INSTITUTO SUPERIOR POLITÉCNICO DA CAÁLA – ISPC

CURSO DE LICENCIATURA EM MEDICINA DENTÁRIA

2º ANO

204

TRABALHO EM GRUPO DE BIOLOGIA MOLECULAR

TÉCNICAS DE ESTUDO EM BIOLOGIA MOLECULAR

O/a Docente

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ESTEVÃO ALVES BOAVENTURA

HUAMBO/CAÁLA

2023/2024
 INTEGRANTES DO GRUPO Nº 2

1. ANTÓNIO DUMBO

2. AUGUSTO CAPUTO

3. DINÍS CAMBANGO

4. FÉLIX BONGUE

5. FELICIANO KANGALA

6. NÚRIA ANTÓNIO

7. REGINA MIRANDA

8. SAMUEL BINGO - BINGO

 SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1

OBEJCTIVO ............................................................................................................ 2

INTRODUÇÃO A BIOLOGIA MOLECULAR............................................................ 3

TÉCNICAS DE ESTUDO EM BIOLOGIA MOLECULAR ......................................... 3

CONCLUSÃO........................................................................................................ 12

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 13

 I. INTRODUÇÃO

A cárie dentária é uma doença de caráter multifatorial e a interação de fatores do

hospedeiro com microrganismos e dieta determinam sua manifestação. Apesar de
muitos esforços, a cárie dentária ainda é uma das lesões bucais mais comuns e
afeta, principalmente, jovens e crianças. Estabelecer a base genética para esta
doença fornecerá subsídios para o desenvolvimento de novas estratégias de
prevenção, diagnóstico, tratamento, avaliação de risco e compreensão de sua
patogênese.

Em 2003, foi publicada a sequência do genoma humano, feito este que marcou uma
nova era na ciência. Isso gerou novas informações que, combinadas com os
avanços na biologia molecular e nas tecnologias de informática, culminou com o
aparecimento de novas áreas de estudo, revolucionando abordagens terapêuticas
na área odontológica.

Atualmente, na era pós-genômica, sabe-se que apenas a obtenção da sequência

do DNA humano não fornece o conhecimto completo para uma revolução na
maneira de tratar e prevenir doenças. Os pesquisadores estão diante de novos
desafios, como entender a função, interação (gene/gene; gene/ambiente),
regulação do material genético e o papel destes fatores determinantes na doença e
na saúde das pessoas. Além disso, a biologia molecular tem sido usada para
identificar novas espécies bacterianas, auxiliando a definir seu papel na patogênese
da cárie dentária.

1
 II. OBJECTIVO GERAL

Conhecer e explicar de forma detalhada, as técnicas mais aplicadas para estudos

em biologia molecular.

2
 III. INTRODUÇÃO À BIOLOGIA MOLECULAR
3.1. DNA e Gene

O início da era da Genética se deu em 1865, quando o monge Gregor Johann

Mendel realizou experimentos de cruzamentos de ervilhas. Nascia, então, a
Genética Clássica e os conceitos de gene, fenótipo, genótipo e transmissão de
caracteres.

Em 1953, o americano James Watson e o inglês Francis Crick, dois cientistas da

Universidade de Cambridge na Inglaterra, revolucionaram mais uma vez a ciência,
quando propuseram o modelo da estrutura helicoidal do DNA. Watson e Crick
mostraram que a molécula de DNA era uma dupla hélice constituída de duas fitas
pareadas, mantidas juntas por ligações químicas fracas, conhecidas como pontes
de hidrogênio, cada uma com sua sequência de nucleotídeos - adenina, timina,
citosina e guanina, que podem ser referidas como A, T, C e G - complementar a
outra. Isto é, adenina pareia-se com timina e citosina, com guanina. A aceitação do
modelo de dupla hélice foi o ponto de partida para tentativas de esclarecer a
genética em nível molecular.

O nome DNA, ácido desoxirribonucleico, é dado pelo açúcar presente em sua

molécula, a desoxirribose. O DNA é um polímero formado por monômeros
chamados nucleotídeos. Estes, por sua vez, são compostos de um grupo fosfato,
um açúcar e uma base nitrogenada. O gene é uma determinada sequência de
nucleotídeos do DNA, que é responsável pela síntese de proteínas (enzimas).

