ESPECTROMETRIA

Pesquisa

de massa de protenas
O papel-chave da espectrometria de massa na era ps-genmica

Ricardo Bastos Cunha

Prof. Dr., Ncleo de Protemica,

Centro Brasileiro de Servios e Pesquisas
em Protenas; Diviso de Qumica Analtica
Instituto de Qumica
Universidade de Braslia
Braslia/DF
rbcunha@unb.br

Mariana de Souza Castro

Profa. Dra., Ncleo de Protemica,

Centro Brasileiro de Servios e
Pesquisas em Protenas
Universidade de Braslia
Braslia/DF
mscastro@unb.br

Wagner Fontes

Prof. Dr., Ncleo de Protemica,

Centro Brasileiro de Servios e
Pesquisas em Protenas
Universidade de Braslia
Braslia/DF
wagnerf@unb.br

qumica de protenas tem

passado por um novo perodo de grandes avanos
tecnolgicos e cientficos.
Com a concluso do
seqenciamento dos genomas de
vrios organismos, inclusive o da espcie humana, a pesquisa envolvendo protenas ganhou novo flego e
entramos em uma nova fase conhecida como ps-genmica, em virtude
da sua estreita relao com os dados
produzidos pelas pesquisas
genmicas. Essa fase tem-se caracterizado pelo domnio de um novo
mtodo analtico empregado no estudo de protenas: a espectrometria de
massa, simbolizada por MS do nome
em ingls mass spectrometry.
Princpios da
espectrometria de massa

las eletricamente, e o analisador de

massa o espectrmetro de massa
propriamente dito que separa os
ons resultantes de acordo com a massa. Atualmente, duas tcnicas de
ionizao (Figura 1), que se
complementam e se sobrepem, dominam a anlise de protenas: a
dessoro a laser e a eletropulverizao.
Dessoro a laser
A palavra dessoro (desorption,
em ingls) refere-se ao fenmeno de
retirada de substncias adsorvidas ou
absorvidas por outras. No caso da
espectrometria de massa, a protena
ou a mistura protica ou peptdica
em estudo misturada a uma
matriz cida e irradiada com um feixe
de laser, cuja energia causa a
dessoro da molcula. A matriz cida
transfere prtons para as molculas
de protena, fazendo que fiquem
ionizadas positivamente. A dessoro
das molculas de matriz e de protena
faz que elas passem para o estado
gasoso. Estar na forma ionizada e no
estado gasoso condio para que
uma molcula possa ser analisada por
espectrometria de massa. A principal
tcnica empregada na anlise de protenas baseada no fenmeno da
dessoro a laser conhecida como
MALDI sigla em ingls para matrixassisted laser desorption ionization.

A espectrometria de massa um
mtodo de determinao precisa de
massas molares. H vrias dcadas,
esse mtodo vem-se consolidando
como ferramenta insubstituvel para
a determinao de estruturas qumicas, principalmente de compostos
orgnicos pequenos e volteis. Durante a dcada de 1980, foram desenvolvidos novos mecanismos de
ionizao em espectrmetros de massa para molculas grandes e polares
como peptdios e protenas, at ento impossveis de serem analisados
por essa tcnica, o que permitiu que
vrios problemas bioqumicos pudesEletropulverizao
sem ser resolvidos.
Na ionizao por eletropulveriUm espectrmetro de massa
formado basicamente de duas partes: zao, a protena dissolvida em uma
o sistema de ionizao das molculas, soluo acidificada a qual pulverizaresponsvel por vaporiz-las e carreg- da em uma agulha metlica ou um
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Figura 1 - Tcnicas de ionizao e tipos de analisadores de massa: A) eletropulverizao (ESI), mostrando a agulha de
pulverizao, os filtros iniciais que impedem a progresso de partculas no-ionizadas e o incio de um sistema de quadripolos;
B) quadripolos em um sistema de triplo quadripolo, esquematizando partculas conduzidas ao detector esquerda; C) dessoro
a laser (MALDI) ilustrando um pulso de laser incidindo sobre a amostra aplicada na placa retangular e gerando partculas
ionizadas. esquerda das partculas so mostrados filtros eletrnicos que impedem a passagem de partculas no-ionizadas
para o analisador TOF; D, E e F) analisador tipo TOF no modo refletor (reflectron), apresentando todo o tubo de vcuo com
os ons no incio da trajetria (D), a mudana de trajetria no refletor (E) e a chegada ao detector aps o refletor acima, no
tubo estreito (F)

