34S 4,2
35Cl 75,5 37Cl 24,5
79Br 50,5 81Br 49,5
127I 100,0
515
 moléculas com Cl ou Br apresentam os picos isótopos característicos
 para compostos com 1 Cl, o pico molecular é um dupleto dos iões M+ e M+2
de intensidade relativa 3:1
35Cl 75,5% M+
37Cl 24,5% M+2 terá abundância relativa

de 24,5% do pico M+
M+2
m/z
516
 para compostos 1 Br o pico molecular é um dupleto dos iões M+ e M+2 de

intensidade relativa 1:1
79Br M+ M+2
50,5%
81Br 49,5% M+ e M+2 apresentam

intensidades idênticas
517
M+2
M+4
Br2
Br Br3
M+2
 iões moleculares M+4, M+6, …

M M+2 M M+4 M
M+6
⇒ presença de mais de um Cl ou Br
m/z m/z m/z
Cl Cl2 Cl3
M M M
M+2
M+2
M+2 M+4
M+4 M+6
m/z m/z m/z

M+2
BrCl Br2Cl Cl2Br
M+2
M+4
M+2
M M M
M+4
M+4 M+6
M+6
518
m/z m/z m/z
 fragmentação principal: perda do X
R X R + X
a perda de X é mais frequentemente observada para os átomos de I e Br do

que para os átomos de Cl e F
 fragmentação alternativa: perda de HX
HF > HCl > HBr > HI
+
H H +
H
R C C X
R C CH2 + H X
H H
519
 a clivagem-α é também pode ser observada
H
R C X R + H2C X
H
 para halogenetos alifáticos de cadeia longa, dá-se a perda de radical alquilo com
formação dum haleto cíclico
R
X X
+ R
 halogenetos aromáticos apresentam M+ muito intenso, perda do X dando origem ao ião

C6H5+
520
521
cloropropano
Cl
43
H2C Cl M+2
m/z 49
m/z 51 M+ (78)
522
p-clorotolueno
Cl
91
M+ (126)
M+2
523
bromobutano
Br
57
[M – 79 ou (M + 2) – 81]
M+2
M+ (136)
H2C Br
524
p-bromotolueno
Br
91
M+2
M+ (170)
525
3,4-dibromotolueno M+2
Br
Br Br
Br 169,
90 171
M+4
M+ (248)
526
iodobenzeno I
M+ (204)
77
527
Exemplos de aplicação
Dicas para a análise de espectros de massas
 observação de padrões típicos ajuda na interpretação dos espectros

 obtenha tantas informações quantas foram possíveis a partir M+
intenso ou não
presença de isótopos? M+1? M+2, …
presença de pico M-1
presença de pico M-18 (M-H2O)
 perdas de fragmentos a partir de M+
 observar as fragmentações típicas para cada família de compostos
 uma vez tendo uma hipótese estrutural plausível, tente atribuir a maioria os
picos observados no espectro de massas
528
15 •CH3 36 HCl, 2 H2O 52 C4H4

16 O, •NH2 37 H2Cl 53 C4H5
17 HO• 38 C3H2, C2N, F2 54 CH2=CH-CH-CH2
18 H2O 39 C3H3, HC2N 55 CH2=CHCHCH3
19 F• 40 CH3CCH 56 CH2=CHCH2CH3
20 HF 41 CH2=CHCH2• 57 C4H9•, C2H5CO
26 CHCH, •CHN 42 CH2=CHCH3, CH2=C=O 60 C3H7OH
27 CH2=CH•, HCN 43 C3H7, CH3C•=O 63 •CH2CH2Cl
28 CH2=CH2, CO 44 CH2=CHOH, CO2, N2O, 71 C5H11•
29 CH3CH2•, •CHO CONH2 73 CH3CH2OC(=O)•
30 NH2CH2•, CH2O, NO, C2H6 45 CH3CHOH, CH3CH2O•, CO2H, 74 C4H9OH
31 •OCH3, •CH2OH, CH2NH2 CH3CH2NH2 75 C6H3
32 CH3OH, S 46 (H2O e CH2=CH2), CH3CH2OH 76 C6H4
33 HS•, (•CH3 e H2O) 47 CH3S• 77 C6H5
34 H2S 48 CH3SH 78 C6H6
35 Cl• 49 •CH2Cl
529
família de compostos Sinais mais comuns