IV. TÉCNICAS DE ESTUDO EM BIOLOGIA MOLECULAR

4.1. Extração de ácidos nucleicos

A obtenção do material genético, a partir de diversos tipos de materiais (como

sangue, tecidos, cultivos bacterianos, ectoparasitos, endoparasitos, leite e plantas),
é a primeira etapa a ser realizada e também a mais importante, pois, dependendo
da integridade e do grau de pureza das moléculas de DNA e RNA, podem ocorrer
alterações no resultado final da análise a ser realizada. A extração consiste

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basicamente em três etapas principais: o rompimento do envoltório celular, a
desproteinização e a recuperação do DNA/RNA.

O rompimento do envoltório celular pode ser feito por meio de métodos físicos, como
a abrasão física e o aquecimento, e, também, por métodos químicos, como a ação
enzimática (proteinase K) e os detergentes (SDS, CTAB).

A desproteinização é realizada, geralmente, por meio de solventes orgânicos, como

fenol tamponado ou fenol: clorofórmio. Consiste na remoção dos componentes
celulares ou outras substâncias utilizadas para que não haja interferência na técnica
a ser realizada. Nessa etapa serão formadas a fase aquosa e a fase orgânica no
microtubo. Na fase aquosa teremos o DNA ou RNA e, na orgânica, os restos
celulares e o resto de substâncias utilizadas na extração, como fenol, clorofórmio.

Na recuperação do material genético teremos a precipitação do DNA. Nessa etapa,

a precipitação ocorre, pois utilizamos o etanol absoluto ou o isopropanol gelado
associado a uma solução com alta concentração de um sal catiônico. Diversos
protocolos utilizam, além do etanol absoluto, o etanol 70% para realizar uma
segunda “lavagem” e, assim, retirar impurezas e sais que possam ter ficado na
amostra. Sendo assim, os álcoois, além de concentrar o DNA, ajudam a remover
resíduos de fenol e de clorofórmio que ficaram na amostra.

Após a precipitação e a remoção do álcool o DNA é ressuspenso em água ultrapura

ou tampão com pH adequado, no qual o volume a ser adicionado e o tampão
dependem do protocolo a ser utilizado. Para cada tipo de amostra, vários protocolos
podem ser testados, adaptados e otimizados, de maneira a se conseguir DNA de
boa qualidade.

4.1.1. Quantificação do DNA/RNA

Após a extração do material genético, é de suma importância a realização da

quantificação do material extraído para a verificação da integridade do material e da
sua concentração, utilizada no cálculo do volume de DNA/RNA que será adicionado
ao mix de PCR para a realização da análise. Essa etapa pode ser feita de três
formas: por meio de um equipamento com espectrofotometria, que analisa a

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quantidade de luz que é absorvida pelo DNA/RNA nos espectros de 260 e 280nm,
porém, não diferencia os ácidos nucleicos; por eletroforese em gel de agarose, um
método que utiliza o padrão de peso molecular na avaliação; e com a utilização do
fluorímetro, onde um material fluorescente se liga ao ácido nucleico. Além disso,
este último é um método muito interessante, visto que a presença de proteínas não
interfere na análise.

4.2. Reação da polimerase em cadeia (PCR)

A tecnologia da reação de polimerase em cadeia (PCR) foi concebida por Kary

Mullis em meados da década de 80. Desde sua concepção, esta tecnologia causou
uma verdadeira revolução na biologia, tanto na pesquisa visando o entendimento
de processos biológicos fundamentais, como nas áreas aplicadas, envolvendo
diagnósticos e melhoramento genético de plantas e animais domésticos.

PCR é uma técnica poderosa, que envolve a síntese enzimática in vitro de milhões
de cópias de um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA
polimerase. A reação de PCR se baseia no anelamento e extensão enzimática de
um par de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA de fita simples) utilizados
como iniciadores (primers), que delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da
amplificação. Estes primers são sintetizados artificialmente de maneira que suas
sequências de nucleotídeos sejam complementares às sequências específicas que
flanqueiam a região alvo.

Um ciclo de PCR envolve 3 etapas: desnaturação, anelamento e extensão. A fita

dupla do DNA alvo é desnaturada através da elevação da temperatura para 92 a
95° C. Na etapa de anelamento, a temperatura é rapidamente reduzida para 35 a
60° C, dependendo essencialmente do tamanho e sequência do “primer” utilizado,
permitindo a hibridização DNA-DNA de cada “primer” com as sequências
complementares que flanqueiam a região alvo. Em seguida, a temperatura é
elevada para 72°C para que a enzima taq DNA polimerase realize a extensão a
partir de cada terminal 3’ dos primers. Esta extensão envolve a adição de
nucleotídeos utilizando como molde a sequência alvo, de maneira que uma cópia
desta sequência é feita no processo. Este ciclo é repetido por algumas dezenas de

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vezes. Uma vez que a quantidade de DNA da sequência alvo dobra a cada ciclo, a
amplificação segue uma progressão geométrica de maneira que, depois de apenas
20 ciclos, são produzidos mais de um milhão de vezes a quantidade inicial de
sequência alvo. Esta escala de amplificação permite, portanto, iniciar com
quantidades mínimas de DNA (da ordem de alguns picogramas ou nanogramas) e
terminar a reação com grandes quantidades de DNA de uma sequência específica
de interesse.