capilar de vidro revestido de metal

submetida a intenso campo eltrico, o que causa sua ionizao. Uma
corrente de gs inerte flui no sentido
contrrio ao da pulverizao, o que
causa sua dessolvatao. A protena,
j ionizada e no estado gasoso,
atrada para dentro do espectrmetro
de massa, onde analisada. O termo
ESI sigla em ingls para
electrospray ionization
comumente empregado para designar tal tcnica.
Analisadores de massa
Os principais analisadores de
massa (Figura1) que acompanham
os sistemas de ionizao descritos
so:
tempo de vo abrevia-se
como TOF, sigla em ingls para timeof-flight sistema em que molcu-

las ionizadas e aceleradas so lanadas

em um tubo sob vcuo e sem campo
eltrico para medida do seu tempo
de vo at um detector. Esse tempo
de vo proporcional massa molar
da molcula. Este analisador usualmente associado dessoro a laser;
mas pode tambm ser utilizado com
eletropulverizao;
quadripolo, que utiliza a conduo de molculas ionizadas entre
quatro cilindros metlicos conectados
a fontes de radiofreqncia para fazer que determinados grupos de ons
cheguem ao detector. Esse analisador
geralmente usado com
eletropulverizao, mas pode estar
associado tambm dessoro a laser.
aprisionamento de ons
abrevia-se como IT, sigla em ingls
para ion trap em que as molculas tambm so conduzidas para dentro de um compartimento onde exis-

te um forte campo eletromagntico.

Diferentemente do quadripolo, nesse sistema os ons no so perdidos
em sua trajetria rumo ao detector.
Ao contrrio, eles so aprisionados
no compartimento onde existe campo eletromagntico e liberados um a
um. Esse analisador associa-se tanto
eletropulverizao quanto
dessoro a laser.
APLICAES
A espectrometria de massa
uma tcnica capaz de determinar
massas molares de forma muito precisa em experimentos rpidos (poucos minutos). Essas informaes possibilitam a resoluo de diversos problemas em qumica de protenas, tais
como: checagem da correo de uma
seqncia de aminocidos, identificao de protenas, determinao da

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento ano IX - n 36 - janeiro/junho 2006

41

1285.4

todo consideravelmente mais

sensvel e, devido a sua grande preciso, bem mais fidedigno que outros mtodos existentes, como a
cromatografia lquida HPLC,
sigla em ingls para
high performance liquid
chromatography e a
eletroforese.

496.4

Intensidade, cps

SIETDVSFDK

3000

2000

2
262.2

1000

3
409.4

1 200.8

b1
88.1

5
595.2

147.0

b3
331.0

y6

B6

b4

628.4

b7

739.0

431.2

300

y8

710.2

940.4
y
7 b8
811.2
886.8

600

9
994.4

10
1122.4

879.6

900

,m/z,

10
1140.8

Identificao de
isoformas proticas

1200

amu

Figura 2 - Seqenciamento por espectrometria de massa (CID-MS/MS). O espectro de

MS/MS rico em informaes de seqncia. A diferena de massa entre os diversos picos pode
auxiliar na deduo da seqncia do peptdio, uma vez que as ligaes preferencialmente
clivadas pelo processo CID so as peptdicas. Espera-se obter, em um espectro de MS/MS, picos
correspondentes s fragmentaes da cadeia peptdica em diferentes posies, determinando
as sries A, B, C, X, Y e Z, cujas massas auxiliam na deduo da seqncia do peptdio. Na
figura, foram ilustradas as sries B e Y, correspondentes aos fragmentos provenientes da
fragmentao apenas das ligaes peptdicas

fidelidade e homogeneidade de protenas recombinantes, identificao

de complexos proticos nocovalentes, deteco de doenas
genticas, identificao de modificaes qumicas em protenas, determinao de glicosilaes adio
de acares molcula de protena
e fosforilaes adio de
fosfatos molcula de protena ,
seqenciamento de protenas e
peptdios etc. As possibilidades de
aplicao da espectrometria de massa no se esgotam aqui. Existem
vrios outros usos dessa nova
tecnologia
relacionados

biotecnologia e a reas correlatas.

