UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E EVOLUÇÃO

RELATÓRIO LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

AULA 6: QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS E SEPARAÇÃO DE
AMINOÁCIDOS UTILIZANDO CROMATOGRAFIA EM PAPEL

Discentes:
Grupo 4
Ana Caroline Reis de Camargo; RA: 770438
Caroline Santos de Oliveira; RA: 790987
Gabriela Siviero Erra; RA: 800807
Giovana Martins Campos Simioni; RA: 801049
Isabella Vitória Alonso; RA: 794824
Letícia Piazentin Dantas; RA: 791005
Natália Ribeiro Crispim; RA: 790706

Docentes:
Profa. Dra. Andrea S. da C. Fuentes
Prof. Dr. Iran Malavazi
São Carlos
2023
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................3
2. OBJETIVOS.....................................................................................................................5
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................5
3.1. Materiais.................................................................................................................. 5
3.1.1. Dosagem espectrofotométrica de proteína...................................................5
3.1.2. Cromatografia de aminoácidos em papel.................................................... 6
3.2. Métodos.................................................................................................................... 6
3.2.1. Dosagem espectrofotométrica de proteína...................................................6
3.2.1.1. Construção de curva de calibração..................................................... 6
3.2.1.2 Quantificação de amostra desconhecida.............................................. 8
3.2.2 Cromatografia de aminoácidos em papel..................................................... 8
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................................9
4.1 Dosagem espectrofotométrica de proteína.............................................................9
4.1.1. Construção de curva de calibração.............................................................. 9
4.1.2. Quantificação de amostra desconhecida.................................................... 12
4.2. Cromatografia de aminoácidos em papel........................................................... 13
4.3. Outras metodologias............................................................................................. 17
4.3.1. Método do Biureto....................................................................................... 17
4.3.2. Método do ácido Bicinconínico (BCA)....................................................... 18
4.3.3. Método de Bradford.................................................................................... 18
4.3.4. Espectrofotometria por luz UV...................................................................19
4.3.5. Método fluorimétrico...................................................................................20
4.3.6. Busca de uma sequência de proteína..........................................................21
5. CONCLUSÃO................................................................................................................ 21
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................22

2
1. INTRODUÇÃO
As proteínas são macromoléculas complexas compostas predominantemente por
átomos de carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e em sua grande maioria por
enxofre. Adicionalmente, algumas proteínas podem incorporar outros elementos como
fósforo, ferro, zinco e cobre. A organização tridimensional de uma proteína é altamente
estruturada, refletindo sua função biológica específica. Essa estrutura tridimensional se
manifesta em diferentes níveis, abrangendo os estágios primário, secundário, terciário e
quaternário. As proteínas exercem funções vitais em processos biológicos, desempenhando
papéis importantes como enzimas catalíticas, hormônios reguladores, neurotransmissores
de comunicação celular, transportadores facilitando a passagem através das membranas
celulares, entre outras atividades essenciais (Zaia et al., 1998).
A determinação precisa do conteúdo total de proteínas é uma etapa fundamental
em diversas aplicações, tanto na pesquisa em bioquímica quanto na prática rotineira de
laboratórios clínicos. Antes de se iniciar qualquer análise de proteínas, principalmente em
abordagens comparativas, é imperativo realizar uma quantificação precisa da quantidade
de proteína presente na amostra. Essa avaliação é essencial para garantir resultados
confiáveis e significativos nas investigações científicas e nos procedimentos clínicos
(Okutucu et al., 2007).
O método de Lowry, proposto originalmente por Wu em 1922, é amplamente
utilizado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, como
líquor, plasma sanguíneo, tecido animal e vegetal, suco biliar, membranas e produtos
alimentícios. O princípio do método baseia-se em um reagente conhecido como
Folin-Ciocalteau, composto por molibdato, tungstato e ácido fosfórico, que reage com
proteínas e é catalisado pelo cobre, resultando em um composto com absorção máxima em
750 nm. A redução ocorre através das cadeias laterais de aminoácidos ou pela retirada de
elétrons de unidades tetrapeptídicas em peptídeos e proteínas (Zaia et al., 1998). No
entanto, uma limitação desse método reside na influência das contribuições de
aminoácidos específicos, como tirosina e triptofano, no desenvolvimento da cor. Esses
aminoácidos específicos podem interferir no resultado do ensaio, destacando a necessidade
de considerar tais contribuições ao interpretar os dados obtidos por meio desse método
(Okutucu et al., 2007).
O termo cromatografia foi empregado pela primeira vez em 1906, pelo botânico
russo Mikhael Semenovich Tswett, para definir o processo utilizado para separar os
pigmentos presentes em folhas de plantas, sendo assim, o termo deriva-se do grego
3
“chrom” (cor) e “grape” (escrever). O processo de cromatografia é um método
físico-químico de separação de misturas, por meio da distribuição dos componentes da
mistura em duas fases que se comunicam entre si. Dessas fases, uma se move (fase móvel)
através da outra (fase estacionária), durante essa movimentação os componentes se
distribuem de forma seletiva entre as fases, fazendo com que ocorra uma migração
diferencial (Collins et al., 2010). Essa técnica se baseia no princípio de adsorção seletiva.
Os diferentes tipos de cromatografia podem ser classificados de acordo com o
mecanismo de separação utilizado e os tipos de fases envolvidas. A cromatografia em
papel é uma das mais clássicas, e pode ser utilizada para análise, separação e identificação
de antibióticos hidrossolúveis, aminoácidos, açúcares, pigmentos e íons (Ribeiro; Nunes,
2008). Para a realização da mesma, a amostra líquida percorre uma tira vertical de papel
adsorvente, onde seus componentes serão depositados em locais específicos. O papel é
composto por celulose, um polímero formado por várias unidades de glicose que possuem
hidroxilas, essa organização molecular das cadeias de celulose é polar, sendo assim, ela
possui diferentes regiões contendo altas e baixas densidades de elétrons.
Na cromatografia em papel, a separação de uma mistura de solutos pode depender
de diversos fatores como adsorção à superfície do papel, partição entre solventes ou então
troca iônica. Porém, estudos revelam que esse método é predominantemente definido pelo
mecanismo de partição líquido-líquido, ou seja, os componentes da mistura são segregados
pelas diferenças de solubilidade nas duas fases (estacionária e móvel) (Degani et al.,
1998). Em relação aos aminoácidos, a separação ocorre por meio da solubilidade que os
diferentes tipos desse componente apresentam pela água ao redor das fibras de celulose e
pela fase orgânica móvel que flui através das mesmas, sendo assim, a adsorção do
aminoácido pelo papel é diretamente proporcional à sua polaridade.
A partir de um conjunto específico de condições, cada molécula presente na
mistura irá se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase estacionária e se
posicionará a uma distância específica do ponto de origem quando o fluxo do solvente for
concluído. Tal fenômeno pode ser descrito por meio do fator de retenção (Rf), ilustrado na
figura 1.