Como mencionado, a PCR consiste na multiplicação in vitro de determinada região

do genoma de qualquer organismo, gerando milhões de cópias (TYRRELL, 1997).
Tal amplificação facilita a análise genética desta porção, favorecendo métodos de
detecção e diagnósticos baseados em ácidos nucleicos, com alta especificidade
(dada a análise de uma sequência nucleotídica específica e previamente conhecida
do genoma) e sensibilidade (já que um único fragmento da molécula original de DNA
é multiplicado exponencialmente, gerando milhões de cópias). Para tanto, o
princípio da técnica se baseia na reprodução do processo de replicação do genoma
que ocorre in vivo, se utilizando dos mesmos elementos essenciais que a célula
utiliza para a replicação da molécula de ácido nucleico.

Assim, os elementos básicos para a reação em cadeia da polimerase são:

A amostra de DNA extraído e purificado, que contenha o segmento a ser

amplificado, que está relacionada à fonte do material (qualquer tipo de
material biológico que contenha material celular, que conterá o genoma a ser
analisado).
Mistura de nucleotídeos (adenina, timina, guanina e citosina em suas formas
trifosfatadas livres – ou dNTPs (dATP, dTTP, dGTP e dCTP,
respectivamente) - em concentrações iguais, que serão inseridos nas novas
cópias de DNA replicadas.
Enzima Taq polimerase, enzima termoestável responsável pela síntese das
novas fitas;
Cloreto de magnésio, que serve como cofator para a enzima.

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 Par de iniciadores – ou primers – que são fragmentos de DNA sintetizados
em laboratório, contendo sequências conhecidas que flanqueiem a região
desejada, em ambos os sentidos da fita-alvo e, assim, delimitem a região de
replicação. O tamanho ideal de um primer é de 18 a 30 bases, não devendo
ser menor que 15, pelo risco de comprometer a especificidade do
anelamento.

Após a devida extração, purificação e quantificação do DNA a partir da amostra

original analisada, é preparada a mistura de reação – ou mix – contendo os
elementos acima descritos. A mistura deve ser preparada com os tubos em estante
resfriada, dentro de fluxo laminar, em uma sala especial, na qual não deve entrar
qualquer tipo de amostra contendo DNA, extraído ou não (para evitar a
contaminação do ambiente, dos reagentes, e dos equipamentos utilizados). A
mistura deve ser preparada de acordo com protocolo previamente estabelecido, e
os cálculos de quantidades e concentrações dos reagentes de acordo com o
número de amostras devem estar prontos de antemão.

4.2.1. Variações da PCR

PCR multiplex

A PCR multiplex é especialmente útil em estudos epidemiológicos, ou em ensaios

que visem à diferenciação entre variantes de uma mesma espécie. Este modo utiliza
dois ou mais pares de primers, em uma mesma reação. Os diferentes pares de
primers terão como alvo regiões distintas do genoma, únicas e específicas para
cada variante analisada, e devem gerar produtos de tamanhos moleculares distintos
(de modo que não se confundam na visualização após a eletroforese), gerando
padrões únicos e permitindo sua diferenciação. Exemplos de uso: Escherichia coli,
Corynebacterium pseudotuberculosis e Microsporum spp.

Nested-PCR

A PCR convencional, que utiliza apenas um par de primers, pode gerar centenas de
milhões de cópias com especificidade considerável, como já mencionado.
Entretanto, ainda assim, é possível que, em meio a tantas replicações e cópias, uma

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parte não desejada do genoma seja amplificada, comprometendo a qualidade do
produto final. Isto se dá, principalmente, quando a sequência alvo é curta, e o primer
se anela a sequências similares na fita inicial, dado que a especificidade da reação
é definida pela especificidade do primer. A nested-PCR é uma variação da PCR
convencional, com a finalidade de aumentar a sensibilidade e especificidade da
reação e, assim, mitigar esta possibilidade de erro. Nessa modalidade são
necessários dois pares de primers, um para cada etapa do processo. Na primeira
etapa, o primeiro par de primers (primers externos) amplificam uma sequência
extensa, com um número conhecido de pares de bases. O segundo par (primers
internos), que caracteriza a técnica, tem como alvo uma região dentro do produto
do primeiro par, produzindo, por sua vez, um produto menor. Assim, se a primeira
região a ser amplificada não for a desejada, a chance do segundo par gerar um
produto é muito menor.