Aplicaes que envolvem anlise de
carboidratos, lipdios e cidos
nuclicos esto se tornando rotina
tambm. A seguir so relacionadas
algumas
aplicaes
da
espectrometria de massa em qumica de protenas.
Determinao precisa da
massa molar de protenas
A espectrometria de massa
uma das tcnicas analticas mais precisas existentes. Consegue-se facilmente 5 ou 6 algarismos significativos nas medidas de massa molar,
com erros que podem chegar a apenas 0,001 % em equipamentos de
alta resoluo. A ttulo de compara-

o, na eletroforese em gel, tcnica

ainda muito utilizada para separao
de misturas proticas e medidas de
massas molares de protenas, conseguem-se erros de no mnimo 5 %. A
preciso dos espectrmetros de
massa tanta que possvel distinguir duas molculas de 10.000 u
que diferem entre si pela presena
de apenas 1 carbono-13 ( 13C) na
molcula o carbono-12 (12C) o
istopo mais abundante na natureza.
A espectrometria de massa , portanto, entre todas as tcnicas existentes, a que possibilita a determinao mais precisa da massa molar de
protenas e peptdios.
Checagem da pureza de
protenas e peptdios
O estado de pureza de protenas e de peptdios um aspecto
extremamente importante em qumica de protenas. A checagem dessa pureza pode ser feita utilizandose a espectrometria de massa. De
maneira geral, a existncia de um
pico nico em espectros de MALDI
ou no espectro reconstrudo de ESI
indica a presena de apenas uma
forma molecular. A presena de dois
ou mais picos demonstra a existncia de isoformas ou de contaminantes.
A checagem de pureza por
espectrometria de massa um m-

42 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento ano IX - n 36 - janeiro/junho 2006

Isoformas proticas so
protenas que tm a mesma
funo, mas so codificadas
por genes distintos e apresentam pequenas diferenas
em sua seqncia. Por exemplo, o fator de transformao
beta (TGF-B) existe em trs
verses ou isoformas (TGF-B1, TGFB2, e TGF-B3), cada uma delas
capaz de disparar uma cascata de
sinalizao que comea no
citoplasma e termina no ncleo da
clula. Essas isoformas so bastante
difceis de separar pelos mtodos
usuais utilizados na purificao de
protenas. Sua presena pode ser
demonstrada por meio da
espectrometria de massa, desde que
suas massas molares sejam distintas.
A ocorrncia de um pico nico
cromatogrfico que produza dois
picos distintos e prximos em um
espectro de massa sugere a presena de isoformas proticas, que pode
ser confirmada por meio de tcnicas
de identificao de protenas (ver
adiante).
Confirmao da seqncia
completa de aminocidos
Se a massa molar calculada a
partir de uma seqncia de
aminocidos de uma protena ou
peptdio, determinada experimentalmente, for igual quela determinada por espectrometria de massa,
pode-se concluir que a seqncia
em questo est correta. Cabe ressaltar que a existncia de aminocidos
isobricos, ou seja, aminocidos que
possuem a mesma massa molar ou
massas molares muito prximas