Figura 1: Demonstração da dinâmica e cálculo envolvendo o fator de retenção da mistura em

cromatografia em papel.

4
 Fonte: Disponível em:
http://livresaber.sead.ufscar.br:8080/jspui/bitstream/123456789/1911/2/Unidade%203_Roteiro%20da%20aul
a%20pr%C3%A1tica_LuciaHelenaSeron_QE.pdf . Acesso em: 15 de novembro de 2023.

Um princípio importante envolvendo análises de processos cromatográficos é que

uma diferença de Rf é considerada um forte indicativo de que as amostras são diferentes,
enquanto que valores de Rf idênticos apenas sugerem a identidade dos compostos, tendo
em vista que diferentes estruturas podem apresentar os mesmos valores de Rf a partir de
um determinado conjunto de fatores.

2. OBJETIVOS
O experimento tem como objetivo aplicar o método de Lowry modificado para
quantificar proteínas em solução, estabelecendo uma curva de calibração e realizando a
quantificação de amostras. Ademais, visa avaliar e discutir conceitos essenciais de
separação de proteínas por cromatografia em papel.

3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
3.1.1. Dosagem espectrofotométrica de proteína
- Pipeta
a. 10 μL
b. 20 μL
c. 100 μL
d. 1000 μL
5
 - Albumina de soro bovino (BSA)
- Tubo Eppendorf 1,5 mL
- Agitador vórtex
- Reagente Folin-Ciocalteu (1:1)
- Solução de reação composta de soluções previamente preparadas
a. Solução estoque de Na2CO3 2% (preparação em NaOH 0,1 M)
b. Solução estoque de tartarato de sódio e potássio 1%
c. Solução estoque de CuSO4 1%
- Água destilada
- Espectrofotômetro

3.1.2. Cromatografia de aminoácidos em papel

- Folha de papel cromatográfico Whatman n° 1
- Palito de dente
- Tirosina
- Histidina
- Leucina
- Mistura de padrões (contém tirosina, histidina e leucina)
- Amostra desconhecida
- Cuba de corrida cromatográfica
- Solvente de Partridge previamente preparado (4:1:1)
a. N-butanol
b. Ácido acético glacial
c. Água
- Estufa
- Solução 0,5% de ninidrina em acetona
- Pinça
- Régua