alcanos 29, 43, 57, 71, 85, 99,……
alcenos/cicloalcenos 27, 41, 55, 69, 83, 97,……
álcoois alifáticos 31, 45, 59, 73, 87, 101,……
aromáticos 38, 39, 50-2, 63-5, 75-8,……
ácidos/esteres 45, 59, 73, 87, 101,……
alquilaminas 30, 44, 58, 72, 86, 100,……
alquilclorados 49, 63, 77, 91, 105,……
530

Sebenta Teorica AEst Parte III

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Espectrometria de massa

MS DLI TPS PB MALDI/TOF Q/TOF

1970’s 1978 1980’s 1990 1995 1998 2000’s

FAB API ESI μESI Z-Spray APPI

400 800 1000 2500 300.000 500.000 1.000.000

Investigações espectrometria de massa, desenvolvimento da Desenvolvimento de métodos científicos de

 grande utilidade na identificação de substâncias

 não envolve a absorção ou emissão de luz diretamente pelo composto

 baseia-se no comportamento dos iões positivos em campos magnéticos e

 abundância isotópica dos elementos

método analítico para medir pesos atómicos ou moleculares

 Pesos atómicos e moleculares obtenção da massa molecular da substância (pico

 Fórmula molecular: pode ser calculada a partir da abundância das fragmentações

 Identificação de compostos a partir das fragmentações por comparação do espectro

 Permite obter informações estruturais de moléculas orgânicas e biológicas

 Permite determinar a composição elementar (baixa MM; MS alta resolução)

 Resíduos de pesticida e compostos orgânicos em geral

 Detetar e identificar o uso de esteróides em atletas

 Monitorizar a respiração de pacientes por anestesistas durante a cirurgia

 Determinar a composição de espécies moleculares encontradas no espaço

 Monitorizar os processos de fermentação de indústrias biotecnológicas

 Determinar dioxinas em peixes contaminados

 Caraterizado por picos

xx - indica a razão m/z do ião

 A altura do pico indica a abundância relativa de um determinado ião (não

intensidade do pico indica a facilidade de formação/movimentação do ião no espetrómetro

O espetro de massa obtido depende

 Arranjo dos átomos na estrutura da molécula

 Força das ligações entre os átomos

 Energia usada no processo de ionização

Características do analisador de massa

Intervalo Resolução Velocidade de

É uma medida de quão perto O intervalo no Uma medida Os analisadores

Deteção dos iões

amostra ionizador analisador detetor

 A amostra é ionizada e ocorre fragmentação de moléculas (iões)

GC- Cromatografia gasosa gasosas

 A espectrometria de massa é uma técnica na fase de gás – as amostras líquidas ou

1013 mbar 2x1019 moleculas/cm3

10-11 mbar 2x105 moleculas/cm3

Pressão (Torr) Número da densidade do gás Percurso livre médio

Sistema de vácuo Pistão

Bombas difusoras Difusão

102 1 10-2 10-4 10-6 10-8 10-10 10-12 10-14 P (torr)

Deteção dos iões

amostra ionizador analisador detetor

As diferenças nos tipos de MS estão em diferentes meios para realizar

os que provocam dessorção do

+ são aplicáveis a compostos pesados, não

Métodos em fase gasosa

Ionização Química (CI) Chemical Ionization

Métodos por dessorção

Ionização por Bombardeamento de Fast Atom Bombardment

Ionização por Dessorção Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

Métodos por evaporação

Radiação ionizante Radiação não ionizante

Ultravioleta: 3,1 a 100 eV

 alguns dos iões moleculares são instáveis e fragmentam-se em iões menores

molécula ião ião fragmento

este processo requer tipicamente < 15 eV e o restante

 O analito gasoso é bombardeado Iões

Formação de iões positivos

 O espectro é um registo das fragmentações da molecula