cuja diferena inferior ao erro da

medida , deixa certa dvida a respeito da seqncia correta. Porm, a
comparao com seqncias similares ou mesmo com a seqncia do
gene pode minimizar essas dvidas.
Confirmao da correo da
expresso de protenas
recombinantes
A tecnologia de DNA
recombinante hoje muito utilizada
na indstria da biotecnologia. Tratase de uma srie de procedimentos
usados para juntar-se (recombinar)
segmentos de DNA com determinado objetivo biotecnolgico. A correo da expresso de protenas
recombinantes pode ser avaliada por
meio da determinao exata de suas
massas molares utilizando-se
espectrometria de massa. Essa tcnica pode ser utilizada no controle de
qualidade da fidelidade da expresso gnica e pureza do material obtido, uma aplicao particularmente
til para a indstria da biotecnologia.
Determinao de modificaes
ps-traducionais
A maioria das protenas, aps
ser sintetizada ou seja, traduzida
, sofre modificaes pstraducionais. Uma das maneiras mais
comuns em que uma protena
modificada pelo processo de
glicosilao, no qual oligossacardeos
so ligados a stios especficos da
cadeia polipeptdica. Mais de 60 %
das protenas naturais so glicosiladas.
Acares ligados estrutura de protenas podem auxiliar no
enovelamento correto da protena,
servir de epitopos de reconhecimento de anticorpos, servir como uma
capa de proteo contra a ao de
proteases ou exercer um papel na
localizao e na orientao de protenas da membrana celular, apenas
para citar alguns exemplos. A
espectrometria de massa tem sido
extensivamente utilizada para determinao do contedo de
carboidratos em glicoprotenas, para
localizao de stios de glicosilao e
at para determinao de estruturas

glicdicas.
A fosforilao de uma protena
uma das mais importantes modificaes ps-traducionais com efeito direto na atividade celular. A maioria
dos processos metablicos em uma
clula eucaritica so regulados em
certos pontos pela fosforilao de
uma ou mais protenas-chave. A
regulao da transcrio gentica, a
progresso do ciclo celular, a proliferao, a diviso e a diferenciao
celular, a dinmica citoesqueltica e
a estocagem e recuperao de energia so todos processos dependentes de fosforilao. A identificao
de stios especficos de fosforilao
uma etapa importante em direo
ao entendimento das vias de sinalizao intracelulares. Cada vez mais
esse trabalho tem sido conduzido
por meio da espectrometria de massa.
Os aminocidos que so normalmente fosforilados so a serina, a
treonina e a tirosina, embora
fosforilaes em resduos de histidina
e cido asprtico tambm sejam descritas. Se a seqncia completa de
aminocidos da protena fosforilada
for conhecida, os stios de fosforilao
podem ser determinados simplesmente analisando-se a mistura
peptdica obtida de um digesto
enzimtico por espectrometria de
massa. Os peptdios com massa de
98 u resultante da adio de
H3 PO4 acima do esperado pela
seqncia esto fosforilados.
Seqenciamento de protenas
por MS/MS
Trabalhos de seqenciamento
por espectrometria de massa so
conduzidos normalmente em equipamentos conjugados, ou seja, que
possuem pelo menos dois
analisadores de massa. Tais equipamentos associam dois analisadores
de massa em srie e, por isso, a
tcnica conhecida como MS/MS
por aluso espectrometria de massa (MS, sigla em ingls para mass
spectrometry) seguida de outra
espectrometria de massa. Equipamentos tpicos de MS/MS incluem
espectrmetros de eletropulve-

rizao com triplo quadripolo ou com

um quadripolo e um analisador TOF
(Q-TOF), equipamentos do tipo aprisionamento de ons (ion trap) e
equipamentos com ionizao do tipo
MALDI com dois analisadores TOF
(MALDI-TOF-TOF).
Nesse tipo de anlise, uma amostra de peptdio puro ou mesmo uma
mistura de peptdios obtidos por digesto enzimtica injetada no
espectrmetro de massa. No caso
mais complexo de mistura de
peptdios, um peptdio de interesse
selecionado no 1 filtro de massa,
introduzido e acelerado em uma cmara de coliso, onde existe uma
corrente gasosa de um gs inerte,
como nitrognio ultrapuro. As colises entre as molculas do on
peptdico e do gs inerte provocam
a fragmentao da cadeia
polipeptdica. Esse fenmeno chamado de dissociao induzida por
coliso CID, sigla em ingls para
collision induced dissociation. As
ligaes mais lbeis so justamente
as ligaes peptdicas, seguidas pelas demais ligaes da cadeia principal. Assim, um espectro dessa fragmentao rico em informaes de
seqncia (Figura 2). Existe uma
nomenclatura para descrever os diversos fragmentos peptdicos passveis de serem obtidos por CID-MS/
MS (Figura 3), que auxilia na interpretao dos espectros de MS/MS.
As vantagens do seqenciamento por MS/MS em relao aos
mtodos qumicos incluem a grande
rapidez um experimento de MS/
MS pode ser feito em menos de 5
min, o mesmo trabalho em um
seqenciador automtico pode demorar at dois dias , o baixssimo
custo enquanto o seqenciamento
qumico utiliza diversos reagentes
de alto custo, a tcnica de MS/MS
gasta praticamente somente nitrognio e a grande sensibilidade
seqenciamento qumico na ordem
de picomol; MS/MS na ordem de
femtomol. As desvantagens so a
difcil interpretao dos espectros
os resultados no costumam ser to
claros como no seqenciamento qumico e a grande dificuldade para
se distinguir os aminocidos isobricos