3.2. Métodos
3.2.1. Dosagem espectrofotométrica de proteína
3.2.1.1. Construção de curva de calibração
Foram separados e rotulados 18 tubos modelo Eppendorf de 1,5 mL, onde foram
pipetadas diferentes quantidades de albumina de soro bovino (BSA) e de água destilada,
6
conjuntamente com o valor padrão de 1000 μL de solução de reação, que foi adicionado
utilizando uma pipeta de 1000 μL. Cada um dos tubos foi produzido em duplicata, sendo
assim, duas amostras para cada procedimento enumerado de 1 a 9. Para as diferentes
concentrações de BSA e água destilada, foram utilizadas diferentes pipetas, sendo elas, de
acordo com os respectivos procedimentos:
- Procedimento 1: 200 μL de água destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
- Procedimento 2: 25 μL de BSA, utilizando pipeta de 100 μL; 175 μL de água
destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
- Procedimento 3: 50 μL de BSA, utilizando pipeta de 100 μL; 150 μL de água
destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
- Procedimento 4: 75 μL de BSA, utilizando pipeta de 100 μL; 125 μL de água
destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
- Procedimento 5: 100 μL de BSA, utilizando pipeta de 100 μL; 100 μL de água
destilada, utilizando pipeta de 100 μL;
- Procedimento 6: 125 μL de BSA, utilizando pipeta de 1000 μL; 75 μL de água
destilada, utilizando pipeta de 100 μL;
- Procedimento 7: 150 μL de BSA, utilizando pipeta de 1000 μL; 50 μL de água
destilada, utilizando pipeta de 100 μL;
- Procedimento 8: 175 μL de BSA, utilizando pipeta de 1000 μL; 25 μL de água
destilada, utilizando pipeta de 100 μL;
- Procedimento 9: 200 μL de BSA, utilizando pipeta de 1000 μL.
Após completar a preparação, os 18 tubos preparados foram submetidos ao agitador
vórtex para homogeneizar a solução preparada. Ao finalizar a homogeneização, os tubos
foram incubados à temperatura ambiente por um período de 15 minutos.
Posteriormente, foram adicionados 100 μL do reagente Folin-Ciocalteu (1:1) em cada
um dos tubos, utilizando uma pipeta de 100 μL. As misturas foram homogeneizadas no
agitador vórtex novamente e foram deixadas em repouso, incubadas à temperatura ambiente
por um período de 30 minutos.
Ao final do tempo corrido, as amostras foram levadas ao espectrofotômetro, onde a
absorbância de todos os 18 tubos foram lidas, partindo dos tubos do procedimento 1 e
seguindo em ordem até os tubos do procedimento 9. As leituras foram realizadas no
comprimento de onda λ = 650 nm. Cada valor foi documentado, a fim de utilizar os dados
obtidos para produzir um gráfico de absorbância dos procedimentos utilizando uma média
entre os valores das duplicatas para cada procedimento.
7
 3.2.1.2 Quantificação de amostra desconhecida
Simultaneamente ao experimento apresentado anteriormente, foram preparados 8
tubos Eppendorf de 1,5 mL em 4 procedimentos distintos, contendo um valor padronizado de
1000 μL de solução de reação, pipetada com uma pipeta de 1000 μL, e diferentes quantidades
de uma amostra desconhecida e água destilada. Para o grupo controle, foram utilizados
mesmos tubos do procedimento 1, realizado anteriormente, que foi aplicado ao experimento
de quantificação de amostra desconhecida sob a denominação de procedimento 1. Todos os
procedimentos foram preparados em duplicata. Em relação ao conteúdo, as quantidades de
amostra desconhecida e água e as respectivas pipetas utilizadas foram:
- Procedimento 2: 5 μL de amostra desconhecida, utilizando pipeta de 10 μL; 195 μL de
água destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
- Procedimento 3: 10 μL de amostra desconhecida, utilizando pipeta de 10 μL; 190 μL
de água destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
- Procedimento 4: 20 μL de amostra desconhecida, utilizando pipeta de 20 μL; 180 μL
de água destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
- Procedimento 5: 50 μL de amostra desconhecida, utilizando pipeta de 100 μL; 150 μL
de água destilada, utilizando pipeta de 1000 μL;
Após a adição dos componentes da mistura, as amostras preparadas foram submetidas
à agitação em vórtex para homogeneização. Ao final da homogeneização, as amostras foram
deixadas em repouso, incubadas à temperatura ambiente por um período de 15 minutos.
Ao fim do período de incubação, foram adicionadas 100 μL de reagente
Folin-Ciocalteu (1:1) a todos os 8 tubos preparados, utilizando uma pipeta de 100 μL. Ao
final da adição do reagente, os tubos foram submetidos à agitação em vórtex para
homogeneização da mistura, sendo posteriormente deixados em repouso, incubados à
temperatura ambiente por um período de 30 minutos.
Por fim, os tubos foram levados ao espectrofotômetro, onde foram submetidos ao
comprimento de onda λ = 650 nm para leitura da absorbância. Todos os valores observados
foram documentados, para serem utilizados posteriormente para a produção do gráfico de
absorbância para cada um dos procedimentos, considerando a média entre os valores dos
experimentos em duplicata.