PCR em Tempo Real

A PCR em tempo real (ou qPCR) permite que a reação seja monitorada em tempo
real (sem necessidade da eletroforese), bem como que a quantidade de ácido
nucleico produzida seja quantificada, por meio da emissão e da captação de
radiação fluorescente durante o processo. Para tanto, a qPCR utiliza um
termociclador com um sistema óptico de captação da emissão de luz fluorescente,
associado a um computador com um software que analisa e processa os dados
durante e ao final da reação. Além disso, a qPCR utiliza um sistema de sondas de
fluorescência, de modo que a quantidade de material gerado é diretamente
proporcional à emissão de fluorescência, que pode ser quantificada com notável
precisão.

Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição (Restriction-

Fragment Length Polymorphism) – RFLP

A técnica do Polimorfismo do Comprimento dos Fragmentos de Restrição

(Restriction-Fragment Length Polymorphism – RFLP) consiste na submissão prévia
do DNA amostral a um conjunto de enzimas de restrição (que vão clivar a molécula
de DNA em pontos específicos através do reconhecimento de sequências

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específicas de nucleotídeos), e posterior eletroforese. O RFLP permite diferenciar
indivíduos pelo polimorfismo genético (diferenças genéticas herdadas entre
indivíduos, com determinada incidência na população). A técnica explora essas
diferenças, permitindo diferenciação intra e interspecies

Amplificação Alelo Oligonucleotídeos-Específica (PCR- -ASO)

A PCR-ASO (Allele Specific Oligonucleotide Amplification) é uma adaptação da

PCR e também é conhecida como ARMS (Amplification Refractory Mutation
System). É um sistema que permite análise direta de qualquer lócus genético de
interesse e pode ser aplicado para detecção de mutações genéticas de forma
simples, rápida, confiável e de baixo custo.

DNA polimórfico aleatoriamente amplificado (Random Amplified Polymorphic

DNA) - RAPD

A PCR convencional apresenta um fator limitante que pode ser crítico em alguns
casos: é necessário o conhecimento prévio das sequências de nucleotídeos que
flanqueiam a região-alvo, para a confecção dos primers. No início da década de
1990 foi desenvolvida a RAPD (DNA polimórfico aleatoriamente amplificado –
Random Amplified Polymorphic DNA), com o objetivo de contornar a necessidade
do conhecimento prévio da sequência, possibilitando o uso da técnica em
organismos sobre os quais se tinha pouco ou nenhum conhecimento sobre o seu
genoma. No RAPD, se utiliza apenas um primer de sequência arbitrária, além de
uma temperatura de anelamento mais baixa que a da PCR convencional. Isso faz
com que a especificidade da reação diminua, de forma que um número maior de
fragmentos reprodutíveis possa ser amplificado, de diferentes regiões do DNA alvo.
Então, a amplificação ocorrerá em função da probabilidade de, após a desnaturação
da dupla-fita, existir em algum lugar do genoma uma sequência exatamente
complementar à do primer em uma das fitas, e a uma distância que possa ser
percorrida pela polimerase, outra sequência também complementar a este primer
na fita oposta. Quanto mais complexo o genoma analisado, maior a chance de a
técnica funcionar. Por outro lado, pode não ocorrer o anelamento do primer com o
DNA, com ausência de bandas na eletroforese. Devido ao fato de vários

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oligonucleotídeos curtos poderem servir como “primers” dentro dessas condições,
é possível montar um painel de candidatos a primers universais, de modo que
possam detectar polimorfismos (principal objetivo do RAPD) diretamente, em
praticamente qualquer organismo biológico. Exemplos de uso: estudos de
mapeamento gênico, genética de populações e taxonomia molecular.

Microarrays (microarranjos de DNA)

Nesta técnica, os fragmentos de genes são fixados em lâmina de vidro ou

membranas de nylon, conhecido também como bioship ou ship biológico. Uma
imagem da hibridização é gerada por meio de leitores a laser ou leitores de fósforo.
Tem como finalidade medir níveis de expressão de genes transcritos em larga
escala, ou seja, esta técnica analisa o perfil do transcriptoma. Por causa da alta
performance desta técnica, é possível avaliar a expressão diferencial de milhares
de genes em somente um experimento.