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento ano IX - n 36 - janeiro/junho 2006

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Figura 3 - Nomenclatura para descrever os diversos fragmentos peptdicos obtidos por CID. A figura mostra um tetrapeptdio
que pode ser clivado em 9 posies principais, podendo gerar 18 fragmentos diferentes, dependendo de que lado fica a carga
positiva, uma vez que somente o fragmento carregado detectado por espectrometria de massa. Quando, na fragmentao
da cadeia polipeptdica, a carga positiva permanece no lado N-terminal da molcula, os ons so nomeados An, Bn e Cn,
dependendo se a quebra aconteceu nas ligaes CHCO, CONH ou NHCH da cadeia principal, respectivamente, em que
n o nmero de cadeias laterais existentes no fragmento. De forma anloga, se a carga positiva permanecer na poro Cterminal da molcula os ons produzidos so designados por Xn, Yn e Zn

leucina e isoleucina. Aminocidos que

possuem massas molares muito prximas, tais como glutamina e lisina,
fenilalanina e sulfxido de metionina,
bem como alguns aminocidos e
dipeptdios, ou mesmo dois
dipeptdios, podem ser distinguidos
em espectrmetros de massa mais
precisos.
Atualmente, existem programas
que selecionam automaticamente os
peptdios de interesse para fragmentao, tcnica chamada de CID dependente de dados (data-dependent
CID), ou mesmo que permitem que
todos os peptdios que entram no
espectrmetro de massa sejam fragmentados ao mesmo tempo, mtodo conhecido como multiplexao.
Esses programas tornam o
seqenciamento por MS/MS completamente automatizvel.
Seqenciamento de protenas
por espectrometria de massa
usando o fenmeno do

decaimento ps-fonte postsource decay (PSD)

Na espectrometria de massa
com ionizao por dessoro a laser
e anlise por tempo de vo (MALDITOF), uma frao grande de ons do
analito sofre deteriorao durante o
vo post-source decay (PSD)
dentro do espectrmetro de massa,
aps o desligamento da fonte de
laser. Dessa forma, o espectro obtido de peptdios de tamanho mdio
(at 2.800 u) rico em informaes
de seqncia, apesar de o padro de
clivagem ser diferente daquele obtido por dissociao induzida por coliso. O mecanismo de ativao parece ser determinado por eventos de
coliso entre os ons e as molculas
neutras, no campo de acelerao.
Essa tcnica de seqenciamento ficou conhecida como PSD e s pode
ser usada em equipamentos do tipo
MALDI.

44 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento ano IX - n 36 - janeiro/junho 2006

Seqenciamento escada
Uma estratgia alternativa de
seqenciamento o chamado
seqenciamento escada (ladder
sequencing), que consiste na formao de uma famlia de polipeptdios
parcialmente fragmentados, cada um
diferindo do prximo pela perda de
um aminocido. Esses peptdios-escada podem ser gerados por meio
de mtodos enzimticos, como o
uso de carboxipeptidases, ou qumicos, como cido clordrico (HCl) diludo, cido pentafluoropropinico,
cido heptafluorobutrico ou mesmo
a degradao de Edman, que utiliza
a reao seletiva N-terminal com
isotiocianato de fenila. A segunda
etapa consiste na determinao precisa das massas dos vrios
polipeptdios degradados, por meio
da espectrometria de massa. Essa
mistura de peptdios pode ser analisada em conjunto, em uma nica
etapa, no necessitando ser separa-