3.2.2 Cromatografia de aminoácidos em papel

Utilizando luvas, foi manuseada uma folha de papel cromatográfico Whatman nº 1,
onde foi traçado a lápis uma linha ao longo do comprimento menor, com uma margem de 1
8
cm da borda inferior, deixando uma margem de 1 cm de cada lado da folha. Sobre a linha
traçada anteriormente, foram marcados 5 pontos, enumerados de 1 a 5, a 1 cm de distância de
si e a 1 cm de distância das bordas laterais.
Com a ponta molhada de um palito de dentes, foram inseridos os padrões no papel
cromatográfico. As amostras foram aplicadas nos pontos de 1 a 5, respectivamente: 1.
tirosina; 2. histidina; 3. leucina; 4. mistura de tirosina, histidina e leucina; e 5. amostra
desconhecida. Para cada tratamento foi utilizado um palito de dentes diferente, evitando
contaminação. Cada tratamento foi aplicado, no ponto determinado, levemente e com uma
repetição de 4 vezes cada.
No papel, à borda oposta onde foram aplicadas as amostras, foi traçada uma linha a
2,5 cm de distância da borda, a fim de determinar o local onde seria realizada a dobra do
papel para o pendurar na cuba de corrida cromatográfica. Após determinar o local de dobra,
foram aplicados 25 mL de solvente de Partridge (n-butanol/ácido acético glacial/água 4:1:1)
na cuba de corrida, onde o papel foi pendurado, de maneira perfeitamente vertical.
A cuba foi, então, fechada por um período de tempo de aproximadamente 30 minutos,
permitindo que o solvente aplicado pudesse correr pelo papel por cerca de 10 cm de distância
do ponto inicial, a fim de obter melhores resultados. Após o solvente correr a distância
desejada, o papel foi removido da cuba e a linha de frente do solvente foi marcada com um
lápis. O papel foi seco na estufa.
Por fim, foi mergulhada a folha de papel em uma solução 0,5% de ninidrina em
acetona por um período de tempo de aproximadamente 1 minuto, para dar coloração aos
aminoácidos. O papel foi retirado do banho com o auxílio de uma pinça e retornado à estufa
em temperatura elevada (entre 80 ºC e 100 ºC) por alguns minutos, até que as manchas
aparecessem. Com um lápis, as manchas foram delimitadas para realizar posteriormente o
cálculo do fator de retenção (RF) dos padrões e da amostra desconhecida para comparar os
resultados com a tabela de aminoácidos fornecidos no roteiro de aula para a identificação do
aminoácido não identificado.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Dosagem espectrofotométrica de proteína
4.1.1. Construção de curva de calibração
A quantificação de proteínas foi realizada com amostras de albumina de soro
bovino (BSA) a partir do método de Lowry modificado. Após a realização do
procedimento conforme explicado no item 3.2.1.1, os dados obtidos na leitura das
9
amostras em espectrofotômetro estão demonstradas na tabela abaixo. É possível observar a
leitura realizada em duplicata técnica, ou seja, com duas amostras diferentes, preparadas
sob as mesmas condições.

Tabela 1. Dados obtidos para a construção da curva de calibração. Fonte: autoria própria.

Tubos µg BSA (na reação) Leituras Abs (650 nm)

1 0 - -
2 12,5 0,103 0,104
3 25 0,204 0,194
4 37,5 0,275 0,26
5 50 0,382 0,368
6 62,5 0,427 0,441
7 75 0,514 0,527
8 87,5 0,555 0,531
9 100 0,674 0,651

A partir destes dados, foi possível plotar um gráfico que demonstrasse a relação
entre a quantidade de massa de BSA (em µg) e o valor obtido no espectrofotômetro, a
partir de uma média ponderada do valor das duas leituras, como mostrado abaixo.

Gráfico 1. Curva padrão dos resultados obtidos pelo grupo 4.

10
 Além disso, construiu-se também, a fins de comparação, a curva de calibração com
todos os dados obtidos por todos os grupos envolvidos na prática, cujo resultado está
demonstrado a seguir.

Gráfico 2. Curva padrão dos resultados obtidos por todos os grupos.

É importante analisar a diferença dos valores de cada leitura. Existe variação entre
as duplicatas técnicas de cada amostra, mesmo que ambas tenham sido feitas sob as
mesmas condições, concomitantemente, e pelo mesmo manipulador. Este fator pode ser
explicado pelas variações de pipetagem, causadas pelo uso de pipetas diferentes e pela
falta de costume dos estudantes com este tipo de análise, que pode alterar os volumes no
momento das pipetagens, sendo este também a maior causa de diferenças de valores neste
tipo de experimento. Além disso, o uso de diferentes espectrofotômetros também podem
influenciar os resultados, visto que possuem tempos de uso e manutenção diferentes.
Apesar disto, os valores obtidos pelo grupo 4 estão dentro dos parâmetros
desejados, ou seja, são valores aceitáveis dentro da linearidade, em que espera-se valores
de absorbâncias entre 0,1 e 1. Além disso, a variação entre as duplicatas não foi tão
expressiva, e é possível observar na tabela 2 que o maior desvio padrão apresentado entre
ambas as amostras foi de 0,012.

11
 Tabela 2. Média aritmética dos valores das leituras e seu desvio padrão. Fonte: autoria própria.

Média de leituras Desvio Padrão

- -
0,1035 0,0005
0,199 0,005
0,2675 0,0075
0,375 0,007
0,434 0,007
0,5205 0,0065
0,543 0,012
0,6625 0,0115

Ademais, uma curva padrão aceitável deve possuir um coeficiente de correlação r²

acima de 0,98, e a curva construída pelo grupo obteve um r² = 0,989. Este parâmetro
demonstra que os dados estão dentro da aceitabilidade, a manipulação foi bem sucedida,
com poucas variações, e as medidas podem ser confiáveis.
Entretanto, ao observar o gráfico 2, que levou em consideração os valores de todos
os grupos, o r² apresenta um leve decaimento, correspondendo a 0,9838. Apesar de ser
uma diferença pouco expressiva, e ainda assim estar dentro do padrão aceitável, é evidente
que isto ocorre pela adição de mais dados obtidos por manipuladores diferentes, o que
aumenta a margem de erros entre cada pipetagem e entre o volume das reações.