Checkerboard DNA-DNA hybridization

É uma técnica da biologia molecular, que verifica o grau de similaridade genética

em sequências de DNA e é usado para verificar a distância genética de duas
espécies bacterianas. É muito utilizado em estudos sobre patologias periodontais
ou para verificação de bactérias do biofilme dental.

4.3. Eletroforese em gel

A eletroforese em gel é uma técnica bioquímica para separação de moléculas com

base na sua carga elétrica e peso molecular. A separação de partículas utilizando
a carga elétrica foi proposta por Tiselius em 1937, mas só foi aplicada para
separação de DNA em meados dos anos 60 por Vin Thorne.

Eletroforese é utilizada para visualizar fragmentos de DNA que são produzidos pela
digestão com enzimas de restrição. Em uma matriz feita de agarose ou
poliacrilamida, os DNAs, quando submetidos a um campo elétrico, em pH neutro,
são atraídos para o polo positivo (ânodo) e repelidas do polo negativo (cátodo). Os
fragmentos menores de DNA podem mover-se pela matriz com mais facilidade do

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que os maiores e, ao final, alcançarão distâncias maiores em relação à origem,
quando comparados aos fragmentos maiores. A matriz de agarose possui tamanho
de poros que separam fragmentos de 200pb a até 50kb, uma vez ajustada a
concentração do gel. A poliacrilamida permite a separação de fragmentos menores
de DNA até 1.100pb, ou até mesmo, distinguir fragmentos de DNA com diferenças
de até um par de base. Após a separação em matriz de agarose, o DNA pode ser
corado com brometo de etídio e ser visualizado sob luz ultravioleta (UV). As
moléculas do brometo de etídio se intercalam entre os nucleotídeos na dupla hélice
do DNA, o que permite a visualização dos fragmentos de DNA na matriz. Além do
DNA a ser analisado, também é colocado um marcador de peso molecular que
servirá como ponto de referência, pois forma fragmentos em pontos específicos e
de tamanho diferentes. Normalmente o marcador usado é o DNA do fago lambda,
digerido com uma enzima de restrição HindIII.

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 V. CONCLUSÃO

A cárie dentária continua sendo uma doença muito prevalente na população

mundial, mas que pode ser prevenida ou controlada. Os avanços na biologia
molecular e nas tecnologias geradas nos últimos anos permitiram que novas
abordagens acerca desta e de outras doenças bucais fossem utilizadas.

Ainda que esta tecnologia seja cara e pouco acessível, é importante que o cirurgião-
dentista esteja atualizado quanto às alternativas de métodos de diagnóstico
existentes atualmente. Poder saber se o seu paciente tem uma predisposição
genética a desenvolver cárie dentária, problemas periodontais ou reabsorções
radiculares, a partir do DNA das células da mucosa epitelial da boca, é de grande
valia no cotidiano do consultório.

Como dentistas, é possível notar que a minoria dos pacientes é livre da doença
cárie. Quando examinados mais detalhadamente, fica evidente que estes têm os
mesmos padrões e as mesmas práticas de higiene bucal que os pacientes com
presença desta doença. Existem ainda pacientes que apresentam fortes fatores de
risco para o desenvolvimento da doença periodontal, como o fumo, má higiene
bucal, acúmulo de cálculo gengival e trauma oclusal, embora estejam livres desta
doença. Fica claro que, nestes casos excepcionais, alguns elementos devem
participar nessa resistência contra estas determinadas doenças.

Num futuro, talvez não tão distante, seja possível que nós, profissionais da
odontologia, tenhamos contato com uma realidade completamente nova. Em
algumas décadas, diferenças nos métodos e materiais utilizados nos tratamentos
irão surgir. Dentistas serão capazes de aplicar técnicas de engenharia genética que
estimulem a reparação do próprio corpo. Por exemplo, durante um tratamento
endodôntico, os dentistas poderão aplicar células geneticamente desenvolvidas do
tecido pulpar dentro do canal, a fim de que estas se multipliquem e deem origem a
um novo tecido pulpar. Também será possível a existência de dentes de proveta,
ou seja, dentes feitos em laboratório.

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 REFERÊNCIAS BIBLIOGÁFICAS

Manual de técnicas em biologia molecular (Laboratório de Epidemiologia Molecular,

Departamento de Saúde Coletiva Veterinária e Saúde Pública, Faculdade de
Veterinária, Universidade Federal Fluminense Autores: Elmiro Rosendo do
Nascimento, Nathalie Costa da Cunha, Virgínia Léo de Almeida Pereira, Leandro
dos Santos Machado e Dayse Lima da Costa de Abreu).

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