envelopes de carga, o que dificulta

muito a interpretao dos resultados.
Identificao de protenas

Figura 4 - Esquema geral para identificao de protenas por espectrometria

de massa. A partir de protenas separadas por 2D-PAGE (eletr oforese
bidimensional) selecionam-se as manchas eletroforticas de interesse e realizamse a clivagem enzimtica de tais protenas (1). O digesto submetido anlise
por MALDI-TOF (2) para caracterizao das massas dos peptdeos (4) e eventual
fragmentao de algum peptdeo por PSD (5) ou anlise por TOF-TOF para
obteno de fragmentos de seqncia (sequence tags). Outra alquota do digesto
pode ser submetida cromatografia em fase reversa associada espectrometria
de massa por ESI (3), obtendo-se espectros com envelopes de cargas para
peptdeos maiores (6), que podem ter a sua massa calculada por algoritmos de
reconstruo (8), ou para peptdeos menores (7), que podem ser fragmentados
por CID e ter sua seqncia determinada (9).
da previamente. Os aminocidos em
seqncia so identificados levandose em conta a diferena de massa
entre os sucessivos picos. As vantagens do seqenciamento escada sobre os mtodos qumicos usuais so
a rapidez porque economiza uma
corrida cromatogrfica em cada ciclo
e o baixo custo por ciclo. As
vantagens em relao a outros mto-

dos que utilizam espectrometria de

massa incluem a maior facilidade na
interpretao dos espectros e a extenso da seqncia, normalmente
bastante superior no seqenciamento
escada. Essa tcnica fornece melhores resultados em equipamentos do
tipo MALDI, devendo-se evitar
utiliz-la em equipamentos do tipo
ESI, pois este produz uma famlia de

A identificao de protenas
um procedimento de capital importncia na abordagem protemica. Um
dos procedimentos utilizados para
identificar protenas em bancos de
seqncias sem a necessidade de
seqenciar a protena em estudo a
chamada impresso digital do mapa
peptdico
( peptide
mass
fingerprint). Nesse mtodo, feita
uma digesto enzimtica ou qumica
da protena, in vitro , seguida de uma
anlise espectromtrica dos
peptdios obtidos. As massas molares desses fragmentos peptdicos so
ento comparadas com massas de
peptdios provenientes de digestes
tericas, in silico, de protenas depositadas em bancos de seqncias.
A identificao probabilstica e a
porcentagem de cobertura dos
peptdios da amostra com relao
protena pareada um dos principais
parmetros de identificao (Figura 4).
Geralmente, o equipamento de
escolha nesse caso o MALDI-TOF.
O mtodo da impresso digital do
mapa peptdico praticamente infalvel e particularmente til na
identificao de protenas de espcies com genomas pequenos e completamente seqenciados. Entretanto, o ndice de insucesso na identificao aumenta medida que se
aumenta o nmero de registros confrontados no banco de dados utilizado na busca. Para protenas isoladas
de espcies cujo genoma no est
seqenciado, necessrio usar bancos de dados ampliados (sem restrio taxonmica). Nesse caso, imperativo utilizar fragmentos de seqncia (sequence tags) para uma
identificao mais confivel, geralmente obtidos em equipamentos do
tipo MALDI-TOF-TOF.
Mapeamento de interaes
moleculares
A palavra proteoma est normalmente associada ao conjunto de

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento ano IX - n 36 - janeiro/junho 2006