4.1.2. Quantificação de amostra desconhecida

Uma vez que a amostra recebida não possuía uma concentração conhecida,
realizou-se o processo de quantificação para determiná-la, dentro da linearidade da curva.
Visto que a natureza e a concentração da amostra eram desconhecidas, utilizou-se
diferentes volumes para que fosse possível comparar os valores obtidos e analisar se suas
absorbâncias estavam dentro da linearidade padrão determinada na etapa anterior.
Desta forma, dadas as leituras também em duplicata técnica, determinou-se as
médias aritméticas dos valores, e com isto, a partir da equação da reta obtida
anteriormente pelo grupo, representada novamente abaixo, substituiu-se o X pelos valores
encontrados. Os dados estão demonstrados na tabela 3.

0,0768*x + 0,119 (equação 1)

12
 Tabela 3. Dados obtidos nas leituras das amostras desconhecidas. Fonte: autoria própria.

Tubos Amostra (µL) µg BSA (na reação) Leituras Abs

branco branco 0 - -
1 5 0,1221872 0,048 0,035
2 10 0,1236464 0,061 0,06
3 20 0,129176 0,135 0,13
4 50 0,142424 0,283 0,327

Por fim, calculou-se a concentração para cada uma dessas amostras, por meio da
razão entre a massa encontrada e o volume da amostra, como mostrado na tabela 4.

Tabela 4. Resultados da concentração da amostra desconhecida. Fonte: autoria própria.

µg BSA Amostra (µL) Concentração (µg/µL)

0,1221872 5 0,02443744
0,1236464 10 0,01236464
0,129176 20 0,0064588
0,142424 50 0,00284848

Assim, por meio da curva de calibração construída, determinou-se as

concentrações, e é possível perceber que os resultados foram muito abaixo dos valores da
amostra conhecida.

4.2. Cromatografia de aminoácidos em papel

A cromatografia realizada tinha como objetivo a qualificação e o fracionamento de
aminoácidos, foram aplicadas no papel cromatográfico cinco amostras, sendo a primeira
tirosina, e sequencialmente, histidina, leucina; uma amostra desconhecida foi aplicado no
quatro e, por último, um controle positivo, ou seja, uma mistura de padrões. Na fase móvel da
cromatografia, no qual é composta por uma solução líquida, teve uma distância percorrida de
8,2 cm. Como apresentado na imagem abaixo:

13
 Imagem 2: Fase móvel da cromatografia Fonte: autoria própria

O resultado após a fase estacionária está na imagem

Figura 3: Resultado da cromatografia Fonte:autoria própria

A amostra 1 apresentou um deslocamento considerável, já a amostra 2 não apresentou

nenhum movimento, diferentemente, da leucina, no qual teve um grande deslocamento. A
amostra desconhecida trouxe um resultado semelhante a junção dos aminoácidos leucina e
14
tirosina. E o controle positivo possuía todos os três aminoácidos numa mistura padrão. Os
resultados das distâncias percorridas pelos aminoácidos estão na tabela a seguir:

Tabela 5: resultados análiticos da cromatrografia

Amostras Distância percorrida (cm) Rf

1 3,5 0,427

2 0,6 0,073

3 5,5 0,671

4 5 0,609

5 0,6 e 5 0,073 e 0,609

A distância foi medida no centro da corrida das amostras. Já para calcular o Fator de
retenção (Rf) foi utilizado a seguinte equação:

Na primeira amostra a distância percorrida foi 3,5, assim segundo a equação temos:
Rf= 3,2 / 8,2= 0,427.
O mesmo procedimento foi realizado nas demais amostras, assim tivemos as seguintes
cálculos:
Amostra 2: Rf= 0,6/8,2= 0,073
Amostra 3: Rf= 5,5 / 8,2= 0,671
Amostra 4: Rf= 5 /8,2= 0,609
Amostra 5: Rf= 0,6/8,2= 0,073 e Rf: 5 /8,2= 0,609

Com base na tabela abaixo, no qual apresenta valores de Rf de alguns aminoácidos já

descritos na literatura.

15
Tabela 6: RF de aminoácidos determinados nas seguintes condições: solvente de Partridge, nbutanol / ácido
acético glacial / água (4:1:1), papel Wha Fonte: Roteiro da aula 3.

Destarte, conseguimos observar que a amostra 1, tanto pelo conhecimento da sua

composição e pelo seu valor de Rf, confirma-se que se trata do aminoácido tirosina. Na
segunda amostra temos o valor de 0,073, não tem valor exato da tabela x, visto que as
condições experimentais foram diferentes entre ambas as tabelas. Entretanto, o que se ressalta
é a proporcionalidade entre as amostras. Assim a amostra 3, dentre as conhecidas, tem o
maior Rf. Por fim a amostra 4, pode ser tanto a mistura de tirosina e leucina, quanto um novo
aminoácido.
Sabendo-se que os aminoácidos são constituídos por moléculas orgânicas compostas
por um grupo amino (NH2), uma carboxila (COOH), um átomo de hidrogênio (H) e uma
cadeia lateral ou radical (R). Os aminoácidos são categorizados com base na polaridade de
suas cadeias laterais em apolares (hidrofóbicos ou insolúveis em água), polares neutros
(hidrofílicos ou solúveis em água), polares com carga negativa (ácidos) e polares com carga
positiva (básicos). A polaridade refere-se à capacidade de um grupo químico formar polos
elétricos, permitindo que o grupo interaja com a água por meio de pontes de hidrogênio.
Os aminoácidos apolares são insolúveis em água devido à presença apenas de
hidrocarbonetos em suas cadeias laterais. A solubilidade em água dos aminoácidos polares
ocorre devido à presença de grupos polares, como OH, NH e C=O, em suas cadeias laterais,
que estabelecem pontes de hidrogênio com a água. Aqueles com carga positiva (básicos)
apresentam uma carga líquida positiva no pH 7,0, enquanto os aminoácidos com carga
negativa (ácidos) possuem uma carga líquida negativa nesse pH.
A tirosina é um aminoácido polar neutro, assim seu deslocamento no papel
cromatográfico foi considerável, entretanto, não tão grande. Já a leucina está classificada
como aminoácido apolar, por isso seu deslocamento foi significante, a histidina quase não
teve movimentação na fase móvel da cromatografia. Isso é justificado pela polaridade e
solubilidade do aminoácido, ou seja, quanto mais solúvel o aminoácido for na fase móvel de
natureza apolar, maior será sua migração no leito cromatográfico, afastando a amostra do
16
ponto de aplicação. Por outro lado, se o aminoácido for mais polar ou ionizado, ocorrerá
menos arraste pela fase móvel, resultando na proximidade da amostra com o ponto de
aplicação.

4.3. Outras metodologias

Diversos outros métodos para quantificação de proteínas também são amplamente
utilizados. Abaixo, estão descritos alguns destes métodos e suas principais vantagens e
aplicações, para efeitos comparativos.

4.3.1. Método do Biureto

O princípio do método de Biureto está baseado na reação do reagente de Biureto,
composto por uma mistura de sulfato de cobre, tartarato de sódio, potássio e hidróxido de
sódio. Em um ambiente alcalino, íons cúpricos interagem com peptídeos, formando um
complexo quadrado planar com dois nitrogênios das ligações peptídicas, resultando em
uma coloração violeta.
Para preparar o reagente, 1,50 g de sulfato de cobre e 6,00 g de tartarato de sódio
potássio são adicionados a um balão volumétrico, seguido pela adição de 500 ml de água
destilada e 300 ml de uma solução 10% de NaOH. Tubos de ensaio numerados são usados
para pipetar a albumina de soro bovino, variando de 0 ml a 1,0 ml. A água destilada é
adicionada para completar o volume, exceto no último tubo. Cada tubo recebe 4,0 ml do
reagente de Biureto, é agitado e incubado a 37ºC por 20 minutos. A coloração nos tubos
permanece estável por 1-2 horas. A absorbância é medida a 540 nm no espectrofotômetro,
e os dados são plotados em um gráfico de absorbância por micrograma de proteína.
É importante notar que o método de Biureto tem baixa sensibilidade na faixa de 0,5
mg/ml a 10,0 mg/ml. O método é suscetível a interferências de substâncias que afetam a
formação do complexo de cobre na solução, como amônio, Dextran-40 e 70, outros
peptídeos, aminoácidos livres, tampão Tris-HCl e glicose. Além disso, há interferentes na
absorção de luz a 540 nm, como bilirrubina, lipídios e Dextran-40 e 70, que podem
influenciar a leitura, sendo recomendada a precipitação das proteínas com ácido
tricloroacético e subsequente solubilização para eliminar interferências. Apesar da baixa
sensibilidade, o método de Biureto é indicado para determinar a concentração de proteínas
totais em plasma sanguíneo e em situações específicas.

17
 4.3.2. Método do ácido Bicinconínico (BCA)
O método do ácido bicinconínico (BCA), proposto por Smith e colaboradores, é
uma abordagem eficaz para a determinação da concentração de proteínas em amostras
biológicas. Esse método utiliza a reação de cobre (II) com proteínas em meio alcalino,
gerando cobre (I) e formando um complexo com o BCA, cuja absorbância é mensurada a
560 nm. Apesar de sua simplicidade no preparo de reagentes e da rápida obtenção de
resultados, o método do BCA apresenta algumas limitações.
A sensibilidade do método varia entre 20-2000 µg/mL, permitindo uma faixa
dinâmica adequada para a quantificação de proteínas em diferentes concentrações. No
entanto, interferentes potenciais podem influenciar negativamente nos resultados.
Substâncias que reagem com íons de cobre, como em reações de óxido-redução, formação
de complexos ou precipitação, e aquelas que interagem com o reativo de BCA, podem
causar interferência.
No procedimento experimental, são nomeados tubos e adicionados volumes
específicos de soluções estoque de albumina de soro bovino (BSA) e BCA. São realizadas
diluições seriadas para criar amostras com concentrações variadas de proteínas. A solução
do reagente, composta por reagente A (carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, BCA,
tartarato de sódio em hidróxido de sódio 0,1M) e reagente B (sulfato de cobre 4%), é
adicionada aos tubos, e a mistura é incubada por 30 minutos a 37ºC. Após a incubação, as
amostras são lidas no espectrofotômetro a 562 nm.
É importante destacar que o método do BCA utiliza íons de cobre nos
experimentos, tornando-o sensível a interferências. A presença de componentes como
açúcares, mercaptoetanol, dithiothreitol, vitamina C, paracetamol, lipídios e peróxido de
hidrogênio pode levar à redução do cobre II, resultando em falsos positivos. Além disso, o
EDTA pode formar complexos com o cobre, interferindo no procedimento. Portanto, uma
cuidadosa consideração desses interferentes é essencial para a confiabilidade dos
resultados obtidos pelo método do BCA.