45

protenas expressas por um determinado tipo de clula em um determinado momento. Entretanto, esse
conceito fornece apenas uma viso
esttica do processo biolgico. De
fato, as protenas exercem suas funes como resultado de interaes
altamente dinmicas com outras protenas. A clula pode ser vista como
uma srie de mquinas moleculares
interagindo umas com as outras. Essas mquinas moleculares so, na
verdade, formadas por grandes complexos de protenas. A modulao
espacial e temporal dessas interaes
o que efetivamente define as funes celulares, em termos
moleculares. O nmero total de
genes humanos no difere substancialmente do verme nematdeo
Caenorhabditis elegans, o que sugere que a complexidade fenotpica
pode ser atribuda parcialmente
combinao contextual dos produtos genticos e suas interaes. A
espectrometria de massa est sendo
agora utilizada como uma ferramenta para explorar a dinmica das
interaes entre protenas.
Um mtodo direto para estudar
a interao protena-protena consiste na observao direta do complexo protico por microscopia de fora
atmica e na determinao da constante de afinidade. Um mtodo
espectromtrico que vem ganhando
prestgio nos ltimos tempos o
chamado SELDI (sigla em ingls para
surface-enhanced laser desorption
ionization). Nele, a placa de MALDI
quimicamente modificada de forma a permitir a ligao de uma molcula isca, que agrupa em torno de
si as protenas que por ela tm afinidade, imobilizando-as tambm na
placa. As protenas no-ligantes so
retiradas por lavagem da placa. A
placa ento montada na fonte
ionizadora de MALDI e as protenas
que interagiram com a molcula
isca so analisadas por SELDI-TOF.
Essa tcnica tem sido sugerida para
mapear epitopos de anticorpos, imobilizando-se o antgeno na placa de
SELDI usando o anticorpo como
isca. A protena-alvo ento
digerida e os peptdios que no esto ligados ao anticorpo so lavados.
Os peptdios que formam o epitopo

podem ento ser determinados por

SELDI-TOF.
Um mtodo alternativo para determinar interaes proticas chamado espectrometria de massa de
bioafinidade e consiste na anlise
direta do complexo em um
espectrmetro de massa. Essa tcnica parece estar ganhando espao e
se tornando uma ferramenta-padro
na determinao de interaes protena-protena. Estudos recentes sugerem uma estratgia geral para a
anlise em larga escala de interaes
protena-protena usando a abordagem
de
co-precipitao/
espectrometria de massa. Uma etiqueta de afinidade expressa ligada diretamente a uma protena-alvo.
As protenas-alvo so sistematicamente depositadas, juntamente com
outras protenas participantes do
complexo protico, em uma coluna
de afinidade. O complexo desfeito
e as protenas participantes do complexo so separadas por eletroforese
em poliacrilamida sodium dodecyl
sulfate
polyacrylamide
gel
electrophoresis (SDS-PAGE) de
uma dimenso. As protenas so ento extradas do gel, digeridas com
tripsina e identificadas por impresso digital do mapa peptdico
(peptide mass fingerprint). A organizao funcional do proteoma de
uma levedura foi caracterizada usando tal mtodo e 232 complexos
multiproticos foram determinados,
sugerindo novos papis celulares
para 344 protenas.
CONCLUSES
Enfim torna-se cada vez mais
evidente a importncia da
espectrometria de massa em pesquisas envolvendo protenas. No
Brasil, apesar da existncia de poucos pesquisadores que dominam a
tcnica, vrios projetos encontramse em desenvolvimento, permitindo
um aprofundamento significativo em
questes de interesse regionais e
nacionais, como doena de Chagas,
utilizao de enzimas em processos
industriais, peptdios biologicamente ativos, reproduo animal, pragas
de lavouras, imunologia do trauma
etc. A recm instalada Rede

46 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento ano IX - n 36 - janeiro/junho 2006

Protemica Nacional, que associa laboratrios em todo o Pas que trabalham com a abordagem protemica,
demandar de forma sistemtica e
crescente a utilizao de
espectrmetros de massa, cada vez
mais precisos e versteis. O parque
instalado de equipamentos no Brasil
j no pode ser considerado pequeno. Porm, o nmero de pesquisadores que utilizam, em algum momento de sua pesquisa, a espectrometria
de massa de protenas cresce de
forma exponencial e, portanto, a
oferta de equipamentos deve acompanhar essa demanda. De acordo
com o estabelecido para a Rede
Protemica Nacional, laboratrios
centrais, que j possuem equipamentos, pessoal treinado, programas
de manuteno e experincia na
rea, fornecero a infra-estrutura
bsica de equipamentos para os laboratrios-satlite, de forma que todos possam se beneficiar dos recursos existentes com o mnimo de
desperdcios de insumos para o Pas.
BIBLIOGRAFIA
RECOMENDADA
Westermeier, R. & Naven, T. (2002)
Proteomics in Practice: A
Laboratory Manual of Proteome
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