4.3.3. Método de Bradford

O método de Bradford destaca-se como uma estratégia valiosa na quantificação de
proteínas totais, utilizando o corante "Coomassie brilliant blue" BG-250, e apresenta maior
vantagem em termos de eficácia e sensibilidade quando comparado ao método de Lowry.
Essa metodologia baseia-se na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas
proteicas que contêm aminoácidos com cadeias laterais básicas ou aromáticas. Em um pH
18
específico, a interação entre proteínas de elevado peso molecular e o corante BG-250
resultam no deslocamento do equilíbrio do corante para sua forma aniônica, resultando em
uma absorção pronunciada em 595 nm.
O protocolo experimental abrange a realização de diluições em série da solução de
proteína padrão BSA, a pipetagem de volumes conhecidos de proteína padrão e amostras
desconhecidas em tubos distintos, seguida pela adição de uma solução composta pelo
corante BG-250, ácido fosfórico e metanol. Após o período de incubação, as amostras são
analisadas em um espectrofotômetro a 595 nm, e os dados obtidos são utilizados para gerar
uma curva padrão.
Os interferentes no método de Bradford são menos numerosos quando comparados
ao método de Lowry, contudo, ainda apresentam desafios. Interferentes específicos, como
polifenóis, suas oxidases, ciclodextrinas, fluoreto, 2-mercaptoetanol com guanidina e
detergentes, incluindo o SDS, podem impactar a formação do complexo do corante com as
proteínas e interferir na absorção da amostra. Variações na absortividade específica para
diferentes proteínas, decorrentes de baixa solubilidade ou baixo peso molecular, podem
comprometer a precisão dos resultados. A pureza do corante BG-250 também pode variar,
exigindo a padronização das condições de reação para cada lote adquirido.

4.3.4. Espectrofotometria por luz UV

O método de luz UV se utiliza da absorção de proteínas na faixa entre 280 nm e
abaixo de 220 nm, proporcionando uma abordagem veloz e não invasiva para a
quantificação de proteínas, especialmente durante os estágios de purificação e separação.
A absorção a 280 nm está majoritariamente relacionada aos aminoácidos triptofano,
tirosina e cistina em um ambiente de pH neutro.
O procedimento experimental consiste na realização de diluições em série da
solução contendo a proteína padrão BSA, seguida pela pipetagem de volumes conhecidos
de proteína padrão e amostras desconhecidas em tubos distintos. Em seguida, é feita a
adição de uma solução composta pelo corante BG-250, ácido fosfórico e metanol. Após o
período de incubação, as amostras são submetidas à análise em um espectrofotômetro a
595 nm, e os dados obtidos são utilizados para criar uma curva padrão.
Embora apresente benefícios, como a preservação da integridade da amostra e a
agilidade do processo, o método de luz UV encontra limitações ao ser aplicado em
amostras complexas, uma vez que diversas substâncias podem absorver na faixa do
ultravioleta, comprometendo a confiabilidade dos resultados. Substâncias com bandas de
19
absorção na região de leitura tornam-se interferentes potenciais. Assim, a utilização
frequente deste método ocorre em fases de purificação de proteínas, onde uma avaliação
semiquantitativa é suficiente na maioria dos casos.
Além disso, é importante ressaltar que a espectrofotometria por luz UV não é
indicada para analisar amostras de extrato protéico bruto, pois interferentes, como lipídios,
podem aumentar a turbidez da amostra, resultando em leituras de absorbância superiores
aos valores reais. A técnica demonstra maior eficácia em amostras purificadas e
clarificadas, onde a concentração do soluto pode ser avaliada com maior precisão.
Essa metodologia segue a orientação da Lei de Beer-Lambert, também conhecida
como Lei de Absorção, que estabelece uma relação quantitativa entre a absorbância (A), a
concentração da substância absorvente (C), o caminho óptico (b) e o coeficiente de
extinção molar (ε). A Lei de Beer-Lambert é matematicamente expressa pela equação
A=ε⋅b⋅C, em que a absorbância (A) é uma medida adimensional. O coeficiente de
extinção molar (ε), expresso em L.mol-1.cm-1 , é uma propriedade específica da substância
absorvente, indicando sua eficiência na absorção de luz em um comprimento de onda
específico.
O caminho óptico (b), medido em centímetros, refere-se à distância que a luz
percorre através da amostra. A concentração (C) representa a quantidade de substância
absorvente por unidade de volume, expressa em mol.L−1. A combinação desses parâmetros
possibilita a quantificação da quantidade de luz absorvida pela substância em estudo. Essa
abordagem é particularmente valiosa em análises quantitativas, permitindo a determinação
de concentrações desconhecidas em amostras.Essa metodologia é orientada pela Lei de
Beer-Lambert, também conhecida como Lei de Absorção, que fornece uma relação
quantitativa entre a absorbância (A), a concentração da substância absorvente (C), o
caminho óptico (b) e o coeficiente de extinção molar (ε).

4.3.5. Método fluorimétrico

O método fluorimétrico utiliza a luz emitida por moléculas fluorogênicas para
avaliar a concentração de DNA e RNA. Marcadores fluorescentes, como o brometo de
etídio, permitem essa análise quando as concentrações são muito baixas para métodos
convencionais. O método emprega fluoróforos específicos para diferentes moléculas,
emitindo sinais fluorescentes quando se ligam a elas, e posteriormente, a intensidade da
fluorescência é medida, permitindo a quantificação. Entretanto, a escolha correta dos
reagentes é essencial para evitar resultados imprecisos
20
 Ao realizar esse procedimento, é essencial escolher cuidadosamente a molécula
apropriada, visto que algumas mencionadas na literatura como opções para triagem
emitem fluorescência naturalmente, de modo a apresentar resultados positivos incorretos.
Em contrapartida, moléculas que inibem a fluorescência têm o potencial de perturbar o
processo, levando a resultados negativos inadequados.

4.3.6. Busca de uma sequência de proteína

Por fim, entre as diversas outras ferramentas usadas na bioinformática para o
estudo de proteínas, através da ferramenta ProtParam, disponível em
http://web.expasy.org/protparam/, foi possível empregar a sequência de aminoácidos da
albumina humana como um exemplo ilustrativo do funcionamento dessa ferramenta. Essa
sequência foi obtida no banco de dados UniProt, que não apenas disponibilizou a
sequência de aminoácidos, mas também forneceu o código de acesso dessa proteína
(P02768). A plataforma oferece uma variedade de parâmetros relevantes, como a
contagem de aminoácidos, o peso molecular, a composição percentual de cada aminoácido
e a distribuição atômica. Adicionalmente, a ferramenta fornece o coeficiente de extinção
molar, cuja importância reside na quantificação precisa de proteínas usando a técnica de
espectrometria UV.

5. CONCLUSÃO
Como vem sendo discutido, a separação de proteínas pode ser feita por diferentes
métodos, a depender das características da proteína trabalhada e de quais as suas
exigências de acordo com a sua aplicação. As técnicas de cromatografia são amplamente
usadas para esta finalidade, e de forma geral, precisam de duas fases para ocorrer, a
estacionária e a móvel, de modo que a fase móvel flui através da estacionária, carreando as
moléculas de acordo com suas propriedades. Quanto à cromatografia em papel realizada na
aula prática, a posição atingida a partir do ponto de partida da corrida determina o
componente presente na mistura. Pode-se, então, concluir que o procedimento foi bem
sucedido, uma vez que foi possível observar claramente as bandas que surgiram e estimar
quais os aminoácidos encontrados.
Já a quantificação de proteínas, dentre as metodologias discutidas, o método de
Lowrey é um dos que apresenta maior reprodutibilidade, e portanto, pode ser conduzido
em diversas situações, para diversos objetivos. Neste caso, é necessária a construção de
uma curva de calibração para definir a melhor estimativa da concentração de proteínas
21
presentes na amostra. Ainda assim, este método é muito simples e possui baixo custo, de
modo a ser viável a sua utilização em rotinas laboratoriais.
Ao construir uma curva padrão, deve-se atentar para que as reações sejam
montadas sob as mesmas condições específicas, e sejam sempre manipuladas pela mesma
pessoa, e que esta tenha experiência com este tipo de pipetagem e análise, a fim de
diminuir a margem de erros e otimizar os resultados. Além disso, é importante que a
análise seja realizada em triplicata, a fim de se ter uma aproximação melhor do valor real
da amostra, e diminuir as chances de erros, uma vez que um possível desvio pode ser
identificado com mais facilidade em um número maior de reações.
Sendo assim, pode-se concluir que nas condições do experimento em aula, a curva
construída pelo grupo está dentro dos padrões esperados, e os desvios ocorreram devido a
erros de pipetagem ou possíveis interferências durante a manipulação da amostra e dos
equipamentos utilizados.
Quanto a cromatografia se mostrou eficiente e resultou em dados esperados,
mostrando, assim, a solubilidade e polaridade dos aminoácidos, além da fraccionação dos
compostos e a identificação de uma amostra desconhecida.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Campinas: Editora da Unicamp. 2010.

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KUTUCU, B. et al. Comparison of five methods for determination of total plasma protein
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ago. 2007. Elsevier BV.

RIBEIRO, N. M. & NUNES, C. R. Análise de pigmentos de pimentões por cromatografia em

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Solventes. Disponível em:
http://livresaber.sead.ufscar.br:8080/jspui/bitstream/123456789/1911/2/Unidade%203_Roteiro%20
da%20aula%20pr%C3%A1tica_LuciaHelenaSeron_QE.pdf. Acesso em: 15 de novembro de 2023.

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ZAIA, Dimas AM; ZAIA, Cássia Thaïs BV; LICHTIG, Jaim. Determinação de proteínas totais via
espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química nova, v. 21, p.
787-793, 1998.

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